Направленный метод Эволюция Saccharomyces CEREVISIAE: Mutant Создание и скрининг библиотеки

Summary

Мы представляем подробный протокол для создания и скрининга мутантных библиотек для кампаний направленной эволюции у Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Направленный эволюция в Saccharomyces CEREVISIAE предлагает много привлекательных преимуществ при проектировании ферменты для биотехнологических приложений, процесс , который включает в себя строительство, клонированию и экспрессии мутантных библиотек, в сочетании с высокой частотой гомологичной рекомбинации ДНК в естественных условиях. Здесь мы приводим протокол для создания и библиотеки мутантных экрана у дрожжей, основанные на примере грибковой арил-спиртовой оксидазы (АОА), чтобы повысить его общую активность. Два сегмента белка были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем случайного мутагенеза и ин виво рекомбинации ДНК. Заходами ~ 50 б.п. фланкирующих каждый сегмент позволил правильную сборку гена ААО-фьюжн в линеаризованный вектор, что приводит к полной автономно тиражирование плазмиды. Мутант библиотеки , обогащенные функциональными вариантами ААО подвергали скринингу в S. CEREVISIAE супернатанты с чувствительным анализом с высокой пропускной способностью на основе реакции Фентона. Общий процессбиблиотека строительство в S. CEREVISIAE описанные здесь , могут быть легко применены к эволюции многих других эукариотических генов, избегая дополнительных ПЦР - реакций, экстракорпоральное ДНК - рекомбинации и лигирования шаги.

Introduction

Направленный молекулярная эволюция представляет собой надежный, быстрый и надежный метод для разработки ферментов ^{1, 2.} Через итеративных раундов случайной мутации, рекомбинации и скрининга, улучшенные варианты ферментов могут быть сформированы , которые действуют на новых субстратах, в новых реакций, в ненатуральных среды, или даже помочь клетке для достижения новых целей обмена веществ ^3-5. Среди хостов , используемых в направленной эволюции, дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE пивовара предлагает репертуар решений для функциональной экспрессии сложных белков эукариот, которые никаким иным образом не прокариотических аналогов ^6,7.

Используется исчерпывающе в исследованиях клеточной биологии, эта маленькая эукариотической модель имеет много преимуществ с точки зрения пост-трансляционных модификаций, легкость манипулирования и преобразования эффективности, все из которых являются важными чертами инженеру ферментов путем направленной эволюции ^8. Кроме того, высокая частотагомологичной рекомбинации ДНК в S. CEREVISIAE в сочетании с его эффективным устройством корректура открывает широкий спектр возможностей для создания библиотеки и сборки генов в живом организме , способствуя эволюции различных систем от отдельных ферментов до сложных искусственных путей ^9-12. Наша лаборатория провела прошедшее десятилетие разработки инструментов и стратегий для молекулярной эволюции различных ligninases в дрожжах (оксидоредуктаз , участвующие в деградации лигнина в процессе естественного распада древесины) ^13-14. В этой связи, мы представляем подробный протокол для подготовки и экран мутантные библиотеки в S. CEREVISIAE для модели flavooxidase, -арил-спиртовой оксидазы (ААО ¹⁵⁾ -, который может быть легко переведено на многие другие ферменты. Протокол включает в себя целенаправленный направленный метод эволюции (морфингом мутагенный Организованная Рекомбинация процесса гомологичной в естественных условиях Группировка) при содействии аппарата дрожжевых клеток ^16, А.Н.да очень чувствительный метод скрининг - анализа , основанный на реакции Фентона с целью определения активности AAO секретируемый в культуральный бульон , ^17.

