Методическая статья

Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака

DOI:

10.3791/53994

⸱

14 мая 2016 г.

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем метод долгосрочной покадровой микроскопии для продольного отслеживания отдельных клеток в ответ на противораковую терапию.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реакция отдельных клеток к противоопухолевых препаратов в значительной степени способствует в определении отклика населения, и, следовательно, является одним из основных факторов в общий результат. Иммуноблоттинг, проточной цитометрии и неподвижные клеточные эксперименты часто используются для изучения того, как клетки реагируют на противораковые препараты. Эти методы очень важны, но они имеют ряд недостатков. Изменчивость в ответах наркотиков между раком и нормальными клетками и между клетками различного происхождения рака, и переходных и редких ответов трудно понять с помощью усреднения населения анализов и не имея возможности непосредственно отслеживать и анализировать их в продольном направлении. Микроскоп особенно хорошо подходит для получения изображений живых клеток. Достижения в области технологии позволяют нам регулярно печатали изображения клетки при разрешении, что позволяет не только отслеживать клеток, но и наблюдение различных клеточных реакций. Описывается подход к деталям, что позволяет за время непрерывной покадровой визуализацииклеток во время реакции лекарственного средства для по существу до тех пор, как хотелось бы, как правило, до 96 часов. Используя вариации подхода, клетки могут быть проверены в течение нескольких недель. С занятости генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоры многочисленных процессов, путей и ответы могут быть соблюдены. Мы покажем примеры, которые включают отслеживание и количественного клеточного роста и прогрессии клеточного цикла, динамика хромосом, повреждения ДНК и гибель клеток. Мы также обсудим варианты техники и ее гибкости, а также выделить некоторые общие подводные камни.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live-клеточная микроскопия и продольное отслеживание отдельных клеток не является новой техникой. С самых ранних микроскопов, энтузиасты и ученые наблюдали и изучали отдельные клетки и организмы, их поведение и развитие 1-3. Известный пример с конца Дэвид Роджерс в Университете Вандербильта в 1950 - е годы показывает человека в нейтрофильный мазке крови чеканка бактерии золотистый стафилококк и в конечном итоге процесс фагоцитоза 4. Этот живой-элементная фильм является прекрасной иллюстрацией того, как множественные процессы можно наблюдать и коррелировать в одном эксперименте: зондирование химического градиента, механики и скорости подвижности клеток, клеток формирует динамику, адгезию и фагоцитоз патогена.

Появление полностью автоматизированных микроскопов и высокочувствительных цифровых камер привело к увеличению числа исследователей с помощью микроскопии задавать фундаментальные вопросы в клеточной биологии в диапазоне Fром , как клетки перемещаются 5,6 и 7,8 разделить на органелл динамику и мембранном 9-11. Нефлуоресцентной, светлого микроскопии, в том числе фазового контраста (ПК), которая получила Нобелевскую премию по Цернике в 1953 году, и дифференциального интерференционного контраста (DIC) позволяют для наблюдения клеток и ядер, но и субклеточных структур, в том числе микротрубочек пучков , хромосомы, ядрышки, органелл динамика, и толстые волокна актина 12. Генетически кодируемые флуоресцентные белки и развитие флуоресцентных красителей против органелл резко повлияли замедленную микроскопию 13-15. Хотя не в центре внимания данной статьи, изображения в клеточных сфероидов и на месте (прижизненной микроскопии) с использованием конфокальной и многофотонной микроскопии представляют собой еще один расширение подхода, и есть выдающиеся статьи , которые используют и обсудить эти подходы 16-19.

