Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Направленный метод Эволюция

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53761

⸱

1 апреля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем подробный протокол для создания и скрининга мутантных библиотек для кампаний направленной эволюции у Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Направленный эволюция в Saccharomyces CEREVISIAE предлагает много привлекательных преимуществ при проектировании ферменты для биотехнологических приложений, процесс , который включает в себя строительство, клонированию и экспрессии мутантных библиотек, в сочетании с высокой частотой гомологичной рекомбинации ДНК в естественных условиях. Здесь мы приводим протокол для создания и библиотеки мутантных экрана у дрожжей, основанные на примере грибковой арил-спиртовой оксидазы (АОА), чтобы повысить его общую активность. Два сегмента белка были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем случайного мутагенеза и ин виво рекомбинации ДНК. Заходами ~ 50 б.п. фланкирующих каждый сегмент позволил правильную сборку гена ААО-фьюжн в линеаризованный вектор, что приводит к полной автономно тиражирование плазмиды. Мутант библиотеки , обогащенные функциональными вариантами ААО подвергали скринингу в S. CEREVISIAE супернатанты с чувствительным анализом с высокой пропускной способностью на основе реакции Фентона. Общий процессбиблиотека строительство в S. CEREVISIAE описанные здесь , могут быть легко применены к эволюции многих других эукариотических генов, избегая дополнительных ПЦР - реакций, экстракорпоральное ДНК - рекомбинации и лигирования шаги.

Введение

Направленный молекулярная эволюция представляет собой надежный, быстрый и надежный метод для разработки ферментов 1, 2. Через итеративных раундов случайной мутации, рекомбинации и скрининга, улучшенные варианты ферментов могут быть сформированы , которые действуют на новых субстратах, в новых реакций, в ненатуральных среды, или даже помочь клетке для достижения новых целей обмена веществ 3-5. Среди хостов , используемых в направленной эволюции, дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE пивовара предлагает репертуар решений для функциональной экспрессии сложных белков эукариот, которые никаким иным образом не прокариотических аналогов 6,7.

Используется исчерпывающе в исследованиях клеточной биологии, эта маленькая эукариотической модель имеет много преимуществ с точки зрения пост-трансляционных модификаций, легкость манипулирования и преобразования эффективности, все из которых являются важными чертами инженеру ферментов путем направленной эволюции 8. Кроме того, высокая частотагомологичной рекомбинации ДНК в S. CEREVISIAE в сочетании с его эффективным устройством корректура открывает широкий спектр возможностей для создания библиотеки и сборки генов в живом организме , способствуя эволюции различных систем от отдельных ферментов до сложных искусственных путей 9-12. Наша лаборатория провела прошедшее десятилетие разработки инструментов и стратегий для молекулярной эволюции различных ligninases в дрожжах (оксидоредуктаз , участвующие в деградации лигнина в процессе естественного распада древесины) 13-14. В этой связи, мы представляем подробный протокол для подготовки и экран мутантные библиотеки в S. CEREVISIAE для модели flavooxidase, -арил-спиртовой оксидазы (ААО 15) -, который может быть легко переведено на многие другие ферменты. Протокол включает в себя целенаправленный направленный метод эволюции (морфингом мутагенный Организованная Рекомбинация процесса гомологичной в естественных условиях Группировка) при содействии аппарата дрожжевых клеток 16, А.Н.да очень чувствительный метод скрининг - анализа , основанный на реакции Фентона с целью определения активности AAO секретируемый в культуральный бульон , 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Мутант библиотека Строительство

