Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения

13.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53990

⸱

20 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Понимание злокачественного поведения рака требует создания точных моделей того, как опухолевые клетки взаимодействуют с компонентами опухолевого микроокружения, такими как макрофаги. В данной работе описаны два метода изучения взаимодействия клеток глиобластомы с опухолеассоциированными макрофагами и микроглией, в которых оценивается влияние на инвазию глиобластомы.

Аннотация

Глиобластомы мультиформная (класс IV глиомы) является очень агрессивным человеком рак с медианой выживаемости 1 года после установления диагноза. Несмотря на повышенное понимание молекулярных событий, которые приводят к возникновению глиобластомы, этот рак все еще остается крайне невосприимчивы к обычному лечению. Хирургическая резекция опухолей головного мозга высокого класса редко бывает полным из-за высокой инфильтративного характера клеток глиобластомы. Поэтому терапевтические подходы, которые вытягивают инвазию клеток глиобластомы является привлекательным вариантом. Наша лаборатория и другие показали, что ассоциированные с опухолью макрофаги и микроглии (резидентные макрофаги мозга) сильно стимулируют глиобластомы вторжение. Протокол , описанный в этой статье , используется для моделирования глиобластомы-макрофагами / микроглии взаимодействия с использованием анализов культуры в пробирке. Такой подход может в значительной степени способствовать развитию и / или обнаружения наркотиков, которые нарушают связь с макрофагами, которая позволяет эту злокачественную BehavIOR. Мы установили два надежных вторжения Совместное культивирование анализов, где микроглии / макрофаги стимулируют вторжение глиомы клеток на 5 - 10 раз. Клетки глиобластомы, меченные флуоресцентным маркером или конститутивно экспрессирующих флуоресцентный белок высевают без и с макрофагами / микроглии на матричных покрытием из поликарбоната камерных вкладышей или внедренный в трехмерной матрице. Инвазии клеток оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии для изображения и рассчитывать только инвазивные клетки на нижней стороне фильтра. С помощью этих анализов, несколько фармакологических ингибиторов (JNJ-28312141, PLX3397, Гефитиниб и Semapimod), были идентифицированы, которые блокируют макрофаги / микроглия стимулировали глиобластомы вторжение.

Введение

Глиобластомы мультиформная является агрессивным человеком рак мозга с медиана выживаемости составляет приблизительно 12 месяцев с момента постановки диагноза 1,2. Глиобластома является одним из самых опасных и клинически сложных видов рака, как она резистентной к стандартной химиотерапии и хирургической резекции. Диффузный характер глиобластомы позволяет опухолевым клеткам распространяться по всему нормальному мозгу, делая запущенная опухоль практически невозможно хирургическим резекцию полностью. Это очень инвазивные аспект является отличительной чертой глиобластомы и других продвинутых астроцитомах. Таким образом, в центре внимания многих исследований было на молекулярном механизме вторжения клеток глиобластомы. Микроокружение опухоли глиобластомы играет жизненно важную роль в установлении злокачественности 3-6. Ассоциированных с опухолью макрофаги / микроглия Было показано , что отвечать за содействие глиобластомы вторжения 7,8. Большинство из этих исследований, однако, измерили влияние макрофагов / микроглии с использованиемАнализы, которые физически отделить их от клеток глиобластомы. Наша лаборатория установила, чтобы произвести улучшенные анализы, которые позволяют нам изучить, как глиобластомы вторжение зависит от макрофагах / микроглии в совместных культурах и позволяют изображению физического взаимодействия между ними во время вторжения.

Классические анализы для измерения вторжения клеток включают "стандартные" Бойден камеры хемотаксис и форматы chemoinvasion. Здесь клетки должны быть изучены высевают в пластиковой камере, которая содержит поликарбонатный фильтр на дне, который имеет поры определенного размера (как правило, от 0,4 до 8 мкм в диаметре). Процесс инвазии клеток включает физический барьер, как правило, состоит из внеклеточного матрикса белка. В анализе chemoinvasion, предпочтительной является матрица, используемая Матригель (далее именуемые как "матрица"), внеклеточный смесь матричный белок, выделяемый Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) мыши клетки саркомы и состоит в основном из седловинеLagen типа IV и ламинин. Камеры затем помещают в культуральную лунку ткани, которая содержит среды для культивирования клеток с или без факторов роста, которые, как предполагается, стимулируют инвазию. Клетки, которые имеют более высокую инвазивную способность вторгнется через фильтр внеклеточной матрицы с покрытием на более высокой частоте, и прилипают к нижней стороне фильтра. Мы модифицировали этот анализ, чтобы оценить роль микроглии и макрофагов, ассоциированных с опухолью инвазии клеток глиобластомы.