Protocol

1. Мутант библиотека Строительство

1. Выберите регионы , которые будут подвергнуты морфинговой с помощью вычислительных алгоритмов на основе доступных моделей кристаллической структуры или гомологии ^18.
   1. Здесь цель две области ААО из вёшенка степная для случайного мутагенеза и рекомбинации (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), в то время как усиливающей остаток гена (844 пар оснований ) с помощью High-Fidelity PCR (рисунок 1).
      Примечание: Некоторые сегменты могут быть изучены с помощью морфинга в независимом или комбинированном образом ^16.
2. Amplify целевых областей с помощью мутагенной ПЦР. Создание перекрывающихся областей между сегментами (~ 50 б.п. каждая), накладывая ПЦР реакции определенных регионов.
   1. Готовят мутагенного ПЦР целевых сегментов в конечном объеме 50 мкл, содержащих ДНК-матрицы (0,92 нг / мкл), 90 нМ чувство олиго (RMLN для сегмента MI и ААО-BP для сегмента M-II), 90 нм аntisense праймер (ААО-92С для сегмента MI и RMLC для сегмента M-II), 0,3 мМ дНТФ (0,075 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО), 1,5 мМ MgCl _2, 0,05 мМ MnCl ₂ и 0,05 ед / мкл Taq - ДНК - полимеразы. Грунтовки последовательности подробно описаны на рисунке 1.
   2. Используйте следующую программу ПЦР: 95 ° С в течение 2 мин (1 цикл); 95 ° С в течение 45 сек, 50 ° C в течение 45 сек, 74 ° С в течение 45 секунд (28 циклов); и 74 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
3. Amplify не-мутагенными области с ультра-высокой точности воспроизведения полимеразы и включают в себя соответствующие зоны перекрытия мутагенные сегментов и / или линеаризованный вектор свесы.
   1. Подготовка реакционных смесей в конечном объеме 50 мкл, содержащем: ДНК-матрицы (0,2 нг / мкл), 250 нМ олиго чувство HFF, 250 нМ олиго антисмысловой HFR, 0,8 мМ дНТФ (0,2 мМ каждого), 3% (об / об) диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,02 ед / мкл ДНК - полимеразы iproof. Грунтовки последовательности подробно описаны в <сильный> Рисунок 1.
   2. Используйте следующую программу ПЦР: 98 ° C в течение 30 сек (1 цикл); 98 ° С в течение 10 сек, 55 ° C в течение 25 сек, 72 ° С в течение 45 сек (28 циклов); и 72 ° С в течение 10 мин (1 цикл).
      Примечание: В условиях , описанных в 1.2 и 1.3 из 43 наложений пар оснований (плазмида-М1 область); 46 пар оснований (M1 область ВЧ-область); 47 пар оснований (HF область-M2 область) и 61 пар оснований (M2 регионализация плазмида) предназначены (Рисунок 1) с целью способствовать в естественных условиях сплайсинга у дрожжей.
   3. Очищают все фрагменты ПЦР (мутагенные и мутагенными) с использованием набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
4. Линеаризовать вектор таким образом, что фланговые области примерно 50 пар оснований, которые созданы гомологичны 5'- и 3'-концов гена-мишени.
   1. Готовят реакционную смесь , содержащую линеаризация 2 мкг ДНК, 7,5 U Bam HI, 7,5 U Xho I, 20 мкг БСА и 2 мкл буфера Baм HI 10x в конечном объеме 20 мкл.
   2. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 2 ч и 40 мин. Затем продолжить инактивацию при 80 ° С в течение 20 мин.
5. Очищают линеаризованного вектора путем экстракции в геле агарозы , чтобы избежать загрязнения с остаточной кольцевой плазмиды (рисунок 2).
   1. Нагрузка реакции переваривания смесь в мега-лунку полупрепаративной с низкой температурой плавления агарозном геле (0,75%, вес: объем), а также аликвоту (5 мкл) реакционной смеси в смежный хорошо в качестве репортера.
   2. Запуск ДНК-электрофорез (5 В / см между электродами, 4 ᵒC) и отделяют агарозный гель, соответствующий мега-колодец и хранить его при температуре 4 ᵒC в 1x TAE.
   3. Пятно полосу с молекулярной массой лестницы и репортера. Визуализируйте полосы под действием УФ-света. Ник положение, в котором линеаризованный вектор места.
      Примечание: Поскольку качество очищенного линеаризованной вектора является critiкал фактором успешной рекомбинации и сборки в дрожжах, избежать гель для окрашивания электрофореза полупрепаративной ДНК. Использование красителей и УФ - облучения для экстракции геля может повлиять на стабильность вектора ДНК, ставя под угрозу в естественных условиях эффективность рекомбинации. В качестве альтернативы токсичных EtBr красителей, гель Красный и SYBR красители обычно используются для окрашивания геля.
   4. При отсутствии УФ-излучения, определить линеаризованного вектора во фрагменте мега-луночного с использованием указаний о зарубок в окрашенном репортер полосу таким образом, чтобы его можно выделить.
   5. Извлечение линеаризованного вектора из агарозы и очищают его с помощью набора для экстракции геля коммерческого в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: Используйте высокого копирования челночные векторы с эписомными антибиотических и ауксотрофию маркеров: В этом примере мы использовали урацил независимый и ампициллину pJRoC30 вектор под контролем промотора дрожжей GAL1.
6. Приготовьте эквимолярное миxture фрагментов ПЦР и смешать его с линеаризованной вектора в соотношении 2: 1, с не менее чем 100 нг линеаризованной плазмиды (тест различных соотношениях эквимолярная библиотеки / открытого вектора для достижения хороших урожаев трансформации).
   1. Измеряют поглощение фрагментов ПЦР и линеаризованный вектор при 260 нм и 280 нм для определения их концентрации и чистоты.
7. Transform дрожжевых компетентных клеток со смесью ДНК с использованием набора для коммерческого трансформации дрожжей (см таблицу поставок) в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. При этом используют дефицитный по протеазе и URA3 ^- зависимой S. CEREVISIAE штамм BJ5465. Трансформации клеток с родительским замыкают в цикл вектора в качестве внутреннего стандарта в ходе скрининга (см ниже). Кроме того, проверьте фона путем преобразования линеаризованного вектора в отсутствие ПЦР-фрагментов.
      Примечание: В случае обнаружения начальных низких уровней секреции, используют S.CEREVISIAE с дефицитом протеазы , такие как штаммы BJ5465 способствовать накоплению активного белка в супернатантах культур. Если целевой фермент подвергается гипергликозилирование, использование гликозилирования-дефицитных штаммов (например, Δ kre2 что только способен прикрепляться меньшие маннозы олигомеры) может быть подходящим вариантом.
8. Тарелка трансформированные клетки на SC отсева учащихся из пластин и инкубировать их при 30 ° С в течение трех дней. Пластина (на SC отсева учащихся из пластин , дополненной урацил) URA3 ^- S. Клетки CEREVISIAE , не имеющие плазмиды в качестве отрицательного контроля для скрининга (см ниже).

