Методическая статья

Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53916

⸱

10 мая 2016 г.

 ,  , 
1University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол лазерной микродиссекции определенных типов растительных клеток для транскрипционного профилирования. В то время как протокол подходит для различных видов и типов клеток, основное внимание уделяется крайне труднодоступным клеткам женской зародышевой линии, важной для полового и апомиктического размножения в роде крестоцветных Boechera.

Аннотация

Понимание процессов развития на молекулярном уровне требует понимания регуляции транскрипции и, следовательно, транскриптома на уровне отдельных типов клеток. В то время как описанные здесь методы в целом применимы к широкому спектру видов и типов клеток, наши исследования сосредоточены на размножении растений. Выращивание растений и производство семян имеет решающее значение для питания человека и животных. Детальное понимание регуляторных сетей, которые управляют формированием репродуктивной линии (зародышевой линии) и, в конечном счете, семян, является предпосылкой для целенаправленного манипулирования размножением растений. В частности, инженерия апомиксиса (бесполого размножения через семена) в сельскохозяйственных культурах обещает большие улучшения, поскольку она приводит к образованию клональных семян, генетически идентичных материнскому растению. Следовательно, типы клеток женской зародышевой линии имеют большое значение для понимания и разработки апомиксиса. Однако, поскольку соответствующие клетки глубоко встроены в ткани цветка, к ним очень трудно получить доступ для экспериментального анализа, включая транскриптомику для конкретного типа клеток. Чтобы преодолеть это ограничение, срезы отдельных клеток могут быть изолированы с помощью лазерной микродиссекции (ЛАМ). В то время как LAM в сочетании с транскрипционным профилированием позволяет идентифицировать гены и пути, активные в любом типе клеток с высокой специфичностью, создание подходящего протокола может быть сложной задачей. В частности, качество РНК, полученной после ЛАМ, может быть нарушено, особенно когда мишенью являются маленькие одиночные клетки. Чтобы обойти эту проблему, мы создали рабочий процесс для ЛАМ, который воспроизводимо приводит к высокому качеству РНК, хорошо подходящему для транскриптомики, примером чего здесь является выделение клеток женской зародышевой линии в апомиктических бохерах. В этом протоколе описаны процедуры препарирования тканей и ЛАМ, а также в отношении экстракции РНК и контроля качества.

Введение

В транскрипционных исследованиях, проведенных на уровне тканей, Транскриптом узкоспециализированных, но редких типов клеток часто маскируется более обильными окружающих клеток. Примером таких узкоспециализированных типов клеток являются клетки женской репродуктивной линии (зародышевой) в растениях. Самка зародышевой задается в развивающихся яйцеклеток, предшественники семян внутри гинецеем цветочной 1,2. Мегаспор материнская клетка (MMC) является первой ячейкой женского зародышевых. Он подвергается мейоза с образованием тетраду восстановленных мегаспор. Как правило, только один из этих мегаспор выживает и делит митотически без цитокинеза, то есть, в синцитий. Эти митозы следуют cellularization с образованием зрелого гаметофит, который, как правило, состоит из четырех типов клеток: три antipodals, два synergid клетки, яйца и центральной клетки. Яичные и центральные клетки являются женские гаметы, которые получают оплодотворенные двумя сперматозоидами во время доуBLE оплодотворение , чтобы дать начало зародыша и эндосперма Проявочной семян 1,2. В сексуальной модели системы Резуховидка Таля, только ~ 50 семян развиваются на цветок в то время как около 50 - 80 семян развиваются на цветок в тесно связанного рода Boechera. Таким образом, самка зародышевой состоит из всего лишь нескольких узкоспециализированных типов клеток, что делает его отличной моделью для изучения процессов развития, такие как спецификации и дифференцировки клеток.

