Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Развитие

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53974

⸱

10 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем разработку и применение анализа сокращения геля для оценки сократительной функции в мезенхимальных клетках, которые подверглись эпителиально-мезенхимальному переходу.

Аннотация

Фиброз часто участвует в патогенезе различных хронических прогрессирующих заболеваний, таких как интерстициальная болезнь легких. Патологическим признаком является образование фибробластических очагов, что связано с тяжестью заболевания. Предполагается, что мезенхимальные клетки, состоящие из фибробластических очагов, происходят из нескольких клеточных источников, включая первоначально резидентные внутрилегочные фибробласты и циркулирующие фиброциты из костного мозга. В последнее время предполагается, что мезенхимальные клетки, подвергшиеся эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП), также вносят свой вклад в патогенез фиброза. Кроме того, ЭМП может быть индуцирована путем трансформации фактора роста β, а ЭМП может быть усилена провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли α. Анализ на сокращение геля является идеальной моделью in vitro для оценки сократительной способности, которая является одной из характерных функций фибробластов и способствует заживлению ран и фиброзу. В данной работе продемонстрирована разработка анализа сокращения геля для оценки сократительной способности мезенхимальных клеток, подвергшихся ЭМП.

Введение

Фиброз участвует в патогенезе различных хронических прогрессирующих заболеваний, таких как интерстициальный заболевания легких, сердечный фиброз печени , цирроз печени, терминальной почечной недостаточности, системный склероз, и аутоиммунные заболевания 1. Среди интерстициальных заболеваний легких, идиопатический легочный фиброз (IPF) представляет собой хроническое прогрессирующее заболевание, и показывает плохой прогноз. Патологический признак IPF является развитие фибробластической очагов, состоящий из активированных фибробластов и миофибробластов, которые связаны с прогнозом. Истоки таких легочных фибробластов предлагается быть получены из нескольких мезенхимальных клеток, в том числе легочных фибробластов, первоначально резидентных и циркулирующих фиброциты из костного мозга. В последнее время был предложен переход эпителиально-мезенхимальной (ЕМТ), связаны с образованием клеток мезенхимы 2, и внести свой ​​вклад в патогенез фиброзных заболеваний.

Считается, что чемпионат ЕвропыТ играет важную роль в процессе развития плода, заживление ран, а также прогрессирование рака, в том числе опухолевой инвазии и метастазирования 3. После процесса EMT, эпителиальные клетки получают способность мезенхимальных клеток потерей эпителиальных маркеров, таких как Е-кадгерина, и экспрессии маркеров мезенхимальных, таких как виментину и α-актин гладких мышц (SMA) 4,5. Предыдущие исследования показали , доказательства того, что процесс ЕМТ был связан с развитием фиброза тканей в почках 6 и 7 легких. Кроме того, хроническое воспаление способствует болезни фиброзный 8; Кроме того, такие цитокины , как фактор некроза опухоли надсемейства элемента 14 (TNFSF14, свет), фактор некроза опухолей (ФНО), и интерлейкин-1 & beta ; , было показано , что повышение EMT 9-12.

сокращение анализа коллагеновый гель, коллаген на основе сжатия клеток для анализа, в котором фибробласты встроены в типа Iколлагеновый гель трехмерно, является идеалом в пробирке модель для оценки сократительной способности . Сократимость является одной из характерных функций фибробластов и способствует нормальному заживлении ран и фиброза 13. В этом анализе, полагают, что присоединение фибробластов типа коллагена через интегрин-зависимые механизмы, как предполагается производить механические напряжения при определенных условиях, и, следовательно, приводит к сжатию ткани.

