Развитие In Vitro Анализ для оценки сократительной функции мезенхимальных клеток, перенесшей Эпителиальные-мезенхимальных переходной

Summary

Здесь мы описываем разработку и применение анализа сокращения геля для оценки сократительной функции в мезенхимальных клетках, которые подверглись эпителиально-мезенхимальному переходу.

Abstract

Фиброз часто участвует в патогенезе различных хронических прогрессирующих заболеваний, таких как интерстициальная болезнь легких. Патологическим признаком является образование фибробластических очагов, что связано с тяжестью заболевания. Предполагается, что мезенхимальные клетки, состоящие из фибробластических очагов, происходят из нескольких клеточных источников, включая первоначально резидентные внутрилегочные фибробласты и циркулирующие фиброциты из костного мозга. В последнее время предполагается, что мезенхимальные клетки, подвергшиеся эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП), также вносят свой вклад в патогенез фиброза. Кроме того, ЭМП может быть индуцирована путем трансформации фактора роста β, а ЭМП может быть усилена провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли α. Анализ на сокращение геля является идеальной моделью in vitro для оценки сократительной способности, которая является одной из характерных функций фибробластов и способствует заживлению ран и фиброзу. В данной работе продемонстрирована разработка анализа сокращения геля для оценки сократительной способности мезенхимальных клеток, подвергшихся ЭМП.

Introduction

Фиброз участвует в патогенезе различных хронических прогрессирующих заболеваний, таких как интерстициальный заболевания легких, сердечный фиброз печени , цирроз печени, терминальной почечной недостаточности, системный склероз, и аутоиммунные заболевания ^1. Среди интерстициальных заболеваний легких, идиопатический легочный фиброз (IPF) представляет собой хроническое прогрессирующее заболевание, и показывает плохой прогноз. Патологический признак IPF является развитие фибробластической очагов, состоящий из активированных фибробластов и миофибробластов, которые связаны с прогнозом. Истоки таких легочных фибробластов предлагается быть получены из нескольких ме....

Protocol

1. Подготовка и культура легких эпителиальных клеток

1. Культура A549 эпителиальные клетки легких человека (прилипший линия клеток) в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
2. Удаляют среды для культивирования клеток от культуральной чашки и мыть один раз с 5 - 10 мл фосфатно-буферного раствора (PBS). После промывания, немедленно аспирация PBS.
3. Добавить 2 мл трипсин / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (0,05%) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 3 мин.
4. Собирают обособленные клетки в центри....

Results

Во время EMT, эпителиальные клетки теряют эпителиальные маркеры, такие как E-кадгерина, и получить экспрессию маркеров мезенхимальных, таких как виментин и α-актин гладких мышц ^4,5. Инкубация человека A549 легочных эпителиальных клеток с TGF- 1 и TNF-a индуцирует EMT. Появление нормальных клеток А549 являются булыжник камень образную форму и форму треугольника , который является характеристикой эпителиальных клеток (рис 3 , а ), но после того, как стимулировал.......

Discussion

Протокол разработан в данном исследовании, включает в себя два этапа. Первый шаг выполняется, чтобы побудить EMT, а второй стадией является анализ гель сжатия. Так как это важно, чтобы подтвердить, что клетки прошли EMT, шаг 2 обеспечивает превосходное дополнение к морфологическим и генных изменений экспрессии. Предыдущие исследования показали , что ЕМТ из клеток A549 индуцировали только ²⁴ TGF- 1; Тем не менее, как мы уже сообщали ранее ^10, TNF-α обработка повышает EMT и приобретение маркеров мезе.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	Для A549 средний
FBS	GIBCO	10437
Трансформирующий фактор роста-β 1, Человек, рекомбинантные	химикаты Wako Laboratory	209-16544
Рекомбинантные человеческие TNF-α	НИР D systems	210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#3195	1:3,000 разведение
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#5741	1:3,000 разведение
Anti-α-Tubulin антитела	sigma aldrich	T9026	1:10,000 разведение
Моноклональный анти-актин, α-антитела к гладким мышцам& НБСП;	sigma aldrich	A5228	1:10,000 разведение
Анти-N-кадгериновое антитело	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1,000 разведение
Анти-мышиный IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (вторичное антитело)	GE Healthcare	NA931-100UL	1:20,000 разведение
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (вторичное антитело)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20,000 разведение
Блокирующий реагент	GE Healthcare	RPN418	2% в TBS-T
6 Well Clear Flat Bottom TC-Trained Multiwell Cell Culture Plate, с крышкой	corning	# 353046
100 мм Чашка для клеточной культуры	TPP	# 93100
DMEM, технологии	порошковой жизни	12100-046	Для 4& раз; DMEM
Тип 1 коллагеновый гель	Нитта Желатин	Cellmatrix тип I-A
24 Лунка Клеточная культуральная пластина	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Система документирования геля	ATTO	AE-6911FXN	Гелевый имиджер
Программное обеспечение для анализа геля	ATTO	Densitograph, версия 3.00	Программное обеспечение для анализа в комплекте с AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0,05%), фенол-красные	технологии жизни	25300054
24 луночными планшетами, необработанный	IWAKI	1820-024
Трипановый синий раствор, 0,4%	Технологии Life	15250-061
Набор для экстракции РНК	Qiagen	74106
Технологии обратной транскриптазы		18080044
Система ПЦР в реальном времени	Stratagene	Mx-3000P
SYBR зеленый набор для ПЦР	Qiagen	204145
Коктейль ингибиторов протеазы (100x)	life technologies	78429
PVDF мембрана	ATTO	2392390
Набор для анализа белка	bio-rad	5000006JA
Полиакриламидный гель	ATTO	2331810
Западный реагент для обнаружения блоттинга	GE Healthcare	RPN2232
Холодная ПЗС-камера	ATTO	Ez-Capture MG/ST
Ингибитор трипсина	sigma aldrich	T9003-100MG
Полиоксиэтилен (20)Сорбитан Монолаурат	Wako Лабораторные химикаты	163-11512
Полиоксиэтилен (9) октифениловый эфир	Wako Laboratory химикаты	141-08321