Кроме того, способность проникновения в суть регуляторных процессов генов, регулирующих размножение растений может быть прикладной ценности. У растений, как половое и бесполое размножение через семена (апомиксису) может произойти. В то время как половое размножение создает генетическое разнообразие в популяции, апомиксис приводит к образованию клонального потомства, генетически идентичны материнского растения. Поэтому апомиксису имеет большой потенциал для применения в сельском хозяйстве и производстве семян, так как даже сложные материнские генотипы могутподдерживаться неизменным на протяжении нескольких поколений 3,4,5. Поскольку апомиксису , естественно , не происходит ни в одном основных видов сельскохозяйственных культур, инженерный апомиксиса в посевах представляет большой интерес 3,4,5. Тем не менее, это долгосрочная цель трудно достичь , потому что основной генетический и молекулярная основа апомиксисом не понята достаточно подробно 6.

Для того, чтобы получить представление о транскрипционной основе , регулирующие апомиктическое воспроизводства, типа клеток специфических транскрипционных профилирование с помощью с помощью лазера микродиссекции (LAM) и следующего поколения секвенирования (NGS) представляет собой очень мощный подход 7,8. LAM сначала был создан для животных и биомедицинских исследований. За последние несколько лет LAM также применяется к биологии растений 6,9,10. В отличие от других способов , позволяющих профилирование отдельных клеток и тканей типов, Lam не требует генерации маркерных линий 6,9,10. Таким образом, это может быть приложениелгал любой клетки или ткани типа без предварительного молекулярного знания. Еще одним преимуществом является то, что LAM он может быть применен к любому типу клеток до тех пор, как клетка может быть распознана в сухих участках в зависимости от положения и / или структурных характеристик. LAM имеет дополнительное преимущество в том, что используются фиксированные ткани, что предотвращает изменения транскрипционного профиля во время обработки.

Ткани интерес, например, цветочной ткани, фиксируется в несшивающий закрепителя до встраивания в парафин. Вложение в парафин может быть сделано вручную, в соответствии с установленными протоколами 9,11. Тем не менее, использование автоматизированного процессора ткани для дегидратации и инфильтрации с воском обычно приводит к более высокой воспроизводимостью с точки зрения сохранения качества РНК и морфологии тканей. Альтернативная стратегия встраивания ткани в смолу также успешно используется для анализа типа специфических клеточных LAM 8. Тем не менее, использование автомПроцессор ткани ованные для встраивания в воске очень много времени эффективным, так как многие образцы могут быть обработаны сразу же требует как минимум практического времени. В то время как, как правило, нет значительной потери качества РНК происходит во время фиксации и встраивание, приготовление тонких срезов с микротома и, в частности, монтаж на frameslides, используемых для LAM остается важным шагом для сохранения качества РНК. Это ранее было отмечено , и использование системы передачи ленты была описана в более высокое качество РНК на данном этапе 12. Тем не менее, это добавляет еще один шаг больших затрат времени при подготовке слайдов, а также требует специального оборудования. Оптимизированный протокол , описанный ниже воспроизводимо производит РНК , которая обладает достаточным качеством для транскрипционного профилирования с GeneChips и следующего поколения секвенирования (NGS) подходы 7,11,13,14. Кроме того, с помощью лазерного микроскопа микродиссекции, используемого, высокая чистота выделенных типов клеток является беспорядочное бегствоinely производства 7,11,13,14.

Род Boechera является отличной моделью системы для изучения ключевых шагов апомиктическому воспроизводства. В Boechera, множество различных сексуальных и апомиктических присоединений были идентифицированы и могут быть использованы для сравнительного анализа 15,16,17. При сравнении типа клеток специфических Транскриптом клеток из женских зародышевых от сексуальных Arabidopsis и апомиктическому Boechera, мы идентифицировали гены и пути , которые дифференцированно выражены, выявляя тем самым новые аспекты регуляторных процессов , определяющих апомиксис 7. Кроме того, это исследование проверяется пригодность LAM для транскрипции типоспецифичной клеток анализ малых и редких типов клеток. Мы уже использовали этот протокол для анализа различных типов клеток в различных видов растений, но видо- и ткане-специфические модификации протокола может потребоваться в некоторых случаях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот протокол описывает подготовку тканей, с помощью лазера микродиссекции и экстракции РНК для транскрипции профилирования. Всегда используйте перчатки на протяжении всех этапов протокола. Исследование и рассмотреть инструкции по технике безопасности для каждого химического вещества, используемого. В частности, иметь в виду, что ксилола вредно и может проникать перчатки и что метанол является токсичным. Для всех используемых инструментов, пожалуйста, обратитесь к соответствующим руководствам пользователя.