Реакции клеток на анти-Канкунеэр препараты или натуральные продукты определяются на молекулярном и клеточном уровне. Понимание клеточные ответы и судьбы после лечения часто включает в себя демографические анализы усреднения (например., Иммуноблоттинг, целые меры а) или фиксированные моменты времени с обнаружением иммунофлуоресцентного и проточной цитометрии, которые измеряют отдельные клетки. Неоднородность в единичных ответах клеток на лекарственные средства в популяции, в частности, в опухолях, может объяснить некоторые из изменчивости в ответ наблюдается вдоль клеточных линий и опухолей, которые лечат тем же лекарством при насыщении. Долгосрочные продольные подходы следовать заданной одной ячейки или популяции клеток является менее распространенным , но очень мощный подход , который позволяет непосредственного изучения путей молекулярного ответа, различные фенотипы (например., Гибель клеток или деление клеток), наблюдение от клетки к клетке изменчивость в популяции, и каким образом эти факторы способствуют динамики реагирования населения 20-22. Оптимистично, будучи в состояниинаблюдать и количественно одиночные клеточные ответы поможет улучшить наше понимание того, как препараты работают, почему они иногда терпят неудачу, и как наилучшим образом использовать их.

Методика долгосрочного покадровой микроскопии, продольного отслеживания и анализа ответов наркотиков доступно для многих исследователей и могут быть простыми, используя только проходящем свете для наблюдения фенотип ответы 20,21. Основные компоненты подхода включают в себя: соответствующий препарат клеток, представляющих интерес, автоматизированный микроскоп с климатической камерой, камера интегрирована с компьютером для получения и хранения изображений, а также программное обеспечение для обзора времени покадровой и измерения и анализа клеток и любые флуоресцентные биосенсоры. Мы предоставляем подробный протокол с большим количеством советов для проведения покадровой микроскопии культивируемых клеток, пока несколько дней с использованием светлого и / или Widefield эпифлуоресцентной микроскопии. Этот протокол может быть использован для любой линии клеток, которые можно выращивать в культуреизучить их ответы на анти-терапии рака. Мы приводим примеры данных, полученных и проанализированных с использованием нескольких различных генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры и пример фазово-контрастной микроскопии, кратко рассмотрим различные типы зондов, преимущества и недостатки долгосрочного покадровой и продольного слежения, что может быть узнал такого подхода, который трудно понять из непрямых подходов, а также некоторые варианты, которые мы надеемся, будет представлять интерес и ценность для неопытных исследователей, которые не считаются с использованием подхода, а также для опытных исследователей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол использует параметры , определенные в опытах на рисунках 4 и 6 относительно установок сбора и условий эксперимента. Многие из этих параметров могут быть изменены , чтобы соответствовать другие эксперименты (например, время экспозиции, биннинговые, флуоресцентные каналы и др.). Все процедуры должны придерживаться организационных принципов и правил и утверждаются комитетом по институциональной биобезопасности. Микроскоп производитель веб-сайты содержат отличную информацию для получения изображений живых клеток.

1. Микроскопия и визуализации программного обеспечения

  1. Выполнение изображений живых клеток на самых разнообразных инвертированных микроскопов. Наиболее распространенными микроскопов Widefield эпифлуоресцентной и прядильно-диск конфокальной. При этом использовать автоматизированный и моторизованных Widefield эпифлуоресцентной микроскоп с 200 Вт источник света металлогалогенные лампы.
  2. Получите сценический верхом или микроскоп климатическую камеру. Здесь используется этап-тор климатическую камеру.
  3. Использование коммерческого программного обеспечения для работы с микроскопами утилит для выполнения покадровой микроскопии.
  4. Используйте коммерчески доступное программное обеспечение или ImageJ для анализа изображений. Многие другие инструменты анализа коммерчески доступны, и есть заказные программы , многие из которых были опубликованы 8,18.

2. Визуальное клеточные процессы и фенотипических ответов

  1. Визуализируйте клетки с светлопольному микроскопии. одна Дифференциальный интерференционный контраст и фазовый контраст может быть очень информативным для изучения ответов на ответы на противораковый препарат. Эти процессы могут включать в себя митоза, подвижность клеток и апоптоз.
  2. Визуализируйте клеточные структуры, органеллы и процессы с люминесцентными биосенсоров. Флуоресцентные зонды являются информативными для отслеживания конкретных субклеточных процессов. Они могут включать в себя динамику микротрубочек, митохондриальной и эндоплазматический ретикулум, динамика накопления белков и локализации, а такжемолекулярной сигнализации (например., фосфорилирование, кальций).

