Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Циклогексимид Chase Анализ белка Деградация в

29.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53975

⸱

18 апреля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

В этой статье

Краткое содержание

Обилие белка отражает скорость как синтеза белка, так и его деградации. В данной статье описывается использование циклогексимида Chase с последующим вестерн-блоттингом для анализа деградации белка в модельном одноклеточном эукариоте Saccharomyces cerevisiae (почковающиеся дрожжи).

Аннотация

Регулирование белкового изобилия имеет решающее значение для практически во всех клеточных процессов. Белок обилие отражает интеграцию темпов синтеза белка и деградации белка. Многие анализы отчетов о белка изобилии (например, одноразовая точка западной блоттинга, проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии, или репортер анализов на основе роста) не допускают дискриминации относительных последствий перевода и протеолиза на уровне белка. В данной статье описывается использование циклогексимид погони с последующим вестерн - блоттинга , чтобы конкретно проанализировать деградацию белков в модели одноклеточных эукариот, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи). В этой процедуре, дрожжевые клетки инкубируют в присутствии ингибитора поступательные циклогексемида. Аликвоты клеток собирают сразу после того, как и в определенные моменты времени после добавления циклогексемида. Клетки лизируют и лизаты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле FOг вестерн-блот анализ белка обилии в каждый момент времени. Процедура циклогексимид Чейза позволяет визуализировать кинетику разложения устойчивого состояния популяции различных клеточных белков. Эта процедура может быть использована для изучения генетических требований к и влияния окружающей среды на деградацию белка.

Введение

Белки выполняют важные функции практически во всех клеточных процессов. Многие физиологические процессы требуют присутствия определенного белка (или протеинов) в течение определенного периода времени или при определенных обстоятельствах. Поэтому Организмы контролировать и регулировать белковый изобилие для удовлетворения потребностей клеточных 1. Например, циклины (белки, контролирующие деление клеток) присутствуют в определенных фазах клеточного цикла, а потеря регулируемых уровней циклин было связано с образованием злокачественных опухолей 2. В дополнение к регулированию уровня белка для удовлетворения потребностей клеточные, клетки используют деградационных механизмов контроля качества , чтобы устранить неправильно упакованные, несобранные или иным образом отклоняющиеся белковые молекулы 3. Контроль белка изобилии включает в себя регулирование как синтеза макромолекул (транскрипции и трансляции) и деградации (распада РНК и протеолиз). Нарушение или чрезмерная деградация белков способствует множественных патологий, В том числе рак, кистозный фиброз, нейродегенеративных состояний, а также сердечно - сосудистые расстройства 4-8. Поэтому Протеолитические механизмы представляют собой перспективные терапевтические мишени для целого ряда заболеваний , 9-12.

Анализ белков в одной точке времени (например, с помощью Вестерн - блоттинга 13, проточной цитометрии 14 или флуоресцентной микроскопии 15) обеспечивает снимок устойчивого состояния белка изобилии , не раскрывая относительный вклад синтеза или деградации. Кроме того , на основе роста репортер анализы отражают устойчивые уровни белка в течение длительного периода времени , не различая между влияний синтеза и деградации 15-20. Можно сделать вывод о вкладе дегенеративных процессов до уровня устойчивого состояния белка путем сравнения численности до и после ингибирования конкретных компонентов механизма деструктивных (например, фармакологически инактивировать PROTEasome 21 или выбивания ген гипотетически необходимы для деградации 13). Изменение состояния стационарных уровней белка после ингибирования разрушающих путей обеспечивает убедительные доказательства для вклада протеолиза к контролю белка изобилия 13. Тем не менее, такой анализ до сих пор не предоставляет информацию о кинетике оборота белка. Циклогексимид погоня с последующим вестерн - блоттинга преодолевает эти недостатки, позволяя исследователям визуализировать деградации белка с течением времени 22-24. Кроме того, поскольку обнаружение белка следующие циклогексимид погони , как правило , осуществляется с помощью Вестерн - блоттинга, радиоактивные изотопы и длительные шаги иммунопреципитационных не требуются для циклогексимид погони, в отличие от многих часто используемых методов чейз импульсов, которые также выполняются для визуализации деградации белка 25.