1. Удаление РНКазы деятельности из стеклянной посуды и другого оборудования

  1. Перед использованием обернуть любую стеклянную посуду в алюминиевую фольгу Перед выпечкой в ​​течение ~ 8 ч при 180 ° С для обеспечения РНКазы качества.
  2. Лечить любые металлические поверхности (например, пара пинцетов), а также работа скамейка и нагревательная пластина с соответствующим обеззараживающим раствором РНКазы. После этого промойте поверхность с РНКазы водой, чтобы удалить обеззараживающим раствором. Затем очистите поверхности дополнительно с 70% этанола.
  3. Используйте все товарные объявленияTIC расходные материалы (например, трубы) совершенно новый без предварительной обработки. Если есть возможность, используйте пластиковые расходные материалы, которые сертифицированы быть РНКазы.

2. Ткань Фиксирование

  1. Приготовьте 10 мл фиксаторе фермера (3: 1, об / об этанол: уксусная кислота) в свежем 15 мл пробирку на льду. (Всегда готовьте закрепитель свежей Фермера перед использованием). В качестве альтернативы, несшивающий закрепителя этанол: уксусная кислота (5: 1 об / об) может быть использовано 18.
  2. Используйте тонкую пару пинцета, чтобы собрать почки на стадии развития интереса. Немедленно погрузите почки в ледяной закрепителя. Используйте 10 мл закрепитель для фиксации ~ 20 бутоны или цветы из Arabidopsis или Boechera Примечание. При использовании видов растений с более крупными цветами рекомендуется рассекать цветы с лезвием бритвы , чтобы генерировать более мелкие куски до фиксации.
    1. Для того чтобы получить зрелые гаметофиты, выхолостить 2 - 3-х крупнейших цветочных почек на inflorценции 2 дня до сбора урожая.
  3. Заполните дно эксикаторе со льдом. Откройте пробирки , содержащие образцы, например, цветы, и разместить их на льду, либо путем непосредственного ввода их в лед таким образом , что они не могут упасть или с помощью соответствующего держателя. Вакуумный просочиться в течение 15 мин до высвобождения вакуума.
    1. Повторите вакуумной пропитки один раз в течение 15 мин.
  4. Отпустите вакуума и хранить в течение ночи (~ 12 ч) на льду. Накройте ведро льда с фольгой крышкой или алюминиевой и хранить в ведро 4 ° C комнате или холодильник с тем чтобы предотвратить лед от таяния. Примечание: Продлите время фиксации не рекомендуется.