3. Приготовление образцов

  1. Рост клеток в культуре клеток сертифицированных блюд в качестве стандарта, увлажненный клеточной культуры инкубатор (например, 37 ° С, 5% СО 2, 80% относительной влажности воздуха).
    1. Grow HT1080 клеток в МОС с EBSS. Дополнение носитель с 10% об / об FBS, 1% об / об пен / стреп, 1% об / об пирувата натрия и 1% об / об несущественных аминокислот.
  2. За два дня до визуализации, пластины 50000 HT1080 Fucci клеток в 3 лунки 12-луночного # 1.5 со стеклянным дном блюдо в заверенной стерильного капотом ламинарного потока. Отрегулировать количество посеянных клеток для достижения ~ 60% сплошности для начала эксперимента. В зависимости от линии и характера эксперимента плотность клеток клеток может быть меньше.
    Примечание: Плотность клеток может иметь большое влияние на рост клеточной линии и на экспериментальных результатов. Граф клеток, чтобы свести к минимуму эксперимент к эксперименту variabilitу из-за плотности.
    1. В зависимости от окружающей среды камеры и необходимых условий для эксперимента, клетки пластины в отдельных блюд также (как правило, 35- или 60-мм), 4 также 35-мм блюда, 6-, 12- или 24-луночный культуральный пластин, или покровное слайды в различных форматах. Используйте стеклянные пластины с дном # 1.5 из стекла, поскольку большинство линз объектива оптимизированы для этой толщины стекла, и обработки изображений с помощью клеточной культуры пластика очень плохое.
      Примечание: Некоторые клеточные линии, не растут и выживают на стекле. В этих случаях, стекло может быть нанесено покрытие , с тем , чтобы улучшить сцепление клеток (например., Поли-лизин или коллаген). Некоторые фирмы выпускают оптический пластик клеточной культуры, то она должна быть определена опытным путем, если это является жизнеспособным вариантом.

4. Экологическая палата Set-вверх

  1. Перед любым экспериментам, экологическую камеру, устроена таким образом , что он работает на ~ 80% влажности и поэтому температура в месте расположения образца составляет 37 ° С, Наиболее культивируемые клетки растут в 5% воздуха атмосферы СО 2 / баланса вследствие буфера бикарбоната натрия в среде. В зависимости от настройки, либо установить экологический контроллер на 5% CO 2 , и она будет смешивать 100% CO 2 с воздухом, или использовать предварительно смешивают, сертифицированное 5% CO 2 / баланс воздуха газа. Следуйте инструкциям изготовителя газового потока ставок.
    Примечание: Некоторые клеточные линии растут в CO 2 -независимый среды и в этом случае они могут поддерживаться без СО 2. Специально разработанные средства массовой визуализации также доступна, что ограничивает добавление autofluorescent соединений. Рост в тезисах средах для желаемого типа клеток должны быть определены эмпирически заранее.
  2. До начала обработки изображений, убедитесь, резервуар для воды заполнен (следуя инструкциям изготовителя) стерильной дистиллированной водой. Включите климатическую камеру до желаемой установки температуры и поместите его в столик микроскопа врезке. Для экономии газа, не начинайте поток в этой точке,
    Примечание: Если есть свободное пространство между сценой-камерой и верхней ступени врезке и / или какого-либо напряжения на соединительных кабелей к камере может ввести артефакты движения в эксперименте.
    1. Положите кусочки парафиновой пленки по краям сцены вставки отверстия перед установкой камеры в нее, чтобы пара в камеру на сцену, и убедитесь, что соединение не тянет на камеру.
  3. Дайте камере для уравновешивания до 37 о С. Поддержание стабильной температуры для предотвращения колебаний температуры во время формирования изображения, которые могут повлиять на физиологии клетки и ввести дрейф. Достижение уравновешивания температуры обычно требуется от 30 минут до 1 часа, в зависимости от окружающей среды.
    1. Вставьте фиктивного блюдо с водой в лунки в камеру при нагревании. Изображений блюдо наполнен водой имитирует образец, помогая обеспечить камеру достаточно утеплены и стабилизировалась. Заполнение камеры с подогретым стерильной водойсокращает время, необходимое для стабилизации температуры и сводит к минимуму снижение температуры при добавлении исследуемого образца.