Здесь, развитие анализа гель сжатия, как сообщается, адаптированный для оценки приобретения сократительной функции в клетках, прошедших ЕМТ. Этот отчет показывает, что этот модифицированный тест предназначен для оценки сократительной в мезенхимальных клетках, подвергшихся EMT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка и культура легких эпителиальных клеток

  1. Культура A549 эпителиальные клетки легких человека (прилипший линия клеток) в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
  2. Удаляют среды для культивирования клеток от культуральной чашки и мыть один раз с 5 - 10 мл фосфатно-буферного раствора (PBS). После промывания, немедленно аспирация PBS.
  3. Добавить 2 мл трипсин / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,05%) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 мин.
  4. Собирают обособленные клетки в центрифужные пробирки, содержащие среду для культивирования клеток, центрифугируют пробирки при комнатной температуре в течение 4 мин при 150 × г.
  5. Ресуспендируют клетки осадок в 2 мл культуральной среды клеток и удалить образец для подсчета клеток. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра с трипановым синим красителем, чтобы проверить жизнеспособность клеток.
  6. Семенной клетки А549 на10 см полистирола пластины с плотностью 0,5 - 1,0 × 10 6 клеток / блюдо с 10 мл среды для геля сжатия анализа. Семенной клеток на 6 - луночные полистироловые планшеты при плотности 0,5 - 1,0 × 10 5 клеток / лунку с 2 мл среды для EMT подтверждения. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов.

Процедура 2. EMT

  1. Добавьте 10 мкл TGF- 1 (5 мкг / мл) и 10 мкл TNF-alpha (10 мкг / мл) к пластине для геля сжатия анализа высевают на этапе 1.6. Добавляют 2 мкл TGF- 1 (5 мкг / мл) и 2 мкл TNF-alpha (10 мкг / мл) к пластине для EMT подтверждения высевают на шаге 1.6. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 часов.

3. Подтверждение EMT процедуры с помощью ПЦР и Вестерн-блоттинга

  1. Подтвердите изменение морфологии (от булыжник-как шпинделем форму) обработанных клеток с использованием фазово-контрастной микроскопии.
    Примечание: NormКлетки А549 ал имеют булыжник вид камнеподобное и треугольной формы , которая является характеристикой эпителиальных клеток, но после стимуляции TGF- 1 и TNF-alpha, клетки появляются длинные и шпиндель формы , который похож на мезенхимальные клетки 14,15.
  2. Оценка экспрессии эпителиального маркера, такие как E-кадгерина, и мезенхимальные маркеры, такие как N-кадгерина, виментину и альфа-актин гладких мышц с использованием ПЦР или Вестерн-блоттинга.
    1. Экстракт тотальной РНК из клеток с использованием набора для экстракции РНК 16 и синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы 17 в соответствии с протоколом производителя.
    2. Измерьте экспрессию уровней мРНК с использованием системы в реальном масштабе времени PCR 18 и мономерный цианиновый краситель ПЦР - комплект в соответствии с инструкциями производителя. Специфические праймеры для GAPDH (глицеральдегид - 3-фосфат - дегидрогеназа), ACTA2 (альфа-актин-2), CDH1 (кадгерин-1, E-кадгерина), и ВИМ (Виментин), приведены в таблице 1 , .
    3. Лизировать клетки , используя буфер для лизиса (таблица 2) , содержащий 1% ингибиторов протеаз. Измерить все концентрации образца белка с помощью анализа белка набор 19,20, и применять те же количества белка в полиакриламидном геле.
      1. Выполнить SDS гель-электрофореза и полусухого переноса белков на PVDF мембрану 21. Инкубируйте мембрану с первичными антителами в блокирующем буфере в течение 1 - 2 ч. После инкубации промыть дважды мембрану с промывочным буфером и инкубировать 1 час мембрану со вторыми антителами.
        Примечание: Смотрите таблицу Материалы / Оборудование для антител и разведений, используемых в этих исследованиях. В таблице 2 компонентов блокирующего буфера.
      2. Промойте мембрану с буфером для промывки дважды. Сфотографируйте мембраны с Вестерн - блоттинга комплект обнаружения 22 с использованием холодного CCD камеры 11,23.