3. Ткань Вложение, Тонкий Секционирование и монтирование на слайдах для LAM

  1. Тканевая вложение.
    1. Заменить закрепитель до 70% этанола, полученного с чистым этанолом и РНКазы водой. Оставьте образцы на льду до дальнейшей обработки. Начало embedding образцов в тот же день. В случае , если нет ткани машинной обработки отсутствует, переходите к ручной вложении , как описано в другом месте 9,11 и перейдите к шагу 3.1.11.
    2. Аккуратно перенести образцы ткани на встраивание кассет с помощью пинцета. Плотно закройте кассеты. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Избегайте даже частичную сушку образца во время этого шага. Избегайте сдавливания образцов с помощью пинцета.
      Примечание: Для маркировки кассеты карандаш следует использовать, в идеале, написав на наклонной поверхности кассеты.
    3. Храните вложение загружена кассета с бутонами или цветами в 70% этанола, пока весь материал не передается на кассетах и ​​вложение машина может быть загружен. Для этой цели используют стекло окрашивающий корыто, заполненную 70% -ным этанолом.
    4. Извлеките корзины процессора ткани из реторты машины и передавать Вложение кассеты в корзину с наклонными поверхностями, обращенными верхнюю часть и в том же самом направлении. CRITical ШАГ: Выполняйте это быстро, чтобы предотвратить высыхание тканей. Если обработке большого количества встраивание кассет сразу, поместите корзину в соответствующую РНКазы емкость, наполненную 70% -ным этанолом до загрузки образцов.
    5. Положите крышку на корзину и поставил корзину обратно в реторты. Закройте реторты.
      Примечание: Процессор ткани автоматически обезвоживает образцы, изменения растворителя к ксилолы, и делает инфильтрацию с расплавленным парафином. Как правило, это делается в течение ночи.
    6. Запуск программы процессора ткани. Рекомендуемые стандартные настройки 1 час 70% этанола, в три раза 1 час 90% этанола, в три раза 1 час 100% этанола, два раза 1 час 100% ксилола, один раз 1 час 15 мин 100% ксилола при комнатной температуре, с последующей инфильтрацией парафином два раза в течение 1 часа и один раз в течение 3 часов при 56 ° C 11.
      Примечание: Для того, чтобы гарантировать, что блокировка станция готова с воском топленого, включите машину за несколько часов до начала илииспользовать функцию таймера, чтобы выбрать приблизительный время начала.
      Примечание: В случае, если ткань не может быть обработан сразу же после этого, более длительное время инкубации в парафин при температуре 56 ° С, возможно, вместо 3 ч при 56 ° С. Обратитесь к руководству по эксплуатации прибора. Как правило, кассеты с тканями автоматически остаются в расплавленном воске, пока команда "пустой реторты" не утвержден. Если воск не плавится при запуске процессора ткани, реторта заполняется 70% -ным этанолом, и программа остается на удержании, пока готов к запуску.
    7. Очищать реторту и немедленно передать образцы в восковую ванну парафина при температуре 56 ° С в блокирующем станции. Удалите крышку из корзины и покрывают парафином ванну блокирующей станции с крышкой.
    8. Ворсовые, как много свежих балансирующие подносы на поверхности блокирующего станции нагревали до 56 ° С, поскольку есть кассеты в корзине.
      Примечание: этанол-устойчивый постоянный маркер можно использоватьd, чтобы обозначить нижнюю часть балансировочных лотков. Не рекомендуется использовать Ацетон устойчивые перманентные маркеры.
    9. Использование блокировки станции, заполняют предварительно подогретый свежий пластиковый поднос с балансирования растопленным парафином при 56 ° C. Поднимите крышку парафиновой ванны, поднимите одну кассету только в то время, и передавать образцы из кассет для жидкого парафина при температуре 56 ° С в балансирующего лотке с помощью пинцета.
      ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Избегайте затвердевания воска, окружающей образец при обращении с кассеты, работая быстро.
      1. Поместите все образцы в соответствии с потребностями с помощью иглы препарат до затвердевания воска. Как правило, несколько цветов расположены в балансировочном лоток индивидуально разнесенных примерно на 1 см в каждом направлении.
      2. Повторите шаг 3.1.9, пока все образцы не передаются.
    10. Поместите корзинку обратно в процессор ткани и очистки реторты с помощью соответствующей программы (обратитесь к руководству пользователя).
    11. Выключите процессор ткани и блокировки станции. Перейдите к шагу 3.1.13.
    12. В случае, если нет ткани инфильтрация машина и не вложение станции не имеется, использовать нагревательную печь для плавления парафина при температуре 56 ° С. На скамейке, заполнить расплавленный воск в пластиковые лотки балансировки, передавать образцы в воск, а также использовать иглы подготовки для размещения образцов.