Циклогексимид впервые был идентифицирован как соединение с противогрибковым собственногалстуки , произведенные грамположительной бактерии Streptomyces пзеиз 26,27. Это является клетка-проницаемой молекулу , которая специфически ингибирует эукариотической цитозольная (но не органелл) перевод, ослабляя рибосом транслокацию 28-31. В циклогексимид чейза эксперименте, циклогексимид добавляют к клеткам, и аликвоты клеток собирают сразу и в определенные моменты времени после добавления соединения 22. Клетки лизируют, и белок обилие в каждый момент времени анализируют, как правило, с помощью вестерн-блоттинга. Снижение белка обилии после добавления циклогексемида можно с уверенностью отнести к деградации белка. Нестабильным белком, будет уменьшаться в изобилии в течение долгого времени, в то время как относительно стабильный белок будет демонстрировать небольшие изменения в изобилии.

Механизмы селективной деградации белков были высоко консервативны на протяжении Eukarya. Многое из того, что известно о деградации белков был впервые узнал вмодель одноклеточные эукариоты, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи) 25,32-36. Исследования с использованием дрожжей, вероятно, продолжать предоставлять новые и важные идеи в деградации белков. Способ циклогексимид погонях в клетках дрожжей с последующим вестерн-блот-анализ белков изобилии здесь представлены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рост и урожай дрожжевых клеток

  1. Если не анализируя кинетики деградации эндогенного дрожжевого белка, превратить желаемый штамм дрожжей (ы) с помощью плазмиды, кодирующей белок, представляющий интерес. Надежные способы трансформации дрожжей были описаны ранее 37.
  2. Инокулируйте дрожжей в 5 мл соответствующей среды (например, селективный синтетический определен (SD) , средство для поддержания плазмиды трансформированных клеток или неселективный дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) питательную среду для нетрансформированных клеток). Инкубируют в течение ночи при 30 ° C, вращение.
    Примечание: 30 ° С является оптимальной температурой роста для типичной дикого типа лабораторные штаммы дрожжей 38. Тем не менее, поскольку некоторые мутантные штаммы дрожжей не растут оптимально при температуре 30 ° С , и некоторые белки подвергаются деградации в зависимости от температуры, температуры , используемые для роста дрожжевых клеток и циклогексимид охоты должны быть определены эмпирически 39.
  3. Мера-ее оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) каждой ночной культуры.
    Примечание: Ячейки могут быть в логарифмической или стационарной фазе роста , но должна быть минимально достигнута плотность , которая позволит разбавление до OD 600 = 0,2 в 15 мл свежей среды.
  4. Развести в течение ночи культуры к OD 600 стоимостью 0,2 в 15 мл свежей среды.
  5. Выдержите дрожжей при температуре 30 ° С, встряхивая , пока клетки не достигают середины логарифмической фазы роста (т.е. OD 600 от 0,8 до 1,2).
  6. Во время роста дрожжевых клеток, выполните следующие действия в рамках подготовки к процедуре циклогексимид погоня:
    1. Установить нагревательный блок, способный вместить 15 мл конические пробирки до 30 ° С для инкубации клеток в присутствии циклогексемида. Добавьте воду в лунки теплового блока, чтобы обеспечить эффективное распределение тепла к культурам. Добавьте воду в каждую лунку таким образом, что 15 мл коническую трубку заставит уровень воды подняться, но не переполнить, губы скважины,
    2. Установите второй нагревательный блок, способный вместить 1,5 мл микроцентрифужных пробирок до 95 ° С для денатурации белков следующие лизиса клеток.
    3. Предварительно теплый свежий ростовую среду (1,1 мл на временную точку на культуру, чтобы быть проанализирован) до 30 ° С.
    4. Добавить 50 мкл 20x Stop Mix предварительно меченных микроцентрифужных трубки (одна трубка в момент времени в культуре, которые будут проанализированы). Поместите пробирки на лед.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: азид натрия, ингредиент в 20х Stop Mix, токсичен при оральном приеме внутрь или попадании на кожу. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке азид натрия. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
  7. Когда клетки достигли середины-логарифмического роста, собирают 2,5 OD 600 единиц каждой культуры в момент времени , чтобы быть проанализирован (например, 7,5 OD 600 единиц для анализа белка изобилие в трех временных точках). Центрифуга клетки собирали в 15 мл конические пробирки на 3,000 XG при комнатной температуре в течение 2 мин.
    Примечание: Один OD 600 единица равна количеству дрожжей , присутствующих в 1 мл культуры при OD 600 1,0. Объем культуры (в мл) , необходимого для сбора X OD 600 единиц (V) может быть определена с помощью следующего уравнения: V = X OD 600 единиц / Измеренные OD 600. Например, чтобы собрать 7,5 OD 600 единиц культуры дрожжевых клеток при OD 600 1,0, собирают 7,5 OD 600 единиц / 1,0 = 7,5 мл культуры дрожжей.
  8. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1 мл 30 ° C (предварительно нагретом) свежей среды , прирост в 2,5 OD 600 единиц клеток (например, 3 мл 7,5 OD 600 единиц).

