Последовательное применение покровные стекла для оценки сжимающей Жесткость объектива мыши: Штамм и Морфометрические анализы

Краткое содержание

Возрастное увеличение жесткости хрусталика глаза связано с пресбиопией. Этот протокол описывает простой и экономичный метод измерения жесткости линз мыши. Хрусталик мыши, как и человеческие, с возрастом становятся жестче. Этот метод является точным и может быть адаптирован для линз более крупных животных.

Аннотация

Хрусталик глаза является прозрачным органом, который преломляет и фокусирует свет, чтобы сформировать четкое изображение на сетчатке. У людей, ресничные мышцы сокращаются, чтобы деформировать линзу, что приводит к увеличению оптической мощности на объективе, чтобы сосредоточиться на близлежащих объектах, процесс, известный как жилье. Возрастные изменения в жесткости линзы были связаны с пресбиопии, уменьшение способности объектива для размещения, и, соответственно, необходимость в очках для чтения. Даже если мышь линзы не учитывают или разрабатывать пресбиопии, мышиные модели может обеспечить неоценимый генетический инструмент для понимания патологии хрусталика, а также ускоренное старение наблюдается у мышей позволяет исследовать возрастных изменений в хрусталике. Этот протокол демонстрирует простой, точный и экономически эффективный метод определения жесткости объектива мыши, используя покровные стекла для применения последовательно увеличивая сжимающие нагрузки на объектив. Типичные данные подтверждают, что мыши линзы становятся более жесткими с возрастом, какчеловеческие линзы. Этот метод хорошо воспроизводим и потенциально могут быть расширены для механического тестирования линзы от более крупных животных.

Введение

Хрусталик — это прозрачный и аваскулярный орган в передней камере глаза, который отвечает за тонкую фокусировку света на сетчатке. Прозрачная базальная мембрана, называемая капсулой хрусталика, окружает массу удлиненных волоконных клеток, покрытых передним монослоем эпителиальных клеток^1,2. Пожизненный рост хрусталика зависит от непрерывной пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток на экваторе хрусталика в новые волоконные клетки, которые концентрически добавляются к предыдущим поколениям волоконных клеток². Со временем клетки волокон хрусталика подвергаются уплотнению, в результате чего в центре хрусталика образуется жесткий центр, называемый ядром¹. Аккомодация, определяемая как диоптрическое изменение оптической силы глаза, происходит у людей, когда цилиарные мышцы сокращаются, деформируя хрусталик и позволяя истинному увеличению оптической силы фокусироваться на близких объектах^3-5. В неаккомодированном глазу хрусталик удерживается в относительно сплющенном состоянии из-за натяжения зонулярных волокон. Когда цилиарные мышцы сокращаются, напряжение на хрусталике ослабевает, что приводит к уменьшению экваториального диаметра хрусталика и увеличению осевой толщины. Возрастные изменения хрусталика вызывают пресбиопию, прогрессирующую потерю аккомодации хрусталика, что приводит к необходимости использования очков для чтения.

Несколько исследований связали пресбиопию с возрастным увеличением внутренней жесткости линзы^6-11. Жесткость определяется как сопротивление упругого объекта деформации под действием приложенной нагрузки. Для исследования жесткости линз человека были использованы различные методы, включая спиновую компрессию^12-14, сжатие актуатора¹⁵, индентирование зонда¹⁶, динамический механический анализ ^6,10 и силу акустического излучения на основе пузырьков¹⁷. В то время как хрусталики мышей не учитывают и не развивают пресбиопию, мышиные модели для патологий хрусталика являются ценными инструментами, потому что мыши дешевле более крупных животных, хорошо охарактеризованы генетически и претерпевают ускоренные возрастные изменения из-за быстрого старения. В нескольких исследованиях изучалась жесткость хрусталика мышей с помощью методов компрессии, и были продемонстрированы изменения жесткости хрусталика из-за старения или целенаправленных^{генетических нарушений}. Таким образом, линзы мышей являются хорошими моделями для изучения возрастных изменений жесткости линз.

Этот протокол описывает простой и недорогой, но точный и воспроизводимый метод сжатия для определения жесткости хрусталика мыши, основанный на наложении стеклянных покровных стекол на линзу в сочетании с фотографированием хрусталика через диссекционный микроскоп и зеркало. Этот метод позволяет получить надежные деформационные и морфометрические данные с помощью легко изготавливаемого и собираемого устройства. Репрезентативные результаты подтверждают, что с возрастом жесткость линз мышей увеличивается.

Протокол

Все процедуры на животных были проведены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и в соответствии с утвержденным протоколом по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Скриппса научно-исследовательского института.