2. Высокопроизводительный скрининг анализа (рисунок 3)

1. Заполните соответствующее количество стерильных 96-луночных планшетах (23 пластин для анализа библиотеки клонов 2000) с 50 мкл минимальной среды на лунку с помощью пипетки робота.
2. Выберите отдельные колонии из SC-выпадении пластин и передавать их на 96-луночные планшеты,
   1. В каждой пластине, прививают номер столбца 6 с родительским типом в качестве внутреннего стандарта и хорошо H1 с URA3 ^- S. Клетки CEREVISIAE (в SC среде , дополненной урацил) без плазмиды в качестве отрицательного контроля.
      Примечание: Ну H1 заполняется конкретно бросивших среде с добавлением урацила. Пустое лунку, содержащую носитель без клеток, могут быть также получены в качестве дополнительного контроля стерильности.
3. Покрывал пластины с их крышками и завернуть их в парафильмом. Инкубируйте пластин в течение 48 ч при 30 ° С, 225 оборотов в минуту и ​​80% относительной влажности во влажной шейкере.
4. Удалите парафином, добавьте 160 мкл экспрессионной среды в каждую лунку с помощью пипетки робота, запечатать пластины и инкубировать их в течение еще 24 часов.
   Примечание: минимальная среда и выражение среды получают , как описано в другом месте ^19. Уровни секреции могут варьироваться в зависимости от исследуемого гена и, соответственно, тон инкубацией раз должен быть оптимизирован в каждом конкретном случае для синхронизации роста клеток во всех лунках.
5. Центрифуга пластины (мастер - пластинки) , при 2800 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
6. Передача 20 мкл надосадочной жидкости из лунок в основной пластины к репликам пластины с использованием жидкости обработки роботизированную мультистанционной.
   Примечание: Для того, чтобы благоприятствовать фермента секреции рекомендуется заменить нативный сигнальный пептид белка - мишени с помощью сигнальных пептидов , обычно используемых для гетерологичной экспрессии в дрожжах (например, коэффициент α препропоследовательность лидер, лидер K ₁ Убийца токсина из S. CEREVISIAE, или даже химерные варианты обоих пептидов ^13). В качестве альтернативы, нативный сигнальный пептид, может быть исключительно эволюционировали для секреции в дрожжах.
7. Добавьте 20 мкл 2 мМ р -methoxybenzylalcohol в 100 мМ натрий - фосфатном буфере , рН 6,0 с помощью пипетирования робота. Перемешать пластины кратко с 96-мыLL планшет-миксер и инкубировать их в течение 30 мин при комнатной температуре.
8. С пипетирования робота, добавьте 160 мкл реагента FOX на каждую реплику пластины и кратко перемешать смеситель (конечная концентрация ЛИС смеси в скважине: 100 мкМ ксиленол оранжевый, 250 мкМ Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} и 25 мМ H ₂ SO _4).
   1. Добавьте несколько добавок к реагенту для повышения чувствительности, такие как органические сорастворители (ДМСО, этанол, метанол) или сорбитол ^17. Здесь, усиливают реакцию путем добавления сорбитол до конечной концентрации 100 мМ (рисунок 4).
9. Прочитайте пластины (режим конечной точки, т ₀₎ при 560 нм на планшет - ридере.
10. Инкубируйте пластин при комнатной температуре , пока цвет не разрабатывает и измерить поглощение снова (T _1).
    1. Вычислить относительную активность от разности между значением Abs после инкубации и у исходного измерения нормирована на ПАРЕntal типа для каждой пластины (t ₁ - T _0).
11. Тема лучшие мутантные хиты в двух последовательных повторных показов, чтобы исключить ложные срабатывания.
    Примечание: Как правило, повторные скрининги включают выделения плазмид из дрожжей, амплификации и очистки в кишечной палочки, а затем трансформации свежих дрожжевых клеток с плазмидой ^19. Каждый выбранный клон повторно показан в pentaplicate.