5. Микроскоп Настройка

  1. Включите микроскоп, соединенный с компьютером, а также любые необходимые периферийные устройства.
    1. В зависимости от источника света, ждать , чтобы включить его до тех пор , пока это необходимо (например., LED).
  2. С объективной башни в нижнем положении, выберите цель 20X 0.7 NA, который будет использоваться.
  3. Поместите образец над целью - это сделает его легче найти клетки, когда образец находится в камере.
  4. Определить параметры изображения в это время, если они известны из предыдущих экспериментов.

6. Транспортировка клеток к микроскопу и в палате

  1. Транспорта клетки должны быть отображены из инкубатора в климатическую камеру. Убедитесь в том, что это будет сделано быстро , чтобы ограничить влияние сравнительно низким содержанием СО 2 атмосфера и снижение температуры на клетки. Следуйте всем рекомендациям институциональных биологической безопасности для образца транспорта и очистки в случае разлива нефти.
    1. Поместите клетки в герметичном контейнере из пенополистирола или изолированный мешок, чтобы избежать больших изменений в окружающей среде.
  2. Вставьте образец изображения блюдо в камеру следующие инструкции производителя.
  3. После того как клетки были обеспечены в климатическую камеру, уплотнения камеры, чтобы поддерживать стабильную окружающую среду и сразу же включите источник (и) атмосферного газа.
    1. Поскольку некоторые климатические камеры не используют плотно запечатанную крышку, чтобы замедлить испарение, слой стерильного, эмбрион сертифицированное минеральное масло в верхней части ростовой среды. Оберните газ-проникающего парафиновой пленки вокруг периметра края тарелки образца соблюдая осторожность, чтобы не перекрывать зону стекла изображения. могут быть использованы локализованы, вторичные методы увлажнения. Конденсат на крышке образца блюдо может уменьшить perforMance из светлопольному микроскопии.
  4. Для того, чтобы свести к минимуму влияние температурного дрейфа в начале в ходе эксперимента, подождите 30 минут до начала времени покадровой. Необходимое время варьируется в зависимости от размера изображения посуды и других факторов. Определить опытным путем.

7. Настройка визуализации

  1. Выберите условия формирования изображения, которые наилучшим образом представляют данные. Примите меры предосторожности, чтобы избежать фототоксичности путем ограничения времени экспозиции, используя более низкую интенсивность света и выбор зондов, которые возбуждаются более длинных длин волн света.
  2. Определим х, у и г-плоскости и требуемую длину волны (ы) для каждой позиции должны быть отображены. Разрешение по времени ограничено числом позиций и длин волн. Для долгосрочного покадровой большинства клеточных процессов, приобретают одно изображение каждые 10 - 20 мин; более высоким временным разрешением (короткие интервалы, например., 1 мин) обеспечивает больше точек данных и , следовательно , более надежное отслеживание клеток, но и приводит к более интегрированнойвоздействие света и большие наборы данных.
    1. Как HT1080 Fucci имеют динамические зеленый и красный флуоресцентные белки (см Представитель Результаты), используйте следующие времена экспозиции: FITC / GFP - 50 мс, Texas Red / TRITC - 40 мс, Светлое - 20 мс. Используйте 2 х 2 бункера.
  3. Включение программного обеспечения контролируемого автофокусировку с использованием параметров по умолчанию в расширенных настройках. Определить диапазон автоматической фокусировки 10 мкм с рекомендуемым размером шага. Не забудьте сделать это перед началом временной промежуток. Автофокус с Светлое изображениями и никогда с флуоресценции для уменьшения фототоксичности и фотообесцвечивания.
    1. С помощью программного обеспечения под контролем системы автофокусировку на любой микроскоп с моторизованным этапе, так и непосредственно сосредоточиться на образце. Тем не менее, они могут ограничить скорость сбора данных эксперимента. Аппаратные средства контролируются непрерывные фокусирующие системы работают хорошо для покадровой микроскопии и повышения скорости, что позволяет более позиций, которые будут отображены или более высокий уровень приобретения. Тем не менее, ониполагаться на обнаружение границы раздела воздух-стекла и может потерять фокус образца с изменением толщины стекла по всей скважине.
  4. Заменить половину средств массовой информации со средами , содержащими требуемую концентрацию лекарственного средства , которая была подогревают до 37 о С. Частичная замена средств массовой информации помогает уменьшить тепловой дрейф. Условия в этом эксперименте транспортный аппарат (DMSO), 1 мкМ selinexor и 10 мкМ PD0332991.
    Примечание: Этот шаг также может быть сделано после запуска приобретения путем приостановки и возобновления эксперимента. Это позволяет для продольного отслеживания реакций до и после наркотиков одиночных клеток. Если стабильность лекарственного средства или метаболизм является проблемой, делая паузу и замена СМИ можно сделать с помощью того же метода. Для тестирования деградации лекарственного средства или обмена веществ, средств массовой информации из обработанных клеток также могут быть размещены на наивных клеток, чтобы испытать действие препарата.
  5. Начало времени покадровой.
  6. Как проходит заданный промежуток времени, убедитесь, что изображаемого поля остаются в фокусе и Chambeг поддерживает влажную 37 о С.
    1. Отрегулируйте фокусировку по мере необходимости приостановки приобретения в течение промежутка времени между моментами времени.
  7. При необходимости добавить воду в камеру во время длительных экспериментов. Избегайте охлаждения камеры путем добавления предварительно подогретый, стерильной дистиллированной воды при температуре 37 о С.

