Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo биосенсоров Треки Non-апоптотической активности каспазы в Drosophila

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

27 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

В этой статье

Краткое содержание

Для того, чтобы обнаружить здоровые клетки в целых животных , которые содержат низкие уровни активности каспазы, высокочувствительный биосенсор назначенный CaspaseTracker был сгенерирован для дрозофилы. Каспазы-зависимой биосенсора обнаруживается активность в долгоживущих здоровых клетках во внутренних органах взрослых животных, выращенных в оптимальных условиях при отсутствии стимулов смерти.

Аннотация

Каспазы являются ключевыми медиаторами апоптотической гибели клеток благодаря своей протеолитической активности. Когда каспазы активируются в клетках до уровней, обнаруживаемых с помощью доступных технологий, обычно предполагается, что апоптоз происходит вскоре после этого. Каспазы могут расщеплять многие функциональные и структурные компоненты, вызывая быстрое и полное разрушение клеток в течение нескольких минут. Тем не менее, накапливающиеся данные указывают на то, что в нормальных здоровых клетках те же каспазы выполняют другие функции, предположительно на более низких ферментативных уровнях. Исследования неапоптотической активности каспаз были затруднены трудностями с обнаружением низких уровней активности каспазы и отслеживанием конечной судьбы клеток in vivo. В этой статье мы проиллюстрируем использование сверхчувствительного репортера о каспазах, CaspaseTracker, который постоянно помечает клетки, подвергшиеся активности каспазы у целых животных. Этот двухцветный биосенсор in vivo CaspaseTracker для Drosophila melanogaster временно экспрессирует красный флуоресцентный белок (RFP), указывая на недавнюю или текущую активность каспазы, и постоянно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок (GFP) в клетках, которые испытывали активность каспазы в любое время в прошлом, но не погибли. Важно отметить, что этот каспазозависимый биосенсор in vivo легко обнаруживает наличие неапоптотической активности каспазы в тканях систем органов на протяжении всей взрослой мухи. Это продемонстрировано с помощью вскрытия отдельных мух для обнаружения биосенсорной активности в здоровых клетках мозга, кишечника, мальпигиевых канальцев, кардии, яичниковых протоков и других тканях. CaspaseTracker обнаруживает неапоптотическую активность каспазы в долгоживущих клетках, так как биосенсорная активность обнаруживается во взрослых нейронах и в других тканях не менее чем через 10 дней после активации каспазы. Этот биосенсор служит важным инструментом для раскрытия роли и молекулярных механизмов активности неапоптотических каспаз у живых животных.

Введение

Каспазы цистеиновых протеаз, которые опосредуют апоптотической гибели клеток путем скола много внутриклеточных белков после ключевых остатков аспарагиновой. Например, инициатор каспазы активировать эффекторные каспазы, derepress нуклеазы ДНК, понадеясь компоненты цитоскелета и изменяет липидный состав клеточных мембран , чтобы быстро ликвидировать клетки и стимулировать их признание и полном охвате соседними клетками, располагающие клеточных трупов. 1-4 Подсчитано что миллиарды клеток умирают в день в человеческом теле, и апоптоз является важным механизмом вызванной химиотерапией смерти опухолевых клеток. 5 Другой набор каспаз может привести к гибели клеток с помощью различных не-апоптотических процессов для стимуляции врожденного иммунитета. 6 Таким образом, большинство исследований каспаз была сосредоточена на своих функций про-смерти.