2. Циклогексимид Chase

  1. Равновесие дрожжей клеточные суспензии путем инкубации в течение 5 мин в С теплом блоке 30 °.
  2. Подготовьте таймер для подсчета от 0:00.
  3. Для того, чтобы начать циклогексемида погоню, нажмите кнопку "Пуск" на таймер. Стремительно,но осторожно, выполните следующие действия:
    1. Добавить циклогексимид до конечной концентрации 250 мкг / мл к суспензии клеток дрожжей первого (например, добавьте 37,5 мкл 20 мг / мл циклогексимид запаса до 3 мл клеточной суспензии), и вихрь коротко перемешать.
      ВНИМАНИЕ: Циклогексимид является раздражителем кожных покровов и является токсичным при оральном приеме внутрь. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке циклогексимид. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
    2. Сразу же после добавления циклогексимид и встряхивания передача 950 мкл раствора (~ 2,4 OD 600 единиц) суспензии клеток дрожжей с добавлением циклогексемида к предварительно меченных микроцентрифужных пробирку , содержащую 50 мкл ледяной 20x стоп - смеси. Vortex микроцентрифужных трубки и место на льду до тех пор, пока не будут собраны все образцы.
    3. Возвращение суспензии дрожжевых клеток до 30 ° С.
  4. Повторите шаги 2.3.1 через 2.3.3 Для каждого из оставшихся суспензий дрожжевых клеток через равные промежутки времени (например, таким образом, что циклогексимид добавляется каждые 30 сек, к образцу # 1 в 0:00, образец № 2 в 0:30, образец № 3 в 1:00 и др.).
  5. На каждом последующем момент времени, вихревая дрожжевых клеток суспензии и передачи 950 мкл до меченых микроцентрифужных пробирки, содержащие 50 мкл предварительно охлажденное 20x Stop Mix. Vortex и место собирают клетки на льду. Возвращение 15 мл конические пробирки до 30 ° тепла блока C.
    1. Например, для сбора клеток через 30 мин после добавления циклогексимид (предполагается, что до 30 секунд интервалы между циклогексимид дополнение к дрожжам клеточных суспензий в начале хода времени), вихря и удалить 950 мкл суспензии клеток из образца № 1 в 30:00 , Повторите эти действия для образца № 2 в 30:30, и так далее.
      Примечание: Для того, чтобы предотвратить осаждение дрожжей, суспензий вихревых клеток в 15 мл конические пробирки примерно каждые 5 мин в течение всего курса погони. В качестве альтернативы, дрожжевой суспензии клетокs может поддерживаться в ванне непрерывно перемешивающей воды в течение всего срока эксперимента циклогексимид погоня.
  6. Когда все образцы были собраны, осадок собирали клетки центрифугированием при 6500 х г при комнатной температуре в течение 30 сек. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации. Клетки теперь готовы к щелочного лизиса. В качестве альтернативы, оснастке замораживающих осажденные клетки в жидком азоте и хранят при -80 ° С.