  1. Выберите регионы , которые будут подвергнуты морфинговой с помощью вычислительных алгоритмов на основе доступных моделей кристаллической структуры или гомологии 18.
    1. Здесь цель две области ААО из вёшенка степная для случайного мутагенеза и рекомбинации (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), в то время как усиливающей остаток гена (844 пар оснований ) с помощью High-Fidelity PCR (рисунок 1).
      Примечание: Некоторые сегменты могут быть изучены с помощью морфинга в независимом или комбинированном образом 16.
  2. Amplify целевых областей с помощью мутагенной ПЦР. Создание перекрывающихся областей между сегментами (~ 50 б.п. каждая), накладывая ПЦР реакции определенных регионов.
    1. Готовят мутагенного ПЦР целевых сегментов в конечном объеме 50 мкл, содержащих ДНК-матрицы (0,92 нг / мкл), 90 нМ чувство олиго (RMLN для сегмента MI и ААО-BP для сегмента M-II), 90 нм аntisense праймер (ААО-92С для сегмента MI и RMLC для сегмента M-II), 0,3 мМ дНТФ (0,075 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО), 1,5 мМ MgCl 2, 0,05 мМ MnCl 2 и 0,05 ед / мкл Taq - ДНК - полимеразы. Грунтовки последовательности подробно описаны на рисунке 1.
    2. Используйте следующую программу ПЦР: 95 ° С в течение 2 мин (1 цикл); 95 ° С в течение 45 сек, 50 ° C в течение 45 сек, 74 ° С в течение 45 секунд (28 циклов); и 74 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
  3. Amplify не-мутагенными области с ультра-высокой точности воспроизведения полимеразы и включают в себя соответствующие зоны перекрытия мутагенные сегментов и / или линеаризованный вектор свесы.
    1. Подготовка реакционных смесей в конечном объеме 50 мкл, содержащем: ДНК-матрицы (0,2 нг / мкл), 250 нМ олиго чувство HFF, 250 нМ олиго антисмысловой HFR, 0,8 мМ дНТФ (0,2 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,02 ед / мкл ДНК - полимеразы iproof. Грунтовки последовательности подробно описаны в <сильный> Рисунок 1.
    2. Используйте следующую программу ПЦР: 98 ° C в течение 30 сек (1 цикл); 98 ° С в течение 10 сек, 55 ° C в течение 25 сек, 72 ° С в течение 45 сек (28 циклов); и 72 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
      Примечание: В условиях , описанных в 1.2 и 1.3 из 43 наложений пар оснований (плазмида-М1 область); 46 пар оснований (M1 область ВЧ-область); 47 пар оснований (HF область-M2 область) и 61 пар оснований (M2 регионализация плазмида) предназначены (Рисунок 1) с целью способствовать в естественных условиях сплайсинга у дрожжей.
    3. Очищают все фрагменты ПЦР (мутагенные и мутагенными) с использованием набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
  4. Линеаризовать вектор таким образом, что фланговые области примерно 50 пар оснований, которые созданы гомологичны 5'- и 3'-концов гена-мишени.
    1. Готовят реакционную смесь , содержащую линеаризация 2 мкг ДНК, 7,5 U Bam HI, 7,5 U Xho I, 20 мкг БСА и 2 мкл буфера Baм HI 10x в конечном объеме 20 мкл.
    2. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 2 ч и 40 мин. Затем продолжить инактивацию при 80 ° С в течение 20 мин.
  5. Очищают линеаризованного вектора путем экстракции в геле агарозы , чтобы избежать загрязнения с остаточной кольцевой плазмиды (рисунок 2).
    1. Нагрузка реакции переваривания смесь в мега-лунку полупрепаративной с низкой температурой плавления агарозном геле (0,75%, вес: объем), а также аликвоту (5 мкл) реакционной смеси в смежный хорошо в качестве репортера.
    2. Запуск ДНК-электрофорез (5 В / см между электродами, 4 ᵒC) и отделяют агарозный гель, соответствующий мега-колодец и хранить его при температуре 4 ᵒC в 1x TAE.
    3. Пятно полосу с молекулярной массой лестницы и репортера. Визуализируйте полосы под действием УФ-света. Ник положение, в котором линеаризованный вектор места.
      Примечание: Поскольку качество очищенного линеаризованной вектора является critiкал фактором успешной рекомбинации и сборки в дрожжах, избежать гель для окрашивания электрофореза полупрепаративной ДНК. Использование красителей и УФ - облучения для экстракции геля может повлиять на стабильность вектора ДНК, ставя под угрозу в естественных условиях эффективность рекомбинации. В качестве альтернативы токсичных EtBr красителей, гель Красный и SYBR красители обычно используются для окрашивания геля.
    4. При отсутствии УФ-излучения, определить линеаризованного вектора во фрагменте мега-луночного с использованием указаний о зарубок в окрашенном репортер полосу таким образом, чтобы его можно выделить.
    5. Извлечение линеаризованного вектора из агарозы и очищают его с помощью набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: Используйте высокого копирования челночные векторы с эписомными антибиотических и ауксотрофию маркеров: В этом примере мы использовали урацил независимый и ампициллину pJRoC30 вектор под контролем промотора дрожжей GAL1.
  6. Приготовьте эквимолярное миxture фрагментов ПЦР и смешать его с линеаризованной вектора в соотношении 2: 1, с не менее чем 100 нг линеаризованной плазмиды (тест различных соотношениях эквимолярная библиотеки / открытого вектора для достижения хороших урожаев трансформации).
    1. Измеряют поглощение фрагментов ПЦР и линеаризованный вектор при 260 нм и 280 нм для определения их концентрации и чистоты.
  7. Transform дрожжевых компетентных клеток со смесью ДНК с использованием набора для коммерческого трансформации дрожжей (см таблицу поставок) в соответствии с инструкциями изготовителя.
    1. При этом используют дефицитный по протеазе и URA3 - зависимой S. CEREVISIAE штамм BJ5465. Трансформации клеток с родительским замыкают в цикл вектора в качестве внутреннего стандарта в ходе скрининга (см ниже). Кроме того, проверьте фона путем преобразования линеаризованного вектора в отсутствие ПЦР-фрагментов.
      Примечание: В случае обнаружения начальных низких уровней секреции, используют S.CEREVISIAE с дефицитом протеазы , такие как штаммы BJ5465 способствовать накоплению активного белка в супернатантах культур. Если целевой фермент подвергается гипергликозилирование, использование гликозилирования-дефицитных штаммов (например, Δ kre2 что только способен прикрепляться меньшие маннозы олигомеры) может быть подходящим вариантом.
  8. Тарелка трансформированные клетки на SC отсева учащихся из пластин и инкубировать их при 30 ° С в течение трех дней. Пластина (на SC отсева учащихся из пластин , дополненной урацил) URA3 - S. Клетки CEREVISIAE , не имеющие плазмиды в качестве отрицательного контроля для скрининга (см ниже).