Интересно, что первые данные в поле показали, что одни и те же каспазы несут ответственность за развитие клеточной смерти также необрывающегося пУНКЦИИ. Пионерские исследования показали , что каспазы участвуют в различных клеточных функций в здоровых клетках, в том числе регуляции клеточной пролиферации и миграции в процессе эмбриогенеза. 7-9 Каспазы требуется для индивидуализации сперматид в дрозофилы 10,11, для блокирования альтернативного necroptotic гибель клеток пути у мышей 12,13, а также для обработки микроРНК в C. Элеганс. 14,15 В , возможно , самой долгоживущей клетки, нейроны, каспазы и другие апоптическая машины участвуют в регуляции активности нейронов по обрезке синаптических окончаний, процесс считается необходимым для укрепления других синапсов для обучения и памяти 16 - ти. 18 возможно , что каспазы облегчают синаптическую обрезку по типу мини-апоптозу крошечных нейрональных проекций без всей клеточной гибели. 19 Тем не менее, каспазы могут иметь альтернативные функции , не связанные с апоптозом , как события. 20,21 Двойная рольs в жизни и смерти не являются уникальными для каспаз; BCL-2 белки семейства и цитохром с играют свою роль в клеточных энергетики в здоровых клетках , но также являются частью основного пути апоптоза , который активируется многими типами клеток стресса. 22-25 Хотя это и не доказано, что кажется логичным , что эволюция связана день -jobs до смерти-рабочих мест в рамках одних и тех же молекул, чтобы обеспечить своевременное устранение непригодных или нежелательных клеток.

В настоящее время молекулярные механизмы, не апоптотической активности каспазы не поняты, и степень не-апоптотической активности каспазы во время эмбрионального развития и во взрослых тканях также не известно. Главной проблемой является трудность в различении однодневные рабочие места от смертельных заданий каспаз. В отличие от апоптоза и pyroptosis, когда активность каспазы усиливается протеолитического каскада, днем ​​рабочих мест каспаз, как ожидается, произойдет при гораздо более низких уровней ферментативной активности, вероятно, ниже обнаружения с помощью множества доступных техничтодологии.

До начала работы, представленной здесь, другие разработали различные каспазы биосенсоры для различных целей. Копро биосенсоры (например, ECFP-DEVD-Венера) быстро обнаруживать активность каспазы в режиме реального времени в культивируемых клетках и тканях животных с использованием FRET. 26,27 При каспазы расщепления, то GFP фрагмент Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- ядерных целевых nucGFP) подвергается внутриклеточную релокализация в течение нескольких минут , когда его плазмалеммы-фал расщепляется каспазы. 28 Точно так же, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes из цитоплазмы в ядро при каспазы расщепления. 29,30 Подробнее в последнее время хромофора в iCasper был искусно разработан флуоресцировать при расщеплении с помощью каспаз, что позволяет обнаруживать биосенсора активности в реальном масштабе времени в нейронах Drosophila эмбрионов, но в первую очередь в связи с развитием клеточной гибели. 31 каспазы-зависимую гибель обонятельных нейронов при старении было demonstоценили иммунологического обнаружения каспазы-расщепляется форме КНД биосенсоров (например, mCD8-ППА-Венера). 32,33 Важно отметить, что активированная форма каспазы-3 был обнаружен в отсутствие гибели клеток путем чувствительной immunostain в корешках культивированные нейроны, а в соме с использованием каспазы-зависимой флуоресценции CellEvent репортерного красителя ядерной, но трудности возникли из - за фото-токсичности, хотя гибель клеток было отложено до после устранения позвоночника. 19 Таким образом, новые каспаз биосенсоры необходимы для обнаружения и отслеживать клетки с базальной активности каспазы в естественных условиях.

Для преодоления этих трудностей, мы получили новый двойной цвет каспазы биосенсора, обозначенный CaspaseTracker. Эта стратегия сочетает в себе модифицированную версию Drosophila каспазы-чувствительных Apoliner биосенсора 28 с Drosophila G-волоконные системы FRT рекомбинантному 34 постоянно маркировать и отслеживать клетки в естественных условиях. 35 Gal4-активированная система G-TRACE позволяет очень низкие уровни каспазы активировать CaspaseTracker, что приводит к экспрессии RFP в цитоплазме и постоянное выражение ядерной мишенью GFP в любой клетке, которая когда- либо испытывали активность каспазы. 35 Эта система может маркировать клетки на протяжении жизни в целом животных с использованием дрозофилы, послушным и широко используется модель системы для изучения каспаз и гибели клеток. 36-38