3. Пост-щелочной экстракции белка (модифицированный из 16,40)

  1. Добавляют 100 мкл дистиллированной воды в каждую осадку клеток. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз или встряхиванием.
  2. Добавьте 100 мкл 0,2 М NaOH для каждого образца. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз или встряхиванием.
  3. Выдержите суспендированные клетки при комнатной температуре в течение 5 мин. На этой стадии, клетки дрожжей не были лизированы, и белки , которые не были освобождены 40.
  4. Гранул клетки центрифугированием при 18000 мкг при комнатной нравратуре в течение 30 сек. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
  5. Для того, чтобы лизировать клетки, добавляют 100 мкл буфера для образца Лэммли к каждому осадку клеток. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз или встряхиванием.
    Примечание: Последовательное инкубации клеток с NaOH и Лэммли высвобождает буфера выборок белков в форме, совместимой с додецилсульфатом натрия-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с использованием трис-глицин системы рабочего буфера.
  6. Инкубируют при 95 ° С в течение 5 мин, чтобы полностью денатурировать белки.
    Примечание: инкубация при 95 ° C не могут быть пригодны для анализа белков, которые склонны к агрегации (например, белки с несколькими трансмембранных сегментов). Эти белки могут стать нерастворимыми при инкубации при повышенных температурах 41. Таким образом, для анализа таких белков, лизаты следует инкубировать при более низких температурах (например, 37 ° С - 70 ° С) в течение 10 - 30 мин, а определено эмпирически.
  7. Центрифуга лизаты на 18,000 XG в ротемпература ом в течение 1 мин для осаждения нерастворимого материала. Жидкость над осадком (растворенную извлеченный протеин) готов к разделению с помощью SDS-PAGE и последующим вестерн-блот анализ. В качестве альтернативы, хранить лизатов при -20 ° С.

4. Представитель SDS-PAGE и Вестерн - блоттинг Процедура (адаптировано из 16)