Нам удалось определить с помощью анализов , описанных сокультивирования в этой статье , что микроглии может стимулировать вторжение двух глиобластомы клеточных линий на 5 - 10 раз 9,10. Это отражает то, что наблюдается в животных моделях глиобластомы. Кроме того, мы разработали анализ трехмерную инвазии, где взаимодействие между глиобластомы клеток и макрофагов / микроглии могут быть рассмотрены более непосредственно. Степень инвазии клеток глиобластомы стимулируется macrophaGES / микроглии в 3D-пробы сравнима с тем, что наблюдается с использованием матрицы с покрытием камеры подход. Аналогичные анализы были ранее разработаны для изучения карциномы молочной железы взаимодействия с макрофагами во время вторжения 11-13. Оба описанных в данной работе методы должны помочь в способности рассекать молекулярный механизм (ы) макрофагами / микроглии-стимулированной вторжения клеток глиобластомы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Флуоресцентная маркировка клеток

Линии клеток глиобластомы Этикетка и микроглии с флуоресцентными красителями 9: Примечание. В качестве альтернативы, генерировать клеточные линии , которые конститутивно экспрессируют флуоресцентные белки , такие как GFP / RFP , как описано в 14.

  1. Пластина клеток на 6-луночного планшета с таким образом, что они будут составлять 70 - 80% сливающийся в день окрашивания. Для мышиного клеток глиобластомы линии GL261 и линии U87 клеток глиобластомы человека, пластины 1 х 10 6 и 1,5 х 10 6 клеток соответственно на 6 см чашку 24 ч перед окрашиванием.
  2. Приготовьте раствор красителя флуоресцентный клеток пятно в ДМСО и добавляют 5 мкМ красителя к средствам массовой информации, либо Roswell институт Мемориальный парк среды (RPMI) или макрофаг бессывороточной среде (MSFM), вихревые хорошо.
  3. Инкубируйте клетки с красителем в течение 30 мин при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  4. Удалить краситель, содержащие носитель и добавляют свежую среду, (RPMI или MSFM) к клеткам.
  5. Инкубируйте клетки в течение 30 мин. Примечание: Клетки теперьокрашена и готов к использованию в эксперименте.

2. Предварительно покрытые Матрица палата Совместное культивирование Invasion Анализ

  1. Дифференцировать клетки ТНР-1 с использованием форболмиристатацетата (PMA) 15.
    1. Пластина 2 - 3 × 10 5 ТНР-1 клеток в 1,5 мл RPMI / 10% FBS в культуральной пластины 6 также. Сразу после того, как покрытие добавить 100 нм РМА и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
      Примечание: Через 48 ч клетки ТНР-1, которые успешно прошли дифференцировку будет клейкий и распространяться на дно колодца принимая на круглой морфологии.
    2. Удалить РМА путем промывания один раз 1x PBS и заменяют свежей RPMI / 10% FBS. Подождите еще 48 ч, пока клетки не будут готовы к использованию в анализе.
  2. Равновесие матричные камеры предварительно покрытые, помещая их в лунку, содержащую 500 мкл среды в одиночку (без сыворотки) и добавлением 500 мкл среды в одиночку на вершину. Инкубируйте камеры в течение 2 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    Примечание: Предварительно покрытые камеры были приобретены у производителя; см Таблица материалов / оборудования.
  3. Чтобы аккуратно отделить клетки (флуоресцентно меченных линии клеток глиобластомы и микроглии / макрофаги), удалить носитель из клеток путем аспирации. Вымойте клеток на блюдо с 2 мМ ЭДТА / ФБР. Добавьте 500 мкл 2 мМ ЭДТА / ФБР и инкубируют в течение 5 - 10 мин в сотовом инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  4. Ресуспендируют клеток в 5 мл среды, содержащие 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА).
  5. Центрифуга в течение 5 мин при 120 х г.
  6. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в MSFM / 0,3% БСА сред (для GL261 клеток и микроглии) или RPMI / 0,3% БСА (для U87 и ТНР-1 клетки) таким образом, что концентрация клеток равна 1 × 10 6 клеток / мл , Используйте гемоцитометра для подсчета клеток.
  7. Добавить 500 мкл среды / 0,3% БСА на лунку 24-луночного планшета.
  8. Удалить материал из камер, которые были выдержаны в течение по меньшей мере 2 ч (шаг 2,2). Место ChambeRS в лунку, содержащую 500 мкл среды / 0,3% БСА (шаг 2.7).
  9. Если ингибиторы используются для изучения их влияния на макрофагах / микроглии стимулировали глиомы вторжения, добавьте соответствующую концентрацию как в верхней и нижней частях камеры.
    Примечание: Концентрации CSF-1R ингибитор используется полностью ингибировать микроглии стимулировали GL261 глиобластомы вторжения можно найти в ссылке 9.
  10. В зависимости от используемых клеточных линий, добавить клетки в верхней камере, как описано в следующих двух шагах: мышь глиобластомы (2.10.1) и человеческой глиобластомы (2.10.2).
    1. Смешайте 1,5 х 10 5 GL261 (глиобластомы) клеток (150 мкл) и 5 х 10 4 мыши микроглии (50 мкл) (см шаг 2.6 для деталей СМИ). Довести объем до 500 мкл добавлением 300 мкл MSFM / 0,3% БСА. Добавить смесь клеток в верхней камере и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
      Примечание: Мышиный микроглии изолированы от новорожденных мышей, как описано Iп 1 6.