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление CaspaseTracker Мух

  1. Для подготовки CaspaseTracker (DQVD) мух для экспериментов, выполнить этот крест: UBI-CaspaseTracker х G-TRACE (UAS-RFP; UAS-ФЛП; Ubi> Стоп> GFP-NLS), путем передачи 7-10 девственница (или мужчина) мух , несущий каспазы биосенсора субстрат mCD8-DIAP1-GAL4 движимый убиквитин промотора 35 вместе с таким же числом мужчин (или женщин) G-волоконные мух, которые имеют вторую хромосому CYO балансир , чтобы избежать летальности гомозиготных комбинации G- СЛЕД (UAS-RFP, UAS-ФЛП и Ubi> Стоп> GFP-NLS) 34. Место летит в свежей ампуле пищи со свежей дрожжевой пасты в качестве источника белка.
  2. Выдержите файлы при 18 ° С в течение от 5 до 7 дней (максимум 2 недели), а затем удалить родительский мух из флакона, чтобы избежать переполненности с новым потомством, и создать новые селекционные ампул.
  3. Продолжить инкубации при 18 ° С до тех пор, пока потомство мух Эклоз. Выберите не-CYO [не-сURLy крыло] Потомство правильного генотипа CaspaseTracker, которые являются трансгенными для CaspaseTracker и G-35 микроэлементами.
  4. Одновременно, генерировать родительский контроль не трансгенными w118 мух и каспазы-нечувствительной (DQVA) летит параллельно, чтобы проверить конкретную CaspaseTracker RFP и флуоресценции GFP.
  5. Выполните ПЦР генотипирование, чтобы подтвердить файлы с CaspaseTracker с использованием праймеров: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, производя продукт в 3897 пар оснований. Для генотипирования G-Trace локусов, используют следующие праймеров дл GFP (474 ​​п.н.), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3'-CTT CAG CTC GTA GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; для RFP (258 п.н.), 5'-GGC ТГК TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG СТТ GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; и Flpase (655 б.п.), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-НКУ TAC ТАА CGC TCT TTG TTG TCT CTG TCA С. Для генотипирования Gal4 в векторе pUWR (554 п.н.), 5'-GAA GCA CAC СТТ CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Подготовка ткани, Окрашивание и Монтажное