8. Завершение ЗАМЕДЛЕННАЯ

  1. Когда эксперимент продолжается до завершения, остановить приобретение, если он не был установлен автоматически остановится.
  2. Убедитесь, что заданный промежуток времени был сохранен должным образом на жесткий диск, хотя большинство пакетов программного обеспечения автоматического сохранения во время приобретения, если не закончена должным образом данные могут быть потеряны.
  3. Снимите камеру с микроскопом и распоряжаться клетки в биологически опасные отходы следующим утвержденными процедурами институционального обеспечения биобезопасности.

9. Продольный Отслеживание и анализ Интерв данных

  1. Выберите методологию для анализа, которыйсоответствующие для биологических процессов, представляющих интерес. Многие плагины для ImageJ, программ с использованием MatLab и пользовательские платформы были произведены для конкретных применений. Следующая методика охватывает отслеживание ядер и анализа флуоресцентных зондов ядерных , как показано на фигурах 4 и 5.
  2. Откройте .tif стеки изображения для используемых каналов в ImageJ. В качестве альтернативы, собственные открытые файлы из программы приобретения непосредственно в ImageJ с помощью плагина Bioformats.
  3. Нарисуйте область интереса (ROI) в ядре одной клетки, используя изображение или светлое канал ядерной метки (если используется) и добавить его к менеджеру ROI. Примечание: Если изображаемой клетки имеют ядерную метку (например, гистон Н2В-EGFP.), А затем автоматическое отслеживание клеток может быть использовано для создания областей интереса (трансформирования) , представляющие отдельные ядра с течением времени.
  4. Перейдем к следующему моменту времени и положение ROI в пределах того же nucleus. Добавьте ROI менеджеру ROI.
  5. Продолжать отслеживать и сделать трансформирования для отдельной клетки до тех пор , пока не будет клеточное событие (митоз, апоптоз и др.) Или клетка не может быть больше не отслеживаются (то есть., Перемещается из кадра или завершении эксперимента).
  6. Когда трансформирования созданы для клеток в течение времени они находятся в области, совместимся их на люминесцентные каналы, представляющие интерес. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции в каждом канале для каждой временной точки. Сохранение списка ROI для последующего использования.
    1. Различные измерения могут быть сделаны в пределах ROI для применения в различных экспериментах. Нажмите Анализ → Set Измерения ... чтобы вызвать меню , чтобы выбрать аналитический метод (например., Средняя интенсивность в пределах ROI, интегральной интенсивности и др.).
  7. Примечание судьбы клеток для отдельных клеток (например., Апоптоз, деление, выживание) в то время как отслеживание. Это позволяет для создания кривых выживаемости и furtheАнализ г населения.
  8. При средней интенсивности для обоих каналов, создать график рассеяния для отображения динамики клеточного цикла в ответ на терапевтических средств (Фиг.5В, С).
    Примечание: Графики могут быть созданы для отдельных клеток с течением времени или усредненное по популяции отслеживаемых клеток. Количественная визуализация может иметь решающее значение для установления сложных ответов и отношения клеток в ответ на терапии рака. Долгосрочный покадровой микроскопии, продольное отслеживание и анализ данных представляет собой многоступенчатый процесс, с большим количеством опций для типа микроскопии и анализа инструментов, и следует в общих чертах представленную на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Долгосрочный покадровой микроскопии и прямой продольной слежения позволяет для изучения многих эффектов противораковых во время реакции препарата. После общих чертах на рисунке 1, множественные примеры клеток , экспрессирующих показаны валидацию флуоресцентные репортерам , что лечение с противораковыми препаратами, отслеживаемых, и анализировали с использованием различных подходов.