  1. Нагрузка белка стандарты молекулярной массы и определены эмпирически объем лизата на геле SDS-PAGE.
    Примечание: Выберите процентное содержание акриламида и бис-акриламида в геле SDS-PAGE, основанный на молекулярной массе белка, представляющего интерес. В целом, более низкий процент гели лучше подходят для решения более высоких белков молекулярной массой.
  2. Запуск гель при 200 V, пока фронт красителя достиг нижнего края геля.
  3. Перенос белков из геля на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану путем мокрого переноса при 20 В в течение 60 - 90 мин при температуре 4 ° С.
  4. Блок мембраны путем инкубирования в Трис-солевом буфере (ТБS), содержащий 5% обезжиренное молоко, качалки, при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 ° С в течение ночи.
    Примечание: Для предотвращения роста микроорганизмов в присутствии мембраны инкубировали в течение ночи, рекомендуется включать азид натрия в блокирующем растворе до конечной концентрации 0,02%.
  5. Инкубируйте мембраны с первичным антителом, специфическим для белка, представляющего интерес в TBS с 0,1% твина-20 (TBS / T) и 1% обезжиренным молоком, раскачивание при комнатной температуре в течение 1 часа.
  6. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  7. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора конъюгированных с вторичными антителами в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
    Примечание: флуорофоры светочувствительные. Поэтому разведений антител , конъюгированных с флуорофоров должны быть подготовлены в темноте, и инкубация мембран в присутствии антител , конъюгированных с флуорофоров и последующих стадий промывки должно происходить в светонепроницаемой (например, обернутого фольгой) соntainers.
  8. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  9. Изображение мембраны с помощью LI-COR Odyssey CLX и Image Studio программное обеспечение (или сравнимой оборудования обработки изображений и программного обеспечения), в соответствии с рекомендациями производителя.
  10. После получения мембранного изображения, инкубирование мембраны с первичным антителом, специфичным для контрольного белка нагрузки в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
  11. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  12. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора конъюгированных с вторичными антителами в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
  13. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  14. Изображение мембраны как на этапе 4.9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для иллюстрации методики погоня циклогексемида, стабильность Deg1 -Sec62 (рис 1), -associated деградация (ERAD) субстрат модель дрожжевого эндоплазматической сети (ER), анализировали 42-44. В ERAD, контроль качества убиквитинлигазы ферменты ковалентно присоединять цепи небольшого белка убиквитина к аберрантных белков, локализованных на ER мембране. Такие polyubiquitylated белки затем удаляются из ER и деградирует с помощью протеасомы, большой, цитозол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе предложен метод анализа кинетики деградации белка представлена. Этот метод может быть легко применен к различным белкам, деградировавших различных механизмов. Важно отметить, что циклогексимид чейз-эксперименты сообщать о кинетике деградации устойчивого состояния пула данного белка. Другие методы могут быть использованы для анализа кинетики деградации специфических популяций белков. Например, разрушающих судьба растущими полипептидами можно отслеживать с помощью анализа импульсов чейза 55. В т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят нынешних и бывших сотрудников лаборатории Рубинштейна за создание благоприятной и восторженной исследовательской среды. Авторы благодарят Марка Хохштрассера (Йельский университет) за обмен реактивами и опытом. E.M.R. благодарит Стефана Крефта (Университет Констанца) и Дженнифер Брунс (Университет Питтсбурга) за обмен бесценным опытом в кинетическом анализе белков. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (R15 GM111713) для E.M.R., исследовательской премией ASPiRE УНИВЕРСИТЕТА BALL ДЛЯ E.M.R., премией за исследования от отделения Sigma Xi Университета штата Болл для S.M.E., а также средствами от офиса проректора Государственного университета Болл и факультета биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Желаемые штаммы дрожжей, плазмиды, стандартные среды и буферные компоненты
Одноразовые пробирки из боросиликатного стеклаFisher Scientific14-961-32Доступны от различных производителей
Инкубатор с регулируемой температурой (e. Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Доступен от различных производителей
New Brunswick Сменный барабан для трубок 18 мм (трубчатый ролик)New BrunswickM1053-0450Трубчатый ролик рекомендуется для поддержания в течение ночи стартовых культур дрожжевых клеток в суспензии. В качестве альтернативы, если трубчатый ролик недоступен, можно использовать платформенный встряхиватель в инкубаторе с регулируемой температурой для ночных заквасок. Для поддержания более крупных культур во взвешенном состоянии можно использовать встряхиватель на платформе или трубчатый ролик.
Новый Брансуик TC-7 Роликовый барабан 120 V 50/60 HНью-БрансуикM1053-4004Для использования с трубчатым роликом
SmartSpec Plus СпектрофотометрBio-Rad170-2525Доступен у различных производителей
Центрифуга 5430Eppendorf5427 000.216 Ротор, который продается в комплекте, вмещает микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 и 2,0 мл. Ротор может быть заменен на тот, который вмещает конические пробирки объемом 15 и 50 мл
Ротор с фиксированным углом наклона F-35-6-30 с крышкой и адаптерами для центрифуги Модель 5430/R, 15/50 мл Конические пробирки, 6-местнаяEppendorfF-35-6-30
15 мл с трафаретной печатью винтовая крышка туба 17 x 20 мм коническая, полипропиленSarstedt62.554.205Доступна у различных производителей
1,5-мл гибкая трубка, Чистые натуральные микроцентрифужные пробирки для ПЦРEppendorf22364120Доступны от различных производителей
Аналоговые нагреватели для капельных ваннFisher Scientific1172011AQРекомендуется иметь два нагревателя (один для инкубации клеток во время обработки циклогексимидом и один для кипячения лизатов для денатурации белков). В качестве альтернативы, 30 градусов; Водяная баня С может быть использована для инкубации клеток в присутствии циклогексимида Кипящая водяная баня с горячей плитой может быть использована в качестве альтернативы для денатурации белков.
Нагревательный блок для конических трубок 12 x 15 млFisher Scientific11-473-70Для использования с нагревателем капельной ванны во время инкубации клеток в присутствии циклогексимид.
Нагревательный блок для 20 x 1,5 мл конических трубокFisher Scientific11-718-9QДля использования с нагревателем для капельной ванны для кипячения лизатов для денатурации белка.
Устройства для запуска и переноса SDS-PAGE, блоки питания и оборудование для визуализации или фотолаборатории для SDS-PAGE и переноса на мембрануБудет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
Западная блоттинговая система визуализации (например Li-Cor Odyssey CLx и программное обеспечение Image Studio)Li-Cor9140-01Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
Первичные антитела (например Фосфоглицераткиназа (Pgk1) Моноклональное антитело, мышиное (клон 22C5D8))Life Technologies459250Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
Вторичные антитела (например Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life TechnologiesA-21065Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения

Ссылки

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11(2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428(2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021(2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SDS PAGE
Циклогексимид Chase Анализ белка Деградация в
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.