1. Объектив Вскрытие

1. Эвтаназии мышей в соответствии с рекомендациями, содержащимися в Национальных Институтов Здоровья "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных", а также утвержденных протоколов использования учреждением животных.
2. Вылущивать глаз от мышей с использованием изогнутых щипцов. Выжмите ткань вокруг глаз с щипцами, чтобы принести глаз из розетки, а затем вырви глаз из гнезда с помощью пинцета. Перенести глаза на свежий 1x фосфатным буферным раствором (PBS) в рассечение блюдо.
3. Отрезанные зрительного нерва как можно ближе к глазному яблоку, насколько это возможно. Аккуратно и осторожно вставьте тонкие прямые пинцетом в глазное яблоко через отверстие порогае зрительный нерв выходит из заднего.
4. Аккуратно надрезать ножницами в глазное яблоко от заднего до края роговицы. Грызун линзы занимают ~ 30% глаз. Сделать тщательно эти надрезы, и не вставляйте пинцет или ножницы слишком глубоко в глаза, чтобы не повредить объектив.
5. Разрежьте вдоль стыка между роговицы и склеры, по крайней мере на полпути вокруг глазного яблока.
6. Слегка надавите на роговице, чтобы удалить линзу из глаза через отверстие, сделанные в шагах 1.4 и 1.5.
7. Используйте тонкий пинцет кончик прямой тщательно удалить все крупные мусора, которые по-прежнему прикреплен к объективу. Визуально осмотрите линзу на наличие повреждений, прежде чем приступить к измерениям жесткости.

2. Жесткость Измерения

1. Взвешивание по крайней мере 10 покровные из той же коробки с помощью аналитических весов. Найти средний вес покровные. Для согласованности, используйте ту же коробку покровные для всех экспериментов. Предварительно мокраяПокровные и правый угол зеркало в 1x PBS при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 ч до начала экспериментов.
2. Заполните измерительную камеру (см рисунок 1) с 65 - 75 мл 1x PBS. Измерительная камера была изготовлена ​​из плексигласа с камеральной механического цеха, и дерн в камере были сделаны с помощью сверлильного станка на желаемую глубину с соответствующим сверлом. Линзы остаются прозрачными в 1X PBS при комнатной температуре в течение длительности механических испытаний.

Рисунок 1:. Жесткость измерительная камера фотография , где размеры измерительной камеры жесткости выполненного на заказ с различными дерн разной глубины и формы. Круглые дерн, которые являются 200 мкм или 300 мкм глубиной (желтые стрелки) используются для измерений на линзах мыши. Дерн 2 мм в диаметре и 13 ~-. 14 мм от края камеры Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Поместите правый угол зеркало в камеру на постоянном расстоянии от дерн, который будет использоваться для хранения линз. Убедитесь, что зеркало не двигается во время эксперимента.
4. Передача расчлененный линзы в измерительную камеру осторожно с захватывая щипцов или изогнутыми щипцами.
5. Возьмите вид сверху картину ненагруженном линзы из прямо над головой. Возьмите мышь фотографий объектив 30X при увеличении с подсветкой от рассечения микроскопа (внизу) и источник волоконно-оптический свет на левой и правой сторон. Установка волоконно-оптический источник питания до 80% от максимальной интенсивности света. Настройте выход источника питания, в зависимости от условий освещения, предпочтений пользователя и качества изображения по мере необходимости.
6. Возьмите вид сбоку картину ненагруженном линзы, которые можно увидеть через Р.И.GHT угол зеркала. Если камера не откалиброван, сфотографировать зеркала края в фокусе. Кромка зеркало длиной 5 мм, и это измерение позже может быть использовано для определения пикселов / мм и служат в качестве масштабной линейки в изображениях.
7. Поместите линзы в дерн, и убедитесь, что объектив надежно и прямо сидит в дерн. Сфотографируйте объектива перед загрузкой. Объектив должен отдыхать в дерн на его передней или заднем полюсе.
8. Поместите 1 покровное мягко на объектив. Подождите 2 мин, чтобы позволить ползать, и взять другой вид сбоку изображение загруженного объектива.
9. Продолжайте добавлять покровные, как на стадии 2.8, и принимая вида сбоку снимков после добавления каждого покровного как на шаге 2.8 до в общей сложности 10 покровные не применяются.
10. Удалить все покровные. Подождите 2 минуты, и принять вид сбоку изображение объектива (внутри и снаружи дерн) после удаления всех покровные.

Измерение 3. Объектив Nucleus

1. Для determине размер ядра хрусталика, переместите объектив в чистую чашку Петри с 1x PBS.
2. Аккуратно decapsulate объектив с использованием тонких прямых щипцов.
3. Шелушиться клетки коры головного мозга волокна путем прокатки линзы между пальцами в перчатках. Оставшийся ядро ​​линзы будут чувствовать себя как жесткий мрамор. Используйте эту процедуру, чтобы изолировать ядро ​​на взрослых линз, начиная с 1-месячного возраста. Так как изолированное ядро ​​представляет собой твердое тело, дальнейшее механическое испытание ядра хрусталика не может быть выполнена с помощью этого метода, описанного.
4. Осторожно промыть ядро ​​линзы в 1x PBS в чашке Петри.
5. Поместите ядро ​​линзы обратно в измерительную камеру (не в дерн), и принять образ ядра хрусталика через правый угол зеркала.