4, Гель Сужение анализа для оценки EMT

  1. Аспирируйте кондиционированной среды из сосуда для культивирования клеток, а также стирать с 5 - 10 мл PBS для удаления мертвых клеток. После промывания, немедленно аспирация PBS.
  2. Добавляют 2 мл 0,05% трипсина / EDTA и инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 мин.
  3. Собирают обособленные клетки в центрифужные пробирки, содержащие DMEM, с ингибитором трипсина (1 мг / мл), центрифугу трубках, дополненной при комнатной температуре в течение 4 мин при 150 & bull; g.
  4. Смешайте тип 1 коллаген гель с дистиллированной водой, и 4 × концентрированные DMEM для регулировки громкости для достижения концентрации коллагена в 1,75 мг / мл, и 1 × концентрация DMEM. Не забудьте сохранить гелевой среды на льду во время этого шага.
    Примечание: Для того, чтобы 6 мл гелевой среды, хорошо перемешать 3,5 мл 1 типа коллагена геля (3 мг / мл), 1,5 мл 4 × концентрированного DMEM и 1 мл дистиллированной воды.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS и удалить образец для подсчета клеток. подсчитыватьчисло клеток с помощью гемоцитометра с трипановым синим красителем, чтобы проверить жизнеспособность клеток.
  6. Добавьте гелевой среды , чтобы отрегулировать громкость для достижения плотности клеток 3,0 × 10 5 клеток / лунку (6,0 × 10 5 клеток / мл) и осторожно , но быстро смешать его с помощью пипетки без гелеобразования.
  7. Разливают 0,5 мл смеси в каждую лунку 24-луночного необработанной пластиной быстро и аккуратно, чтобы сделать аккуратную цилиндрическую форму. Будьте осторожны , чтобы не допустить любые воздушные пузырьки загрязнять гели (Рис . 1А)
    Примечание: Носитель гель, содержащий клетки является вязким и может легко гель и форма серповидную форму в скважине.
  8. Инкубируйте планшет в течение 15 минут в кювете инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2 и 95% влажности в гель полностью.
  9. Отделить гели из пластинки, не нарушая путем перемещения стерилизованного шпателя таким образом, чтобы нарисовать окружность в одном направлении. С помощью шпателя, аккуратно передать гели до 60 мм чашки для культивирования тканейсодержащий 5 мл DMEM / 1% FBS с добавлением или без TGF- 1 (5 нг / мл) и TNF-alpha (10 нг / мл).
  10. Осторожно потрясите посуду, чтобы обеспечить гели плавающей на носителе. Выдержите в сотовом инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 и 95% влажности.