2. Высокопроизводительный скрининг анализа (рисунок 3)

  1. Заполните соответствующее количество стерильных 96-луночных планшетах (23 пластин для анализа библиотеки клонов 2000) с 50 мкл минимальной среды на лунку с помощью пипетки робота.
  2. Выберите отдельные колонии из SC-выпадении пластин и передавать их на 96-луночные планшеты,
    1. В каждой пластине, прививают номер столбца 6 с родительским типом в качестве внутреннего стандарта и хорошо H1 с URA3 - S. Клетки CEREVISIAE (в SC среде , дополненной урацил) без плазмиды в качестве отрицательного контроля.
      Примечание: Ну H1 заполняется конкретно бросивших среде с добавлением урацила. Пустое лунку, содержащую носитель без клеток, могут быть также получены в качестве дополнительного контроля стерильности.
  3. Покрывал пластины с их крышками и завернуть их в парафильмом. Инкубируйте пластин в течение 48 ч при 30 ° С, 225 оборотов в минуту и ​​80% относительной влажности во влажной шейкере.
  4. Удалите парафином, добавьте 160 мкл экспрессионной среды в каждую лунку с помощью пипетки робота, запечатать пластины и инкубировать их в течение еще 24 часов.
    Примечание: минимальная среда и выражение среды получают , как описано в другом месте 19. Уровни секреции могут варьироваться в зависимости от исследуемого гена и, соответственно, тон инкубацией раз должен быть оптимизирован в каждом конкретном случае для синхронизации роста клеток во всех лунках.
  5. Центрифуга пластины (мастер - пластинки) , при 2800 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  6. Передача 20 мкл надосадочной жидкости из лунок в основной пластины к репликам пластины с использованием жидкости обработки роботизированную мультистанционной.
    Примечание: Для того, чтобы благоприятствовать фермента секреции рекомендуется заменить нативный сигнальный пептид белка - мишени с помощью сигнальных пептидов , обычно используемых для гетерологичной экспрессии в дрожжах (например, коэффициент α препропоследовательность лидер, лидер K 1 Убийца токсина из S. CEREVISIAE, или даже химерные варианты обоих пептидов 13). В качестве альтернативы, нативный сигнальный пептид, может быть исключительно эволюционировали для секреции в дрожжах.
  7. Добавьте 20 мкл 2 мМ р -methoxybenzylalcohol в 100 мМ натрий - фосфатном буфере , рН 6,0 с помощью пипетирования робота. Перемешать пластины кратко с 96-мыLL планшет-миксер и инкубировать их в течение 30 мин при комнатной температуре.
  8. С пипетирования робота, добавьте 160 мкл реагента FOX на каждую реплику пластины и кратко перемешать смеситель (конечная концентрация ЛИС смеси в скважине: 100 мкМ ксиленол оранжевый, 250 мкМ Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 и 25 мМ H 2 SO 4).
    1. Добавьте несколько добавок к реагенту для повышения чувствительности, такие как органические сорастворители (ДМСО, этанол, метанол) или сорбитол 17. Здесь, усиливают реакцию путем добавления сорбитол до конечной концентрации 100 мМ (рисунок 4).
  9. Прочитайте пластины (режим конечной точки, т 0) при 560 нм на планшет - ридере.
  10. Инкубируйте пластин при комнатной температуре , пока цвет не разрабатывает и измерить поглощение снова (T 1).
    1. Вычислить относительную активность от разности между значением Abs после инкубации и у исходного измерения нормирована на ПАРЕntal типа для каждой пластины (t 1 - T 0).
  11. Тема лучшие мутантные хиты в двух последовательных повторных показов, чтобы исключить ложные срабатывания.
    Примечание: Как правило, повторные скрининги включают выделения плазмид из дрожжей, амплификации и очистки в кишечной палочки, а затем трансформации свежих дрожжевых клеток с плазмидой 19. Каждый выбранный клон повторно показан в pentaplicate.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ААО от P. eryngii является внеклеточным flavooxidase , который поставляет грибковые пероксидазы с H 2 O 2 , чтобы начать атаковать лигнина. Два сегмента AAO были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем морфинга в целях повышения его активности и его экспрессию в S. CEREVISIAE 19. Независимо от иностранных ферментов укрывал на S. CEREVISIAE, самый важный вопрос при создании мутантных библиотек в дрожжах относится...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы суммировали большинство советы и приемы используются в нашей лаборатории для конструирования ферментов с помощью направленной эволюции в S. CEREVISIAE ( с использованием Aao в качестве примера) , таким образом , что они могут быть адаптированы для использования с многими другими системами эукариотических ферментов просто следуя общий подход , описанный здесь.