  1. Для мух вскрытий, предотвратить рассеченные ткани от прилипания к пластическим наконечники пипеток и центрифужные пробирки, пальто советы и пробирки с 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), растворенный в воде.
  2. Рассеките летит на силиконовой подушке с помощью щипцов.
    1. Во избежание повреждения кончики щипцов на твердую поверхность при выполнении рассечение тканей, выполняют рассечение на поверхности кремния. Для изготовления силиконовых пластин рассечение, расплавить кремний в коммерческом наборе в соответствии с инструкциями производителя (список материалов). После плавления силикон, добавить 3 до 4 мл в тканевой культуральной чашке диаметром 60 мм. Кремниевые блюда могут быть использованы повторно.
    2. Обезболить муху с CO 2, и передать его на силиконовой пластине с 1 мл холодного PBS. Введем CO 2 во флакон , содержащий муху , используя распылитель, а затем передать наркозом мухи тоа Pad , который имеет запас CO 2.
    3. Используйте пару щипцов, чтобы держать голову летать, а вторую пару щипцов, чтобы вытащить грудную клетку в противоположном направлении, чтобы отсоединить голову летучей от тела, охватывающего не повреждая соединение между головкой и передней кишки.
    4. Используйте 2 пары щипцов, чтобы удалить крылья и ноги из грудной клетки.
    5. Используйте пару щипцов держать грудную клетку, а другая пара щипцов, чтобы вытащить живот, чтобы отделить его от грудной клетки снова, не повредив связь между передней кишки и кишкой.
    6. Проанализируйте внутренние органы , включая мозг, кишечник, мальпигиевых канальцев и яичников , как было показано ранее. 39-41
    7. Удалите все кусочки кутикулы и жир тела с пинцетом, как эти ткани производят сильное аутофлюоресценция. Терпение и практика должны подготовить полную систему органов, как показано на рисунке.
  3. Передача расчлененный ткани в 1,5 мл центрифужные пробирки, и исправить тканей Wiй 0,5 мл 4% параформальдегида в PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) при КТ в течение 20 до 30 мин с вращением в темноте, чтобы избежать отбеливающим RFP и GFP в тканях. Избегайте длительного фиксации, что может поставить под угрозу последующие результаты окрашивания.
  4. Удалите параформальдегид осторожно пипеткой и промыть 3 раза с 0,5 мл PBST (PBS + 0,1% Тритон Х-100) при комнатной температуре.
  5. Проницаемыми ткани с 0,5 мл PBST при 4 ° С в течение ночи при осторожном встряхивании. Более короткие инкубирование может привести к неполному пермеабилизирующего и компромиссом окрашивания результаты.
    1. Если необходимо уменьшить фоновое окрашивание, рассмотреть инкубацией ткани в 0,5 мл PBST с 1% БСА, вместо PBS.
  6. Промыть в ткани 3 раза с 0,5 мл PBST.
  7. Для того, чтобы окрасить ядра и нитчатых актина (F-актин), наносят 0,5 мл PBST с 10 мкг / мл Hoechst 33342 синий ядерный краситель и 0,3 мкМ Alexa Fluor 633 фаллоидином F-актина пятно и инкубировать одновременно с тканями в течение 1 ч при КТ шIth нежный вращение в темноте. Избегайте длительного окрашивания, так как это приведет к увеличению фона.
    1. Для иммунологического окрашивания, инкубировать фиксированной и проницаемыми ткани с 0,1% тритона Х-100 в 0,5 мл PBS в течение ночи при температуре 4 ° С, морилку с 1: 100 разбавлении анти-Elav антителом или с 1: 200 разбавлении анти-каспазы-3 в течение ночи при 4 ° С (300 мкл). Следовать соответствующим вторичным антителом, разведенным 1: 100 и инкубируют в течение от 1 до 3 ч при комнатной температуре. См список материалов для конкретного антитела информации.
  8. Промыть в ткани 3 раза, каждый в течение 5 мин в 0,5 мл PBST при осторожном вращении.
  9. С пипетку, удалите все PBST, а затем добавить 200 мкл анти-отбеливатель крепления агента (см материалы), чтобы полностью покрыть ткани в течение 1-3 ч при комнатной температуре, или 4 ° С в течение ночи. Оптимальные ткани, которые полностью поглощаются монтажный агент будет опускаться на дно пробирки.
  10. Предварительно очистить стекло с водой или 70% этанола и переносят ткани с монтажным агента к Glass слайд.
  11. Аккуратно поместите стеклянную крышку скользить по ткани. Нанести вазелин на предметное стекло и покровным, чтобы избежать разрушения ткани путем пересжатия. Удалить дополнительный монтажный агент с бумажной салфеткой.
  12. Уплотнение крышки скольжения, применяя лак для ногтей все по краям покровного стекла, чтобы избежать утечки монтажа агентов из тканей.

