Повышение чувствительности, обеспечиваемое динамической поляризацией ядер (DNP) растворения, позволяет отслеживать метаболические процессы в режиме реального времени с помощью ЯМР и МРТ. Обсуждаются характеристики и производительность специальной установки для растворения DNP, предназначенной для исследования ферментативных реакций.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Растворение динамическая поляризация ядер Инструментарий в реальном времени ферментативной реакции Стоимость Измерения с помощью ЯМР
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Основным ограничением ЯМР основе исследований является низкая чувствительность. Это побуждает течение долгого времени приобретения, тем самым предотвращая измерений методом ЯМР в режиме реального времени метаболических превращений. Гиперполяризация помощью растворения DNP обходит часть чувствительности выдает благодаря большому нестандартного равновесия ядерной намагниченности, вытекающих из передачи спиновой поляризации электрона и ядра. Высокого ЯМР сигнал, полученный могут быть использованы для мониторинга химических реакций в реальном времени. Недостатком гиперполяризованным ЯМР находится в ограниченном временном окне доступных для обнаружения сигнала, которая обычно составляет порядка ядерной спин продольной постоянной времени релаксации, T 1, или, в благоприятных случаях, порядка постоянной времени релаксации, связанной с синглетная сопряженных ядер, Т LLS. Сотовый поглощение эндогенных молекул и скоростей метаболических может оказать существенную информацию о развитии опухоли и ответ наркотиков. Nuполненных ранее многочисленных Гиперпол ризованные ЯМР исследования продемонстрировали релевантность пирувата как метаболический субстрат для мониторинга ферментативную активность в естественных условиях. Эта работа содержит подробное описание экспериментальной установки и методов, необходимых для изучения ферментативных реакций, в частности скорость пируват-к-лактата преобразования в присутствии лактатдегидрогеназы (ЛДГ), по гиперполяризованным ЯМР.
Введение
Динамическая поляризация ядер (DNP), 1,2 методика предназначена для повышения спиновой поляризации ядерной, т.е. дисбаланс между «вверх» и «вниз» населенностей спиновых (P = [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), была впервые введена в 1950-х годах. Ядерные спины, такие как 13 C могут быть поляризованы до P = 10 -1 в благоприятных условиях, как правило, при температуре порядка 1 К и в магнитном поле 3,357 Т. 3,4 Прорыв для биологических применений пришел в начале 2000-х с развитием растворения DNP который состоит в растворении за....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Все анализ данных проводили с использованием коммерческого программного обеспечения.
1. Подготовьте поляризационный решение
- Подготовьте 2 мл 1,12 М 13 С-меченого пирувата натрия (Na + [CH 3 -СО- 13 COO] -, субстрат) раствор легированный 33 мМ TEMPOL радикальной (4-гидрокси-2,2,6,6- тетраметилпиперидин-1-оксид, поляризационная агент) 4 в 2: 1 д 2 O / д 6 этанол в течение 13 C наблюдений. ВНИМАНИЕ: Меры предосторожности должны быть приняты в связи с горючей природы д 6 этанол.
- Убедитесь, что концентрация радикалов являет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
прирост сигнала ЯМР с использованием растворения ДНП
Эффект DNP состоит в передаче высокой поляризации непарных спинов электронов, обычно от стабильных радикалов молекул, к ЯМР-активных ядер, в условиях микроволнового облучения образца. Наиболее часто используемые свободные радикалы Там (OXO63) и TEMPOL. 4 процедуры Поляризационные использованием TEMPOL можно оптимизировать путем "кросс-поляризации '. 25
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические точки растворения DNP ЯМР эксперимента: (я) уровень поляризации достигается при подложки, которая определяет самую низкую концентрацию продукта, необходимого для экспериментов, а также ряд приобретений сигналов, которые могут быть выполнены и (II) времен жизни намагниченности, по сравнению с длительностью передачи между поляризацией и сайты обнаружения и к скорости трансформации субстрата. Система впрыска от установки DNP растворения, описанного здесь позволяет передавать пробы в качестве лишь 3-4 сек. Хотя .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не конкурируют финансовые интересы
Благодарности
Авторы благодарят доктора JJ ван дер Klink за помощь в выборе и монтаже оборудования, а также д-ра Ф. Катеб и д-ра Г. Bertho за полезные обсуждения. AC была поддержана Национальным научным фондом Швейцарии (грант PPOOP2_157547). Мы признаем финансирование из Парижской Сорбонны Сите (ЯМР @ Com, DIM Analytics, мэрии Парижа, в Fondation де ла Recherche MEDICALE (FRM ING20130526708), и Parteneriat Hubert Кюрьен Бранкузи 32662QK. Наша команда является частью Equipex программ Париж-ан-резонансной и CACSICE.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Поляризатор DNP | Vanderklink s.a.r.l (Швейцария) | Криостат и электронное оборудование для поляризации образцов | |
| Компоненты вакуумных систем | Edwards vacuum (Франция) | Различные | - турбомолекулярные насосные установки - мембранные насосные установки - высокопроизводительная насосная система Рутса - вакуумные фитинги и компоненты |
| DNP 3.35T Magnet | Bruker (Франция)ЯМР-спектрометр | ||
| 500 МГц | Bruker (Франция) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (США) | Программное обеспечение для анализа данных | |
| Chemicals | |||
| SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C | Sigma Aldrich (France) | 490709 | |
| ЭТАНОЛ-D6, БЕЗВОДНЫЙ, 99,5 % ATOM D | Сигма Олдрич (Франция) | 186414 | |
| 4-Гидрокси-ТЕМПО 97% | Сигма Олдрич (Франция | )176141 | |
| оксид дейтерия | Сигма Олдрич (Франция) | 151882 | |
| восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) | Сигма Олдрич (Франция) | ||
| этилен-диаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Сигма Олдрич (Франция) | ||
| дитиотреитол (ДТТ) | Сигма Олдрич (Франция) | ||
| фосфатный буфер, pH = 7.0 | Sigma Aldrich (Франция) | ||
| Фермент ЛДГ в | Sigma Aldrich (Франция) | L-2500 | |
| бычий сывороточный альбумин, BSA | Sigma Aldrich (Франция) |
Ссылки
- Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
- Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).
- Wolber, J., Ellner, F., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
