Лабораторное производство эукариотических белков с соответствующей посттрансляционной модификацией представляет собой значительный барьер. Вот надежный протокол с быстрым установлением и оборотом экспрессии белка с использованием системы экспрессии млекопитающих. Эта система поддерживает селективное мечение аминокислот, селективное мечение белков и низкомолекулярные модуляторы гликанового состава.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Искусство получения рекомбинантных белков со сложными пост-трансляционных модификаций представляет собой серьезную проблему для исследований структуры и функции. Быстрое создание и высокое извлечение из временно трансфецированных клеточных линий млекопитающих обращается этот барьер и является эффективным средством выражения белки, которые, естественно, направлен через ER и Гольджи-опосредованной секреторной пути. Вот один протокол для экспрессии белка с использованием человеческого и HEK293F HEK293S клеточные линии, трансфицированные экспрессирующий вектор млекопитающего, предназначенный для высоких урожаев белка. Применимость этой системы продемонстрировали с помощью трех представительных гликопротеинов, которые выразили при урожайности между 95-120 мг очищенного белка восстановленного на литр культуры. Эти белки являются человеческий FcγRIIIa и крыс α2-6 сиалилтрансферазу, ST6GalI, как выражается с N-концевой GFP слияния, а также немодифицированного человеческого иммуноглобулина G1 Fc. Это надежные системы ИМПlizes бессывороточной среды, что является гибкой для выражения изотопно обогащенных белков и углеводов для структурных исследований с использованием масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Кроме того, в состав N-гликанов может быть настроена путем добавления небольшого молекулу, чтобы предотвратить определенные модификации гликанов таким образом, чтобы не уменьшить выход.
Введение
Производство высокие урожаи соответствующим сложенными и посттрансляционно модифицированных белков человека для детального анализа структуры и функции остается серьезной проблемой. Большое количество систем экспрессии доступны, которые производят рекомбинантные белки с нативной как функции и поведение. Бактериальные системы экспрессии, преимущественно кишечной палочки штамма, представляют собой наиболее доступных и широко используемых инструментов в научно-исследовательской сфере, в связи с простотой этих систем экспрессии, хотя дрожжи, растения, насекомых и млекопитающих систем также описаны 1-4. Тем не менее, большинство из этих систем не способ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол является достаточным для выражения с использованием либо HEK293F или HEK293S клетки.
1. Создание сотовый
- Культура Прививка
Примечание: Все процедуры манипулирования культуры должно осуществляться в BSL-2 объекта, и каждый пункт принес в кабинет биобезопасности должны быть стерилизованы путем распыления с 70% этанола в водном растворе.- Используйте инкубатор шейкер при 135 оборотах в минуту, 80% влажности и при 8,0% CO 2 и 37 ° С. Включите "на" УФ лампы шкафа биобезопасности, по меньшей мере 1 ч до начала работы. Prewarm запечатанные среды А и B средний бутылки в водяной бане при 37 ° С в течение 1 часа. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспрессия белка высокого уровня и чистоты
Эта оптимизированная система экспрессии генерируется высокий выход гликозилированного белков. Типичный образец показан в выражении IgG1-Fc (рисунок 1). В этом случае день 0 в день трансфекции с последующей День 1 (разбавление) и последующие дни культуры до 5 день экспрессии белка анализируют с помощью экспрессии растворимого фракцию в сырой среде. Очень небольшое коли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол иллюстрирует экспрессию белка с помощью переходного трансфекции HEK293F или S клеток. Оптимальные условия трансфекции, установленные в лабораториях Барб и Moremen использовать критическую комбинацию плотности клеток и реагентов концентрации для достижения высокой эффективности трансфекции. Критические соображения при реализации этого протокола включают в себя: поддержание стабильной культуры до трансфекции (с последовательным культура удвоения раз); трансфекции клеток активно растущих (достигается путем ра.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов в данной рукописи.
Благодарности
Эта работа была выполнена при финансовой поддержке грантами K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) и P01GM107012 (KWM) из Национального института здоровья, и средств от Роя Дж Carver Департамента биохимии, биофизики и молекулярной биологии в Университете штата Айова , Содержание данной работы является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шкаф биобезопасности | Компания NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Класс II, тип A2 Шкаф биологической безопасности |
| Инкубационный шейкер | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Среда A: Средство выражения FreeStyle | Life Technologies | 12338-018 | |
| Среда B: ExCell 293 Бессывороточная среда | СИГМА | 14571C | |
| 125 Колба Эрленмейера с вентилируемой крышкой | Corning Incorporated/Медико-биологические науки | 431143 | |
| 250 Колба Эрленмейера с вентилируемой крышкой | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 мл Одноразовая серологическая пипетка | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 мл Одноразовая серологическая пипетка | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 мл Одноразовая серологическая пипетка | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Пипетка (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | Термо Научный | SV30084.01 | |
| Подсчет слайдов | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Автоматический счетчик клеток | Био-Рад | 145-0102 | |
| Полиэтиленимин (ПЭИ) | Polysciences Inc. | 23966 | Готовьте исходный раствор в концентрации 1 мг/мл в буфере, содержащем 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновую кислоту (HEPES) и 150 мМ NaCl (pH 7,5). Полностью растворить ПЭИ; стерилизовать через 0,22 μ М шприц отфильтровать и хранить при температуре -20°С. |
| 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновая кислота (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| Шприцевой фильтр 25 мм, 0,22 шт; M | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Тризаминметан (основание Tris) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Стратаген | 222249 | |
| триптон | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Дрожжевой экстракт | Fluka Analytical | 92144 | |
| Хлорид натрия | BDH химикаты | BDH8014 | |
| Набор для очистки плазмид | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Приготовьте стоковый раствор 220 мМ в воде, простерилизуйте путем пропускания через стерильный фильтр 0,22 мм и храните при -20°С; |
| C Центрифуга | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Белковая А-сефарозная колонка | SIGMA | P9424 | |
| Суперпоток Ni-NTA | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Глицин | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 кДа отсечка молекулярной массы Amicon® Ультрацентробежные фильтры | Миллипор | UFC901096 | |
| Додецилсульфат натрия | ALDRICH | L3771 | |
| Бета-меркаптоэтанол | ALDRICH | M6250 | |
| Глицерин | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Уксусная кислота, ледяная | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie brilliant blue | Био-Рад | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N меченый L-тирозин | ALDRICH | 332151 | |
| 15N меченый L-лизин | ALDRICH | 592900 | |
| Немеченый L-фенилаланин | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-глюкоза | ALDRICH | 389374 | |
| 2- дезокси-2-фтор-l-фукозы | САНТА-КРУС Биотехнология | sc-283123 |
Ссылки
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
Теги