Results

ААО от P. eryngii является внеклеточным flavooxidase , который поставляет грибковые пероксидазы с H ₂ O ₂ , чтобы начать атаковать лигнина. Два сегмента AAO были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем морфинга в целях повышения его активности и его экспрессию в S. CEREVISIAE ^19. Независимо от иностранных ферментов укрывал на S. CEREVISIAE, самый важный вопрос при создании мутантных библиотек в дрожжах относится...

Discussion

В этой статье мы суммировали большинство советы и приемы используются в нашей лаборатории для конструирования ферментов с помощью направленной эволюции в S. CEREVISIAE ( с использованием Aao в качестве примера) , таким образом , что они могут быть адаптированы для использования с многими другими системами эукариотических ферментов просто следуя общий подход , описанный здесь.

С точки зрения создания библиотеки, морфинг является быстрый метод один горшок , чтобы ввести и рекомбинирую...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильный>1. Питательные среды
Ампициллин натриевая соль	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-глюкоза	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Пептон	Difco	211677
Моноосновной фосфат калия	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Экстракт дрожжей	Difco	212750
Дрожжевая азотная основа без аминокислот	Difco	291940
Дрожжи синтетические дропаут-средние добавки без урацила	Sigma-Aldrich	Y1501
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM каждый
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Тетрагидрат хлорида марганца(II)	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq ДНК-полимераза	Sigma-Aldrich	D4545	Для ошибки pro PCR
Название<	strong>Company	Каталожный номер	Комментарии
3. Фермент рестрикции плазмид
BamHI	Англия Biolabs	R0136S
Бычья сыворотка Альбумин	Новая Англия Biolabs	B9001S
XhoI фермент рестрикции	Новая Англия	R0146S
Not I рестрикционный фермент	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	Для окрашивания ДНК
Name<	>Company	Каталожный номер	Comments
4. Анализы FOX
сульфат аммония железа (II) гексагидрат	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Спирт анисила	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-сорбит	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Перекись водорода 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX стандартная кривая
Ксиленол Оранжевый динатриевая соль	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
5. Агарозный гель stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Гель красный	Biotium	41003	Краситель для анализа ДНК
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	ДНК M.W. стандартный
загрузочный краситель 6x	Thermo Scientific	R0611
Низкотемпературный агарозный	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
>6. Наборы и клетки
S. cerevisiae штамм BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Протеаза дефицитный штамм с генотипом: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue компетентные клетки	Agilent genomics	200150	Для очистки и амплификации плазмид
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	Экстракция гелем ДНК
NucleoSpin Набор для плазмид	Macherey-Nagel	740,588,250	Набор для минипрепа колонок
Набор для трансформации дрожжей	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Включенный носитель ДНК (яичек лосося)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Экстракция плазмиды из дрожжей
Name	Company	Номер в каталоге	Комментарии
7. Планшеты
			прозрачные, нестерильные, полистирольные (для измерения активности)
96-луночные планшеты	Greiner Bio-One	655161	прозрачные, стерильные, полистирольные (для микроферментации)
96-луночные пластинчатые крышки	Greiner Bio-One	656171	прозрачные, стерильные, полистирольные (для микроферментации)