Рис . 2: A Линзы мыши сжат покровные (А) Схематическое и (Б) фотография эксментальная установка, показывающая 2-месячным объектив мыши в 200 мкм глубокой дерн в измерительной камере, заполненной 1x PBS. Правый угол зеркало и цифровая камера, установленная на рассечение микроскопа были использованы для сбора изображений объектива во время сжатия по покровные. (C) Фотографии сагиттальной видом 2-месячного дикого типа линзы сжатого путем последовательного увеличения числа покровных при условии, что исходные данные для измерения осевых и экваториальные диаметры и расчета осевых и экваториальные деформаций во время испытаний на сжатие покровного основе. Отражение объектива иногда можно увидеть в покровные (наиболее четко видна в 1 покровного изображения). При проведении измерений, игнорировать отражение и измерить расстояние до вершины линзы. (D) Фотографии сагиттальной видом на 2-месячного дикого типа линз после сжатия и изолированного ядра хрусталика. После сжатия линзы и изолированные ядра сидят за пределами дерн. Шкала баров, 1 мм. Эта цифра изменяется от Gokhв др. PLoS One, 2012 ^19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ 4. Изображение

1. Мера экваториальные и осевые диаметры линз перед погрузкой и после каждой стадии загрузки с использованием ImageJ или подобное программное обеспечение. Измерьте диаметр каждого ядра хрусталика. Ядро линзы близка к сферической , так измерение при любой ориентации будет достаточно ^19,21.
2. Откорректируйте линзы осевого диаметра, добавляя глубину дерн, используемой. В камере измерения, дерн затемняется 200 мкм (2-месячным линзы мыши) или 300 мкм (4-месячным и 8-месячным линзы мыши) осевого толщины линзы.
3. Вычислить осевые и экваториальные штаммы из измерений диаметра линзы с использованием уравнения, ε = (d - d ₀₎ / d _0, где ε является деформация, d является осевая или еquatorial диаметр при заданной нагрузке, а d ₀ представляет собой соответствующий аксиальном или экваториальном диаметра при нулевой нагрузке.
4. Постройте осевую и экваториальных деформаций как функции приложенной нагрузки (в мг).
5. Участок осевой, экваториальной и ядерных диаметров. Рассчитать и построить соотношение сторон объектива путем деления осевого диаметра от экваториального диаметра.
6. Рассчитать и построить объем объектива , используя уравнение, объем = 4/3 × π × Г × _E ² R _A, где г _Е экваториальный радиус и г _А осевой радиус измеряется от изображения , снятого на шаге 2.6. Это уравнение предполагает , что линза представляет собой сплюснутый сфероид (эллипсоид) ^1,22.
7. Рассчитать и построить ядерный объем с помощью уравнения, объем = 4/3 × × П г _N ^3, где г _N является радиус ядра хрусталика, измеренная от фотографии , сделанной на шаге 3.5. Это уравнение предполагает I ядро ​​линзыса сфера ^19,21.
8. Подсчитано и представлено графически ядерную фракцию как отношение объема ядра к объему линзы.

Результаты

Измеряли жесткость и размеры 2-, 4- и 8-месячных линз мыши. Мыши были у всех животных дикого типа на чистом фоне C57BL6 штамма, полученного из Питомника TSRI животных, и каждая линза была загружена с 1 до 10 покровные. Осевые и экваториальные штаммы были рассчитаны в зависимости от приложенной нагрузки путем измерения осевого и экваториального диаметра линзы после добавления каждого покровное, а затем нормализации каждого изменения диаметра к соответствующему ненагруженном диаметра. Восе...

Обсуждение

Есть несколько ключевых соображений при использовании этого метода для измерения жесткости объектива. Во-первых, покровные применяются к линзе при слегка косо (8 - 8,5 °) по отношению к нижней части камеры (Q). Это будет применяться очень небольшой составляющей нагрузки экваториально, а не в осевом направлении. Тем не менее, эта экваториальная нагрузка считается пренебрежимо малым , поскольку грех θ ≈ 0,1 ^19. Если этот способ приспособлен для больших объективов, угол покровные к нижней части камеры должны был...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Прямые щипцы с тонким наконечником	Fine Scientific Tools	11252-40
Ножницы для микродиссекции, прямой край	Fine Scientific Tools	15000-00
Изогнутые щипцы	Fine Scientific Tools	11272-40
Захватывающие щипцы	Hammacher	HSC 702-93	Дополнительная
чашка для вскрытия	Fisher Scientific	12565154
Чашка Петри 60 мм	Fisher Scientific	0875713A
1x фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)	Life Technologies	14190
18 x 18 мм стеклянные покровные стекла	Fisher Scientific	12-542A
Измерительная камера с углублениями для удержания линз			Изготовлено на заказ (см. <сильный>Рисунок 1)
Прямоугольное зеркало	Edmund Optics	45-591
Источник света	Schott/Fostec	8375
Микроскоп с подсветкой	Olympus	SZX-ILLD100	С фототрубкой SZ-PT
Цифровой фотоаппарат	Nikon	Coolpix 990