Смешайте 7,5 х 10 4 U87 (глиобластомы) клетки (75 мкл) и 2,5 × 10 4 Thp1 (макрофаги) клетки (25 мкл). Доведите объем в 500 мкл добавлением 400 мкл RPMI / 0,3% БСА. Добавьте смесь клеток в верхней камере. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов.

  1. После инкубации удалить клетки из верхней части камеры путем осторожного аспирации и закрепить камеры путем размещения в 3,7% формальдегида в PBS. Разрешить камеры, чтобы оставаться в фиксаторе в течение 15 мин при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 ° C). Удалить закрепитель нежным аспирации и заменить 500 мкл 1x PBS. Перейдите к разделу 4 для анализа изображений.
    Примечание: Эксперимент может быть приостановлена ​​в этот момент и сохранены для работы с изображениями в 1x PBS. Флуоресцентные сигналы красителя могут быть обнаружены в течение 2-х недель после фиксации.

3. Вторжение Пробирной "3D" -вложением глиомы и макрофаги / микроглия в матрице

  1. Оттепель матрица смеси при 4 ° С в течение ночи. Выполните все дальнейшие манипуляции с использованием матрицы на льду в капюшоне.
  2. Приготовьте 10 мг / мл концентрации матрицы в средах (MSFM или RPMI) с 0,3% BSA на льду.
    Примечание: сток концентрация матрицы обычно составляет около 15 мг / мл.
  3. Для подготовки клеток (помеченных на шаге 1) для суспензии в матрице, удалить носитель из клеток путем аспирации. Вымойте клеток на блюдо с 2 мМ ЭДТА / ФБР. Добавьте 500 мкл 2 мМ ЭДТА / ФБР до клеток и инкубировали в течение 5 - 10 мин в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  4. Ресуспендируют клеток в 5 мл среды, содержащей 0,3% бычьего сывороточного альбумина.
  5. Центрифуга в течение 5 мин при 120 х г.
  6. Отберите супернатант из гранул. Ресуспендируют осадок в средствах массовой информации / 0,3% БСА , так что концентрация клеток равна 1 × 10 6 клеток / мл. Используйте гемоцитометра для подсчета клеток.
  7. Добавить 1,5 × 10 5 клеток GL261 (в 150 мкл) + 5 × 10 4 клеток микроглии (в 50 мкл) в 1,5 мл пробирке с.Добавляют 2 х 10 5 GL261 клеток (200 мкл) в отдельную 1,5 мл пробирке.
    Примечание: GL261 только клетки без микроглии служит в качестве контроля.
  8. Спин клетки в микроцентрифуге в течение 5 мин при 120 х г.
  9. Ресуспендируют клеток в 200 мкл холодной матрицы на льду.
  10. Пластина 50 мкл (50000 клеток) на центр верхнего отсека 8 мкм размер пор в камере вставки.
  11. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин для полимеризации происходить.
  12. Добавить 200 мкл бессывороточной среды в верхней камере и 700 мкл сыворотки, содержащей среду для роста клеток в нижней лунки.
  13. Инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
  14. После инкубации удалить клетки из верхней части камеры путем осторожного аспирации и закрепить камеры путем размещения в 3,7% формальдегида в PBS. Разрешить камеры, чтобы оставаться в фиксаторе в течение 15 мин при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 ° C). Удалить закрепитель нежным аспирации и заменить 500 мкл 1x PBS. Перейдите к разделу 4 FoАнализ г изображения.