    13. Дайте парафин затвердевать при комнатной температуре в течение ~ 1 - 3 ч перед хранением образцов при температуре 4 ° С. Образцы могут быть впоследствии обработаны свеже или храниться в течение нескольких месяцев.
  2. Получение тонких срезов и горками для LAM.
    1. На светостоле осветительного блока воска снизу, удалить парафин с образцами из окружающих пластиковых лотках. Рассеките из квадратную воска блок , содержащий ткань, например., Бутон или цветок, используя РНКазы лезвие бритвы. Для этой цели всегда ориентировать образцы в направлении верхней части блока воска (также см Рисунок 1).
      1. Готовят восковые блоки всех образцов, которые должны использоваться для LAM в то время.
    2. Установите блоки для обработки встраивания кассеты, заполненные затвердевшего парафина: растопить небольшой кусочек или капли парафина на кончик соответствующего шпателя с использованием Этанол лампу и использовать горячий воск, чтобы зафиксировать блок на опоре (со встроенными тканей наверху).
      1. Дайте воску затвердеть в течение по меньшей мере 20 мин при температуре 4 ° С.
    3. Удалите излишки воска, охватывающую образец с лезвием бритвы на световом столе. Убедитесь в том , чтобы держать квадратную поверхность с параллельными краями (см рисунок 1).
    4. Установите нагревательную пластину на 42 ° C.
    5. Безопасное крепление образцов к микротома и подготовить 6 - 10 мкм толщиной секций. Обратитесь к инструкциям производителя для использования микротома. Примечание: В то время как более тонкие участки часто дают лучшее структурное разрешение, большее количество РНК ВЫСОКачество R может быть получен с более толстыми секциями. Для клетки Boechera зрелых гаметофиты мы используем 7 мкм в качестве значения по умолчанию. Перемещение довольно медленно с образцами над микротома нож часто приводит к улучшению гистологии.
    6. Всегда передавать парафиновой ленты на длине приблизительно 10 - 15 см в пластиковой коробке с черного картона в нижней части перед установкой их в LAM слайдами.
    7. Если это возможно, предварительно выбрать части парафиновых полосок , содержащих сотовом или ткани типа , представляющие интерес, например, яйцеклеток, под рассекает-рамки и отбросить все остальное.
  3. Подготовка слайдов для LAM.
    1. Поместите необходимое количество металлических каркасах слайдов (как правило, 5 - 10) с плоской поверхностью сверху на нагревательной пластине.
    2. Внесите ~ 1 - 2 мл РНКазы свободной воды на пластиковой части слайда. С помощью лезвия бритвы, вырезать парафиновые ленты в короткие отрезки около 4 - 5 см достаточно долго, чтобы охватить пластиковые окна. Uсе пинцета и иглы подготовки к идеально поместить парафиновые полоски параллельно друг другу на пластиковых окнах слайдов. Осторожно поднимите слайд на одном конце, чтобы удалить воду и поместите слайды обратно.
      1. В качестве альтернативы, поместите нагревательную пластину под химическим капотом. Нанесите небольшой объем метанола, в пластмассовой части ползуна только достаточного для смачивания поверхности (это может привести к небольшому гофрированностью слайдов). Поместите парафиновые полоски на слайдах.
        Примечание: Из соображений токсичности, избегать использования метанола, если это возможно. Тем не менее, использование метанола на этом этапе действительно улучшает качество РНК в случае качество достигается за счет установки на воде недостаточно. Стоит тестирования этих альтернатив на старте нового проекта, поскольку качество РНК достигается изменяется в зависимости от типа клеток и вида исследуемого.
    3. Высушить слайды на ночь на нагревательной пластине при 42 ° С в течение ~ 12 ч. Закройте нагревательный элемент спластиковая крышка, которая не соприкасается с горками. Убедитесь, что пластиковая крышка не препятствует обмену воздуха. С этой целью крышку можно поместить на пипетку коробки или аналогичные быть сняты.
      1. В качестве альтернативы, сократить время сушки до минимума двух часов или пока ткань появляется абсолютно сухой. Сокращение времени нарезка в коллекции может улучшить качество РНК.
    4. Под капотом химической, де-воск слайды 2 раза в течение 10 мин в ксилоле с использованием соответствующих держателей слайдов. Убедитесь, чтобы полностью погрузить пластмассовую часть каждого слайда только, но, чтобы позволить удаление слайда, прикоснувшись к более широкому концу металлической рамы, которая хранится сухой.
    5. Разрешить слайды высохнуть в течение ~ 10 мин под капотом химической предварительной до LAM.
      Примечание: Слайды не сразу обработанные может быть помещен обратно на нагревательной пластине при 42 ° С ткань лицевой стороной вверх до нескольких часов. Это предотвратит любую влажность от не ставя под угрозу качество РНК до дальнейшей обработки.