Одна фаза контрастной микрос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Преимущества Интерв микроскопией и Продольный слежения

Микроскоп является идеальным инструментом для продольных исследований реакции лекарственного средства, поскольку это позволяет исследователям отслеживать отдельные клетки и их судьбы, а также все население. Изменчивость в ответ лекарства в популяции клеток является серьезной проблемой для противоракового терапевтического дизайна. Продольная отслеживание отдельных клеток позволяет исследователям наблюдать эту изменчивость...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джошуа Маркуса за техническую поддержку и Джолиен Тайлер, доктора философии, директора центра лучевой микроскопии Ричарда Макинтоша, за технические советы. Эта работа была поддержана средствами Университета Колорадо в Боулдере и Высшей школы Университета Колорадо в Боулдере для J.D.O. R.T.B. частично поддержана грантом на преддокторскую подготовку от NIH (T32 GM008759). Мы благодарим Karyopharm Therapeutics, Inc. за селинексор и Merck Serono за ингибитор кинесин-5. Плазмиды FUCCI получены из Ацуси Мияваки (RIKEN, Япония) через MTA. mCherry-BP1-2 был от Addgene. HeLa, экспрессирующие H2b-mCherry и β-тубулин-EGFP, получены от Даниэля Герлиха (IMBA, Австрийская академия наук, Австрия).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Таксол (паклитаксел)SigmaT7191стабилизирующий микротрубочки препарат
этопозидSelleckchemS1225ингибитор топоизомеразы II
SelinexorKaryopharm Therapeuticsнаингибитор XPO1/CRM1, подарок
ингибитор кинезин-5Merck Seronoвподарок, также доступный от American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
Клеточная среда для выращиванияHyClone (Fisher) или Mediatechмногие компании доступны
5% CO2 / баланс воздуха, сертифицированныйвоздухZ03NI7222004379
35 мм, стеклянное дно 20 ммCellvisD35-20-1.5-Nмногие компании доступны
35 мм 4-луночная чашка, стеклянное дно 20 ммCellvisD35C4-20-1.5-Nмногие компании доступны
35 мм Тарелка, решетчатое стеклянное дноMatTekP35G-2-14-CGRDмногие компании доступны
Многолуночное, стеклянное дноCellvisP12-1.5H-NМногие компании доступны
Olympus IX81 инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп OlympusOlympus
IX2-UCB контроллерOlympus
PRIOR LumenPro200Prior ScientificLumen200PRO
PRIOR, Proscan III, моторизованный столикPrio ScientificH117
камера STEV, InVivoScientificSTEV. ЭБУ. HC5 STAGE TOP
Блок контроллера окружающей средыInVivo ScientificSTEV. ЭБУ. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD с контроллеромHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon
лазерный запускNikon
SOLA световой модульлюменкор
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
ТОКАЙ ХИТ инклубационная камераТОКАЙ ХИТТИЗШ
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
  5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391(2015).
  35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
  51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Single Cell TrackingHT1080 CellsEnvironmental ChamberFluorescent BiosensorsCell Growth AnalysisChromosome DynamicsDNA DamageCell Death

Похожие статьи