Здесь мы представляем протокол для построения трехмерной модели in vitro слизистой оболочки брюшинной полости, состоящей из первичных мезотелиальных клеток человека и фибробластов, покрытых внеклеточным матриксом, в качестве инструмента для исследования адгезии, инвазии и пролиферации клеток рака яичников.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Моделирование ранних стадиях рака яичников распространение в качестве Органотипической культуры человека брюшную полость
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Характер метастазирования рака яичников заметно отличается от большинства других эпителиальных опухолей, потому что он редко распространяется гематогенным путем. Вместо этого раковые клетки яичников, отслоившиеся от первичной опухоли, переносятся перитонеальной жидкостью к метастатическим участкам в брюшной полости. Эти участки, в первую очередь брюшная брюшина и сальник, являются органами, покрытыми поверхностью, выстланной мезотелием. Для исследования процессов диссеминации рака яичников мы собрали сложную трехмерную культуральную систему, которая реконструирует слизистую оболочку брюшинной полости in vitro. Первичные фибробласты и мезотелиальные клетки человека были выделены из сальника человека. Затем фибробласты смешивали с внеклеточным матриксом и покрывали слоем первичных мезотелиальных клеток человека, чтобы имитировать перитонеальные и сальниковые поверхности, с которыми сталкиваются метастазирующие клетки рака яичников. Полученная органотипическая модель, как показано, используется для изучения ранних этапов диссеминации рака яичников, включая адгезию, инвазию и пролиферацию раковых клеток. Эта модель была использована в ряде исследований для изучения роли микроокружения (клеточного и аклелюлярного) в ранней диссеминации рака яичников. Он также был успешно адаптирован для высокопроизводительного скрининга и используется для выявления и тестирования ингибиторов метастазирования рака яичников.
Введение
Рак яичников является самым смертоносным гинекологическим злокачественным новообразованием1. У большинства пациентов диагноз ставится после того, как рак распространился по всей брюшной полости. После того, как рак распространился по всей брюшной полости, циторедуктивная хирургия и химиотерапия часто не являются достаточным лечением для предотвращения рецидива рака и химиорезистентности, что приводит к менее чем 30% 5-летней выживаемости. Метастазирование рака яичников преимущественно ограничено брюшной полостью, а некоторые другие типы рака, включая рак желудка, поджелудочной железы и толстой кишки, метастазируют в те же анатомические участки брюшинной пол....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы исследований, описанные были рассмотрены в Чикагском университете Institutional Review Board (IRB). Информированное согласие было получено от каждого пациента до операции и исследования был одобрен в Чикагском университете IRB. Биологическая безопасность типов корпус 2 и перчатки должны быть использованы при обращении человеческую ткань для защиты и снижения риска контаминации клеток.
1. Выделение и культуры первичных стромальных клеток нетрансформированных
- Коллекция тканей человека и подготовка.
- Получение образцов человеческого сальника, 2 см 3, удалены во время операции на брюшной полости, и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Органотипической культура была собрана, сначала смешивая первичные фибробласты человека с коллагеном I типа, а затем наложение эту культуру с 5-кратным количеством мезотелиальных клеток. Культуру инкубировали в течение не менее 18 ч, прежде чем клеток рака яичников были добавлены для изучения адгезии, инвазии или пролиферации. Каждый анализ был повторен с несколькими (N = 3-5) 3D культуры, полученные из разных пациентов и многочисленных скважин были протестированы в каждом условии для адгезии (N = 5), пролиферации (N = .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Органотипической модель перитонеального микросреды был создан для оценки индивидуальной и коллективной функции (ы) как через сотовые и врожденных компонентов микроокружения яичников распространения рака. Конкретные протоколы для гальванических и настройки органотипической культуру 3D исследовать яичников адгезии клеток рака, пролиферации и вторжение предоставляются. Первичные человеческие клетки сальника мезотелиальные и фибробласты были выделены от больных и использовать на ранних прохождения сохранить нормальную морфо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим всех ординаторов и лечащих врачей, особенно доктора А.Ф. Хейни (Чикагский университет, факультет акушерства и гинекологии) за сбор биопсии сальника. Кроме того, мы благодарим Стейси Тобин и Гейл Айзенберг за тщательное редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Bears Care, благотворительным бенефициаром футбольного клуба Chicago Bears, Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) R21 NS075702 и грантом Национального института рака R01 CA111882 для E.L.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильный>1. Выделение и культивирование первичных клеток | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Лезвия бритвы однолезвийные | Fisher | Scientific 12-640 | |
| 15 см тарелки для культивирования | BD Biosciences | 353025 | |
| Стеклянная колба | ? | ? | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM с L-глутамином | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Заменимые аминокислоты | Corning | 25-025-CI | |
| Пенициллин-стрептомицин | Corning | 30-002-CI | |
| Шейкер | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5702 | |
| Инкубатор | Thermo-Fisher | Forma Series II Инкубатор CO2 с водяной рубашкой Модель 3100 | |
| Трипсин ЭДТА, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Гиалуронидаза | Уортингтон Биохимический | LS002592 | |
| T-75 Колбы | BD Biosciences | ||
| Колбы T-175 Наконечники | BD Biosciences | 353112 | |
| Пипетки | Rainin | P2, P10, P20, P200 и P1000 | |
| Наконечники для пипеток | Corning | Фильтрованные наконечники P2, P10, P20, P200 и P1000 | |
| Наименование реагента/оборудования | Company | >Номер в каталоге | Комментарии/Описание |
| 2. Покрытие 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Камера для подсчета клеток | Invitrogen | C10313 | |
| Трипановый синий краситель (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Коллаген I типа I (крысиный хвост) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 луночный планшет, прозрачное дно, черный | BD Biosciences | 353219 | |
| Название реагента/оборудования | Company | Номер в каталоге | Комментарии/Описание |
| 3. Анализ адгезии | |||
| Многоканальный пипетка | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Раствор параформальдегида 4% в PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Планшетный считыватель | Молекулярные устройства | Minimax | |
| Наименование реагента/оборудования | Company | Каталожный номер | Комментарии/Описание |
| >5. Инвазионный анализ | |||
| Вставки для клеточных культур (8 мкм, 24 лунки) | BD Biosciences | 353097 | |
| ватные палочки | ватные палочки | палочки | |
| микроскоп | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | общественное достояние | ||
| 24-луночный планшет | BD Biosciences | 353047 | |
| Название реагента/Оборудования | Company | Номер в каталоге | Комментарии/Описание |
| 6. Антитела | |||
| Анти-Интегрин &альфа; Vβ 3 Антитело, клон LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
Ссылки
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