4. помощью лазера микродиссекция (LAM)

Примечание: Процедура LAM будет меняться в зависимости от используемого инструмента. Некоторые детали этого протокола адаптированы к конкретному инструменту и технологии сбора образцов на использовании Колпачок решений электростатических сил. Кроме того, детали могут различаться даже между разными версиями программного обеспечения. Пожалуйста, обратитесь к инструкциям производителя и руководств пользователя для подробного описания и инструкции по инструменту и программному обеспечению.

  1. Включите устройства для LAM (компьютер, микроскоп, блок управления лазера).
  2. Запустите программу рулевого микроскопа и лазера.
  3. Включите лазер, нажав на соответствующую кнопку на панели управления.
  4. Поместите колпачок (0,5 мл, без рассеивателя) в держатель колпачка и поместите его в приборе.
  5. Поддержка LAM слайд с стекло для микроскопии. Убедитесь в том, что плоская поверхность с горкойТкань крепится обращена к предметное стекло.
  6. Поместите слайд в приборе с предметное стекло под ним.
  7. Выберите Цель 4X. В программе, выберите, чтобы переместить крышку в положение "вверх" и продолжить, чтобы сделать сканирование слайдов.
  8. Провести поиск слайда и определить структуры, представляющие интерес. Точечные и сохранить свои позиции на слайде, чтобы иметь возможность вернуться к точному положению на стадии резки.
  9. Выберите подходящую цель (например , 40X или 60X).
  10. При необходимости регулировать скорость работы лазера, фокус и мощность лазера, а также откалибровать сценическое движение, обращаясь к руководству пользователя прибора. После того, как настройки учетной записи для конкретной интересующей ткани, параметры могут быть использованы повторно.
  11. Проверьте положение лазера с помощью одного выстрела, нажав на кнопку "лазерный выстрел" программы, в идеале в части мембраны без ткани.
    1. При необходимости калибровки лазера позиции, следуя йИнструкция е изготовителя для инструмента.
  12. Проверьте калибровку объектива, сдвинув очевидную структуру для всех четырех углов окна программного обеспечения на мониторе, удерживая правую кнопку мыши нажатой. Убедитесь, что положение руки относительно очевидной структуры одинакова во всех четырех углах. В противном случае калибровки цели следующие инструкции программного обеспечения.
  13. С крышкой в "вниз" положение, используйте инструмент "рука пера" , чтобы обозначить границы типа клеток или ткани , представляющей интерес, например, яйцеклетки. Рассеките клеток, представляющих интерес с лазером, нажав 'вырезать'. Примечание: Часто, секционирования необходимо повторить, если граница вокруг ячейки не была полностью расчленены сразу. В этом случае рекомендуется, чтобы установить программное обеспечение автоматически делать два повторы секции в качестве стандарта.
  14. Поднимите крышку и перейти к следующей сохраненной позиции со структурой, представляющей интерес. Повторите шаг 4.13процедуры рассекать в следующих разделах клеток, пока все клетки интерес от одного слайда не собираются. Убедитесь, что крышка расположена таким образом, что новая секция прилипает к пустой позиции на крышке.
    Примечание: Рекомендуется изолировать больших кусков ткани (например, участки целых цветков или его частей) от каждого слайда после выделения участков одиночных клеток на свежей крышкой. Они могут быть использованы для контроля качества РНК.
  15. Удалить слайд и перейдите к следующему слайду, повторяя шаги 4.4 - 4.9 и 4.13 до 4,14.
  16. Повторите шаг 4,15 и связанные с ними действия, пока типы клеток интерес со стороны всех слайдах были изолированы. Примечание: Не рекомендуется собрать дольше, чем ~ 4 - 5 часов на той же крышкой.
  17. Осмотрите поверхность крышки после того, как LAM, чтобы исключить неспецифические загрязнения образца. В то время как не-рассеченные ткани защищены фольгой, пыль может прилипать к поверхности за счет электростатического сцепления.
    1. TO визуально осмотреть крышку, выньте слайд из прибора. Поместите держатель крышки в положении "вниз" и осмотрите поверхность с целью 4X.
    2. В случае небольшие кусочки пыли видны, удалите их с небольшим (2 мкл) пипетки. В качестве альтернативы, установите затвор назад на инструменте, установите крышку на свободной части слайда (без ткани), и полностью уничтожить загрязнения с помощью лазера.
  18. Закрыть колпачки и заморозить сухие участки при температуре -80 ° С до дальнейшего использования. При необходимости образцы могут храниться в течение нескольких недель. Тем не менее, быстро идет на этом этапе рекомендуется.