5. Измерение размера геля

  1. Измерьте размер коллагеновый гель после того, как 0, 24, 48, и 72 ч с использованием системы анализа изображений.
    1. Включите систему гель документации (Рисунок 2A), и поставить посуду в шкаф экранирования света. Затем снять крышку посуды в шкафу.
    2. Откройте соответствующее программное обеспечение гель анализирующее. Нажмите на кнопку "захвата изображений" в меню-бар, чтобы показать образ гелей в шкафу. Затем нажмите кнопку «захватит» в строке меню , чтобы делать снимки гелей (рис 2В).
    3. Нажмите на кнопку "обнаружения" в строке меню (Рисунок 2C) и отрегулировать область измерения (желтый круг яп Рис 2С) путем перетаскивания мышью. Затем нажмите кнопку "автоматического обнаружения" в строке меню (см кнопку на рисунке 2D). Программное обеспечение автоматически определяет гели , показывающие Heatmap (рис 2D).
    4. Нажмите кнопку "OK" , чтобы извлечь контур гелей путем обработки изображений и расчета областей , окруженными контура (рис 2E). После того, как область рассчитывается, расчетная область отображается в отдельном всплывающем окне.
      Примечание: Если гели накладываются друг на друга во время формирования изображения, перемещать гели осторожно с помощью стерильной пипетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Во время EMT, эпителиальные клетки теряют эпителиальные маркеры, такие как E-кадгерина, и получить экспрессию маркеров мезенхимальных, таких как виментин и α-актин гладких мышц 4,5. Инкубация человека A549 легочных эпителиальных клеток с TGF- 1 и TNF-a индуцирует EMT. Появление нормальных клеток А549 являются булыжник камень образную форму и форму треугольника , который является характеристикой эпителиальных клеток (рис 3 , а ), но после того, как стимулировал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол разработан в данном исследовании, включает в себя два этапа. Первый шаг выполняется, чтобы побудить EMT, а второй стадией является анализ гель сжатия. Так как это важно, чтобы подтвердить, что клетки прошли EMT, шаг 2 обеспечивает превосходное дополнение к морфологическим и генных изменений экспрессии. Предыдущие исследования показали , что ЕМТ из клеток A549 индуцировали только 24 TGF- 1; Тем не менее, как мы уже сообщали ранее 10, TNF-α обработка повышает EMT и приобретение маркеров мезе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Тадаси Кояму за техническую помощь. Эта работа была частично поддержана грантами JSPS KAKENHI Grants Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; грант Исследовательской группе по дыхательной недостаточности от Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии; грант на исследования в области аллергических заболеваний и иммунологии, Япония.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMsigma aldrich11965-092Для A549 средний
FBSGIBCO10437
Трансформирующий фактор роста-β 1, Человек, рекомбинантныехимикаты Wako Laboratory209-16544
Рекомбинантные человеческие TNF-αНИР D systems210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAbCell Signaling Technology#31951:3,000 разведение
Vimentin (D21H3) Rabbit mAbCell Signaling Technology#57411:3,000 разведение
Anti-α-Tubulin антителаsigma aldrichT90261:10,000 разведение
Моноклональный анти-актин, α-антитела к гладким мышцам& НБСП;sigma aldrichA52281:10,000 разведение
Анти-N-кадгериновое антителоBD Transduction Laboratories#6109201:1,000 разведение
Анти-мышиный IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (вторичное антитело)GE HealthcareNA931-100UL1:20,000 разведение
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (вторичное антитело)GE HealthcareNA934-100UL1:20,000 разведение
Блокирующий реагентGE HealthcareRPN4182% в TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Trained Multiwell Cell Culture Plate, с крышкойcorning# 353046
100 мм Чашка для клеточной культурыTPP# 93100
DMEM, технологиипорошковой жизни12100-046Для 4& раз; DMEM
Тип 1 коллагеновый гельНитта ЖелатинCellmatrix тип I-A
24 Лунка Клеточная культуральная пластинаAGC TECHNO GLASS1820-024
Система документирования геля ATTOAE-6911FXNГелевый имиджер
Программное обеспечение для анализа геляATTODensitograph, версия 3.00Программное обеспечение для анализа в комплекте с AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05%), фенол-красныетехнологии жизни25300054
24 луночными планшетами, необработанныйIWAKI1820-024
Трипановый синий раствор, 0,4%Технологии Life15250-061
Набор для экстракции РНКQiagen74106
Технологии обратной транскриптазы18080044
Система ПЦР в реальном времениStratageneMx-3000P
SYBR зеленый набор для ПЦРQiagen204145
Коктейль ингибиторов протеазы (100x)life technologies78429
PVDF мембранаATTO2392390
Набор для анализа белкаbio-rad5000006JA 
Полиакриламидный гельATTO2331810
Западный реагент для обнаружения блоттингаGE HealthcareRPN2232
Холодная ПЗС-камераATTOEz-Capture MG/ST
Ингибитор трипсинаsigma aldrichT9003-100MG
Полиоксиэтилен (20)Сорбитан МонолауратWako Лабораторные химикаты163-11512
Полиоксиэтилен (9) октифениловый эфирWako Laboratory химикаты141-08321

Ссылки

  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

TGF 1TNFA549
Развитие
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.