С точки зрения создания библиотеки, морфинг является быстрый метод один горшок , чтобы ввести и рекомбинирую...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом Европейской комиссии Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; биокатализом систем Cost-Action CM1303; и национальными проектами Dewry [BIO201343407-R] и Cambios [RTC-2014-1777-3].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильный>1. Питательные среды
Ампициллин натриевая сольSigma-AldrichA0166CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto AgarDifco214010
CloramphenicolSigma-AldrichC0378CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-GalactoseSigma-AldrichG0750CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG5767CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrateSigma-Aldrich83400CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
ПептонDifco211677
Моноосновной фосфат калияSigma-AldrichP0662CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
UracilSigma AldrichU1128
Экстракт дрожжейDifco212750
Дрожжевая азотная основа без аминокислотDifco291940
Дрожжи синтетические дропаут-средние добавки без урацилаSigma-AldrichY1501
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
2. PCR Reactions
dNTP MixAgilent genomics200415-5125 mM каждый
iProof High-Fidelity DNA polymeraseBio-rad172-5301
Тетрагидрат хлорида марганца(II)Sigma-AldrichM8054CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq ДНК-полимеразаSigma-AldrichD4545Для ошибки pro PCR
Название<strong>CompanyКаталожный номерКомментарии
3. Фермент рестрикции плазмид
BamHIАнглия BiolabsR0136S
Бычья сыворотка АльбуминНовая Англия BiolabsB9001S
XhoI фермент рестрикцииНовая АнглияR0146S
Not I рестрикционный ферментNew England BiolabsR0189S
Gel RedBiotium41003Для окрашивания ДНК
Name<>CompanyКаталожный номерComments
4. Анализы FOX
сульфат аммония железа (II) гексагидратSigma-AldrichF3754CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Спирт анисилаSigma AldrichW209902CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-сорбитSigma-AldrichS1876CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Перекись водорода 30%Merck Millipore1072090250FOX стандартная кривая
Ксиленол Оранжевый динатриевая сольSigma-Aldrich52097CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
5. Агарозный гель stuff
AgaroseNorgen28035CAS Nº 9012-36-6
Гель красныйBiotium41003Краситель для анализа ДНК
GeneRuler 1kb LadderThermo ScientificSM0311ДНК M.W. стандартный
загрузочный краситель 6xThermo ScientificR0611
Низкотемпературный агарозныйBio-rad161-3112CAS Nº 39346-81-1
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
>6. Наборы и клетки
S. cerevisiae штамм BJ5465LGC PromochemATTC 208289Протеаза дефицитный штамм с генотипом: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue компетентные клеткиAgilent genomics200150Для очистки и амплификации плазмид
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up KitMacherey-Nagel740,609,250Экстракция гелем ДНК
NucleoSpin Набор для плазмидMacherey-Nagel740,588,250Набор для минипрепа колонок
Набор для трансформации дрожжейSigma-AldrichYEAST1-1KTВключенный носитель ДНК (яичек лосося)
Zymoprep yeast plasmid miniprep IZymo researchD2001Экстракция плазмиды из дрожжей
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
7. Планшеты
прозрачные, нестерильные, полистирольные (для измерения активности)
96-луночные планшетыGreiner Bio-One655161прозрачные, стерильные, полистирольные (для микроферментации)
96-луночные пластинчатые крышкиGreiner Bio-One656171прозрачные, стерильные, полистирольные (для микроферментации)
Новая strong96-луночные планшеты Greiner Bio-One 655101

Ссылки

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012(2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16(2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919(2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Случайный мутагенезрекомбинация ДНК in vivoгрибковая арилспиртовая оксидазавысокопроизводительный скрининганализ по реакции Фентонагель-электрофорезтрансформация дрожжей
Направленный метод Эволюция
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.