5. Выделение РНК и контроль качества

Примечание: РНК может быть выделена с помощью любого способа, подходящего для небольших количеств РНК. В данном протоколе, использование набора для выделения РНК, указанного для небольших количеств РНК описывается. Следуйте инструкциям производителя.

  1. С помощью пробирки с образцом, прикрепленной кколпачок либо непосредственно, либо после удаления от -80 & deg; С.
    1. Открыть пробирки и тщательно пипеткой 11 мкл буфера для экстракции к стенке каждой трубки с помощью подсказок фильтра. Изменение советы между образцами.
    2. Закройте крышку и встряхнуть буфера для экстракции вниз к крышке трубки.
    3. Место труб с цоколем вниз в нагревательную печь, предварительно нагретую до 42 ° C. Выдержите в течение 30 мин, следуя инструкциям изготовителя.
  2. Следуйте инструкциям производителя для подготовки колонки и сбора экстракта в нижней части труб.
    1. Если материал, из более чем одного колпачка должна быть объединены в одну выборку, выполните шаги 5.1.1 - 5.1.2 индивидуально для каждой трубки / колпачка.
    2. Затем, бассейн выдержки для одного образца в одной пробирке и измеряют количество объединенном экстракта с помощью пипетки перед добавлением эквивалентного количества этанола (см инструкции изготовителя).
    3. Убедитесь, что количество EtОН добавлены перед загрузкой колонку равно объему объединенном экстракта.
    4. После осаждения РНК с этанолом, быстро перейти к загрузке колонн следующих инструкций изготовителя. Продолжить протокол с стадии центрифугирования 100 XG.
    5. После того, как содержимое каждой коллекторной трубы были пропускают через колонку, выполнить шаг центрифугирования 16 000 мкг в течение 30 секунд, чтобы удалить инструкции проточный следующего производителя.
    6. Продолжить с экстракции РНК и очистки, следуя инструкциям изготовителя.
    7. После загрузки буфера для элюции в колонке позволяет колонке инкубировать в течение 1 мин. Продолжайте загружать пробирки в центрифугу, следуя инструкциям в инструкции изготовителя. Примечание: дополнительный шаг центрифугирования в течение 1 мин при 100 мкг до элюирования, как указано в протоколе может повысить эффективность элюции.
  3. Извлечение РНК из продРОЛС (большие срезах ткани) для контроля качества РНК следующие шаги 5.1 до 5.2.7 настоящего протокола.
  4. Для РНК нагрузки контроля качества 1 мкл неразбавленной суммарную РНК каждого контрольного образца на Bioanalyzer с использованием РНК-Pico Chip в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Извлеченный РНК можно использовать для линейного усиления и анализа транскриптом с использованием микрочипов или РНК-Seq 7,11,13,14. В идеале контроль качества следует указать РНК Целостность Число (RIN) , по меньшей мере , 7. Ряд поставщиков обеспечивают подходящие наборы для амплификации, подходящие примеры приведены в 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Подготовка проб и LAM сделаны в последовательных шагов

Ряд последовательных шагов , которые необходимы для подготовки РНК для транскрипции анализа из выбранных типов клеток по LAM (рисунок 1). Это начинается с урожаем цветов и немедленной фиксации, чтобы гарантировать, что популяция РНК остается неизменным после сбора урожая. Ткань вложен, разрезали, и смонтированный на салазках. Это позволяет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол подходит для различных мобильных и типов тканей