4. визуализации Assays

  1. Удалить камеры с 3,7% формальдегида и промыть в лунку, содержащую свежие 500 мкл 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте камеры высохнуть.
  2. С помощью ватной палочки, осторожно очистите неинвазивные клетки из верхней части фильтра (сторона, обращенная к внутренней части камеры), очищая поверхность фильтра. Начните мягко и постепенно увеличивать давление. Делайте это по крайней мере 3 раза в камере.
  3. Поместите камеры в любом стеклянным дном блюдо или оставить в 24-луночного планшета.
  4. Поместите образец на сцене с эпифлуоресцентной или лазерной конфокальной флуоресцентной микроскоп оснащен камерой и программным обеспечением захвата изображения 9,10.
  5. Возьмите несколько 10X или 20X образы представительных полей.
  6. Использование программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ, подсчитать количество клеток глиобластомы, которые пересекли фильтр к нижней стороне 9,10.
  7. Если визуализации "3D. "Нашествие анализ (описанный в разделе 3), генерируют серию Z стека с использованием флуоресцентного лазера конфокальный микроскоп 5-6 Для получения изображения инвазивной популяции клеток на нижней стороне фильтра, следовать протоколу шаги 4.2 - 4.6 описано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя методы, описанные здесь, мы показали, что микроглии и макрофаги могут существенным образом стимулировать вторжение клеток глиобластомы. Два различных инвазия анализы используются и изображены на фиг.1. На фиг.2 клетки GL261 , которые конститутивно экспрессируют флуоресцентного белка mCherry высевали на предварительно покрытых камер с и без микроглии в течение 48 часов. GL261 клетки были минимально инвазивной сами по себе, однако при культивиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Высоко инвазивный характер высоких астроцитомах класса и глиобластомы делают эти виды рака мозга очень смертельным. Поэтому крайне важно, чтобы это понять молекулярные и клеточные механизмы глиобластомы вторжения. Многое узнал о процессе глиобластомы вторжения уже 17. С помощью анализа форматов, подробно описанные в данной работе, в нашей лаборатории показали, как в мышиных и человеческих моделей, ассоциированные с опухолью макрофаги могут стимулировать вторжение глиомы клеток на 5 - 10 раз. Эта модель Совмес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Константина Добрюниса за предоставление мышиной микроглии для этих исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Камера инвазии Corning BioCoat Matrigel: с BD Matrigel MatrixCorning/Fisher ScientificCat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 мл)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Molecular ProbesC34552
CellTracker Green CMFDA DyeLife Technologies/Molecular ProbesC2925
Клеточная линия GL261Национальный институт рака (NCI)
U87 Клеточная линияАмериканская коллекция культур тканевых типовHTB-14
THP-1Американская коллекция культур тканевых культурATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 мл)Life Technologies/Gibco11875-093
Раствор формальдегидаSigma AldrichF1635
Corning Transwell вставки для клеточных культур с поликарбонатной мембраной (8 &; M pore) 48 в упаковке.CorningCLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Сниженный фактор роста Экстракт базальной мембраны, PathClearTrevigen3445-005-01
Фетальная сыворотка теленка (FBS)Life TechnologiesCat: 10500064
Бычья сыворотка Альбумин, фракция V, обработанный тепловым шокомFisherScientificBP1600-100
0,5 M EDTAThermoFisher Scientific15575-020
форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma AldrichP8139-1MG

Ссылки

  1. Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
  2. Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
  3. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
  4. Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
  5. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  6. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  7. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  8. Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
  9. Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
  10. Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
  11. Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
  12. House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
  13. Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
  14. Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
  15. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  16. Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
  17. Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
  18. See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitroTHP 1
Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.