С помощью мышиного ABC транспортером Bcrp1 (ABCG2) в качестве примера, в-силикомарганца протоколы представлены для обнаружения альтернативного использования промотора генов экспрессируются в тканях мышей, а также для оценки функциональных возможностей альтернативных промоторов , идентифицированных с использованием репортерных анализов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методы Обнаружение использования альтернативных Promoter и транскрипционной регуляции мышиных Bcrp1
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
экспрессии генов в различных тканях, часто под контролем альтернативных промоторов, которые приводят к синтезу мРНК с уникальным - обычно непереведенных - первые экзоны. Bcrp1 (ABCG2), мышиный ортолог на ABC транспортером груди белка устойчивости рака (BCRP, ABCG2), имеет, по меньшей мере, четыре альтернативных промоторов, которые определены соответствующими четырьмя альтернативными первых экзонов производства: E1u, Е1А, Е1В и Е1С. При этом, в-силикомарганца протоколы представлены для прогнозирования альтернативного использования промотора для Bcrp1. Кроме того, методы репортер анализа описаны для получения репортерные конструкции для альтернативных промоторов и определить функциональные возможности предполагаемыми промоторов вверх по течению от альтернативного первых экзонов, которые обозначены.
Введение
Более половины генов человека регулируются альтернативными промоторами 1. Каждый альтернативный промотор может содержать регуляторные элементы, которые могут отличаться от тех, в других альтернативных промоторов. Промотор (ы), используемые в одной ткани могут отличаться от тех, которые использовались в других тканях. Например, вполне возможно, что активация данного сигнального пути, может вызвать альтернативный промотор гена, используемого в одной ткани, но не оказывают никакого влияния на или репрессировать отдельный альтернативный промотор для того же самого гена, который используется в другой ткани.
Экспрессия гена Bcrp1 опр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. В Silico Прогнозирование альтернативный первый экзонов Bcrp1 Использование BLAST Анализ мыши EST Database
Примечание: Этот протокол описывает, как поиск мыши выражается последовательность тегов (EST) базы данных для ЭБТ с последовательностью сходства с экзона 2 Bcrp1 (который содержит трансляционный начало сайта), а затем, как выравнивать соответствия EST последовательностей геномных последовательностей с целью выяснения их расположение в мыши Bcrp1 гена относительно конца 5 'Bcrp1 экзона 2.
- Получить последовательность для мыши Bcrp1 экзона 2 путем ввода мРНК эталонной последовательности ID (NM_011920.3) в поиск....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Идентификация BCRP 1 альтернативного использования промотора в семенниках мыши с помощью анализа лидера экзонов
Когда база данных EST в базе данных NCBI зондировался (апрель 2015 г. ) с использованием шагов , описанных в Протоколе 1 эстов обнаружили , что были смежными с 5' - концом экзона 2 в BCRP 1 мРНК, показаны в таблице 1,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Большинство методов и репрезентативных результатов , представленных описаны в предыдущей работе , озаглавленной "B CRP1 транскрипции в семенниках мыши контролируется промотором перед новым первого экзона (E1u) регулируется стероидогенной фактор-1" , который был опубликован в 2013 году 5 . В дополнение к репрезентативных результатов, изображенных здесь, предыдущий документ представили оценки альтернативного использования первого экзона с использованием 5'-RACE PCR и RT-PCR методику. Кром.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Дуглас Д. Росс и Университета штата Мэриленд, Балтимор держать патентные права человека BCRP.
Благодарности
Эта работа была поддержана Merit Review Awards Дуглас Д. Росс и Ариф Хуссейн из Департамента по делам ветеранов.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| COMMERCIAL BIOLOGIC МАТЕРИАЛЫ И НАБОРЫ: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, в настоящее время доступен через Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA набор для клонирования | Life Technologies | K450001 | Этот набор содержит ТОП10 химически компетентных бактерий E. coli. |
| Набор для быстрого лигирования T4 ДНК-лигазы | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart высокоточный Taq-ДНК-полимераза | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Содержит высококачественную смесь ферментов Taq-полимеразы |
| XtremeGENE HP ДНК реагент для трансфекции | Roche | 6366236001 | |
| набор для двойного репортера люциферазы | Promega | E1910 | Включает в себя пустой репортерный вектор pGL3-basic (люцифераза светлячков), экспрессирующий вектор рениллюциферазы pRLTK и другие контрольные векторы. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | Для плазмиды miniprep - выделение и очистка плазмидной ДНК из бактериальных колоний |
| вектор pCR2.1 в | составе набора | ||
| pGL3-базовая люцифераза, содержащая вектор | Promega | E1751 | |
| pRL-TK экспрессирующий рениллуциферазу | вектор Promega | E2241 | |
| Бактериальная искусственная хромосома | Ресурсный центр BACPAC, Детский s Больница Оклендского научно-исследовательского института, Окленд, Калифорния | RP23-285A12 и RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® Система очистки гелем SV и ПЦР | Promega | A9281 | Полезно для очистки продуктов ПЦР после разложения с эндонуклеазами рестрикции |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Проект Ensembl | http://Ensembl.org | Проект Ensembl создает базы данных генома позвоночных и других эукариотических видов и делает эту информацию свободно доступной в Интернете. |
| Программное обеспечение для взрывных работ | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Веб и Интернет PAGE_TYPE=Программное обеспечение BlastHome | |
| Primer 3 | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Полезно для разработки праймеров для базы |
| нуклеотидов 5'-RACE PCR NCBI | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 мышиные клетки Sertoli | ATCC, Манассас, Вирджиния | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Люминометр | Turner Biosystems | TD-20/20 | Это относительно недорогой люминометр с ручным управлением. Также доступны автоматизированные системы того же производителя, в которых используются 96-луночные планшеты. |
| Спектрофотометры | NanoDrop компании Thermo Scientific, Inc. | Спектрофотометр NanoDrop 2000 | может использовать очень малые количества образцов |
| спектрофотометра DU 800 UV/VIS и программного обеспечения для анализа нуклеиновых кислот II | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Ссылки
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