LAM в сочетании с транскриптом анализа с помощью микрочипов или РНК-Seq является ценным инструментом , чтобы получить представление о специфических форм активности генов , регулирующих развитие организма или физиологические процессы 7-11,13,14. Однако пригодность этого метода для любого данного типа клеток критически зависит от структурных вопросов. Клетка должна быть четко видна и однозначно идентифицируемы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Тимоти Ф. Шарбеля (IPK Gatersleben) за предоставление семян Boechera divaricarpa и Шэрон Кесслер (Университет Оклахомы) за критическое чтение и корректуру. Работа по анализу транскриптомов по типам клеток для изучения развития гаметофитов и апомиксиса в лаборатории UG поддерживается Цюрихским университетом, стипендией "Deutsche Forschungsgemeinschaft" и проектом Марии Кюри IDEAGENA to AS, грантами от "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" в рамках COST action FA0903 (для UG и AS) и Швейцарского национального фонда (для UG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЭтанолVWR1,009,861,000абсолютный EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 мл сокол центрифужные пробиркиVWR62406-200
2100 БиоанализаторAgilentG2939AA
уксусной кислотойАпличемA3686,2500100% Молекулярная биология класс
Ambion Нуклеаза без водытехнологии жизни AM9932
ASP200 SLeica14048043624тканевый процессор 
черный картонможно приобрести в специальных бумажных магазинах
DNA- и RNAse-free Frame SlidesMicro Dissect GmbH1, 4µ м ПЭТ-мембрана; также можно приобрести у Leica
Dumond ЩипцыActimed0208-5SPSF-PS
этаноловую лампу
эксиккаторSigma-AldrichZ354074-1EANalgene Vaccuum Dessicator или аналогичное оборудование
наконечники 10  &микро; lAxon Lab AGAL60010может быть заменен аналогичными наконечниками
фильтра наконечников 1,000  &микро; lAxon Lab AGAL60010может быть заменен на аналогичные наконечники
фильтра наконечников 20  &микро; lAxon Lab AGAL60020может быть заменен на аналогичные наконечники
фильтр наконечников 200  &микро; lAxon Lab AGAL60200может быть заменен на аналогичные наконечники
щипцами прецизионныйVWE232-1221
стеклянный держатель предметного стеклаHuber & Co.AG10.0540.01Fä rbekä стекловитер sten nach Hellendahl
Huber& Co.AG10.0570.01Fä rbekasten
Модуль встраивания парафина с подогревом LeicaLeica LeicaEG 1150 Hблокирующая станция, аналогичные устройства подходят
Нагревательно-сушильный столMedax15501другие модели и/или поставщики подходят
ведро для льдаVWR ведро для льда с крышкой 10146-184аналогичные ведра одинаково подходят
светлый столУВП Ан Аналитическая Йена фирмыTW-26 Транслюминатор белого света
предметное стекло для микроскопаThermo Scientific10143562CEлезвие
для микротомаThermo ScientificFEAHS35S35 лезвие для микротома одноразовый
MMI Cell Cut Plus InstrumentMMI (Molecular Machines and Industries)
Антипригарный, не содержащий РНК микрофуг-пробирки, 2 млтехнологии AM12475
Paraplast X-TRARothX882.2для гистологии
PicoPure RNA Isolation Kitlife technologiesKIT0204Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
пластиковые балансировочные лоткиSemadeni AG2513
пластиковый ящикSemadeni AG2971Plastikdose PS
пластиковая крышка для нагрева пластинысамодельная
игла для приготовленияVWR631-7159
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
РНКаза без микрофугетехнологии жизниAM12400
РНКаза ZAP Раствор для обеззараживанияжизненных технологий AM9780
Полуавтоматический ротационный микротом Одинаково подходят аналогичные приборыLeicaRM2245
Кассеты Tissue Loc Histo Screen ThermoScientificC-1000_AQаналогичные кассеты других поставщиков
Трубки с клейкой крышкой, без диффузора 500 &; l MMI (Molecular Machines and Industries)50204
Xylol (Isomere) ROTIPURANVWR4436.2мин. 99%, p.a., ACS, ISO SP
процесс встраивания кассетLeica14039440000Leica Jet Cassette I без крышки
Универсальная духовкаMemmertUF55другие модели и/или поставщики подходят
фильтрующие пищи пробирок

Ссылки

  1. Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
  3. Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
  4. Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
  5. Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
  6. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
  7. Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476(2014).
  8. Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
  9. Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
  10. Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
  11. Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
  12. Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
  13. Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).
  14. Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685(2012).
  15. Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
  16. Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
  17. Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
  18. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
  19. Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Boechera

Похожие статьи