3. конфокальной микроскопии

  1. Используйте перевернутую конфокальной эпи-флуоресцентного микроскопа. Тем не менее, до правые микроскопов могут быть также использованы. Для тканей изображения с помощью черепицу, поддерживать стабильную температуру в помещении, чтобы избежать дрейф фокуса и сдвига плоскости ху из-за теплового расширения и сжатия компонентов. Системы экологического контроля и системы компенсации дрейфа фокус помогают избежать этой проблемы в связи с потерей термопечати равновесия системы микроскопа.
  2. Поместите слайд на столик микроскопа. Сделайте несколько пробных изображений с использованием низкого разрешения (125 х 125 пикселей)d определяют необходимое количество плиток, необходимых для покрытия всей области интереса (ROI).
  3. Установите систему сканирующего микроскопа для захвата изображений с разрешением сканирования, таких как 500 х 500 пикселей. Выбор цели, такие как 20X NA 0,8 или цели План-Apochromat 63X Н.А. 1.4 для анализа тканей через покровные стекла, так что каждое из изображений (плитки) перекрывает на 20% со всех сторон.
  4. Настройка последовательности изображений с длинной до коротких волн возбуждения, так как длинноволновое излучение вызывает более низкое фото-отбеливание. Последовательность из длинной до короткой длиной волны возбуждения: (I) 633 нм для фаллоидином F-актина и на наличие антител к активированному каспаз, (II) 561 нм для ЗП, (III), 488 нм для GFP, и (IV), 405 нм для Hoechst окрашивающий ядра.
  5. Во время визуализации, свести к минимуму воздействие клеток к флуоресцентного лазерного возбуждения при визуализации процесса, чтобы избежать фото-отбеливание за счет уменьшения интенсивности лазерного излучения для получения высококачественных изображений тканей.
  6. После того как ямаги собирают, слияние изображений с помощью программного обеспечения микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Есть два ключевых компонента , которые позволяют CaspaseTracker обнаружить активность каспазы у нормальных здоровых клеток (рис 1а). Первый из них представляет собой 146 аминокислоты каспазы-расщепляться полипептид по образцу каспазы биосенсора Apoliner (рисунок 1b). 28 Этот полипептид получен из DIAP1 (ингибитор дрозофилы апоптоза) , содержащего единственный встречающийся в природе сайт каспазы , который расщепляется во время апоптоз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы проиллюстрируем строительные и внутренние работы CaspaseTracker, которые облегчают обнаружение широко распространенного базальной активности каспазы в здоровых тканях. Критические шаги для обнаружения не-апоптический активность каспазы в естественных условиях являются: 1) формирование мух с биосенсора трансгена, 2) проверки каспазы конкретной функции репортера с соответствующим контролем, 3) практикует методы рассечение соблюдать все внутренние органы и системы взрослого дрозофилы, и 4) отличи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Polan Сантос и Даррен Obbard для дрозофилы иллюстраций на рис. 2а, Марсело Якобс-Лорена для использования инсектарий JHMRI. Эта работа была поддержана стипендией Research Foundation Life Science (ГВУ), Комитет Гранты Университета Гонконга AoE / B-07/99 (MCF) и NIH предоставляет NS096677, NS037402 и NS083373 (JMH). Хо Лам Тан является Shurl и Кей Курчи Foundation сотрудник Life Sciences Research Foundation.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Equipment
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Расходные материалы и реагенты
VectashieldVector ProductsH-1000Монтажная среда
ЩипцыTed Pella#505 (110мм, #5)Пинцет Dumont биологический класс, нержавеющая сталь
Подвесные капельные слайдыFisher Scientific12-565BСтеклянные слайды
Hoechst 33342Молекулярные зондыH1399Окрашивание ДНК
Alexa Fluor 633 ФаллоидинМолекулярные зондыA22284Актиновое окрашивание
Rat-elav-7E8A10 анти-элавантитела Исследования развития Гибридома Банк (DSHB)Идентификатор реестра антител:  AB_528218 Окрашивание для Drosophla pan-neuronal ELAV
Расщепленная каспазаза-3 (Asp175) антителоCell Signaling Technology#9661Окрашивание активного фрагмента каспазы-3
ProLong Gold антифейдный реагентLife TechnologiesP36934для сохранения флуорофоров 
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961для сохранения флуорофоров 
SylGard 182 Комплект силиконовых эластомеровDow Corning Код товара: 0001023934для препарирующих пластин<
LSM780 конфокальный микроскопCarl ZeissN/AImaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000Carl ZeissN/ADrosophila диссекция
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150  WAmScopeWBM99316источник света
td colspan="4">

Ссылки

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8(2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265(2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15(2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437(2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015(2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52(2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223(2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408(2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila melanogasterбиосенсор CaspaseTrackerфлуоресцентный репортерконфокальная микроскопияпрепарирование тканейгенетическое скрещиваниеэкспрессия RFP и GFPрасщепление каспазы
В Vivo биосенсоров Треки Non-апоптотической активности каспазы в Drosophila
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.