Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель энзимов и бессывороточной Neural стволовых клеток культуры для ЕМТ Исследование Пригоден для обнаружения лекарственных средств

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54018

⸱

23 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) позволяет раку стать инвазивным. Для исследования ЭМП описана модель in vitro на основе нейральных стволовых клеток (НСК), лишенная сыворотки и ферментов. Эта стандартизированная система позволяет количественно и качественно оценить миграцию клеток, экспрессию генов и белков. Модель подходит для разработки лекарств.

Аннотация

Эпителиальные к переходу мезенхимальных (EMT) описывает процесс эпителий transdifferentiating в мезенхимы. EMT является фундаментальным процессом во время эмбрионального развития, что также обычно происходит в глиобластомы, наиболее частой злокачественной опухоли головного мозга. ЕМТ также наблюдалась в нескольких карциномах вне мозга, включая рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак желудка. ЕМТ централизованно связан с злокачественности путем содействия миграции, вторжения и образование метастаз. Механизмы индукции EMT до конца не изучены. Здесь мы опишем систему в пробирке для стандартизированной изоляции корковых нервных стволовых клеток (NSC , ) и последующим EMT-индукции. Эта система обеспечивает гибкость в использовании либо отдельных клеток или эксплант. В этой системе, крысы или мыши эмбриональные переднего мозга NSC, культивируют в определенной среде, лишенной сыворотки и ферментов. В NSCs выражается OLIG2 и Sox10, два транскрипционных факторов наблюдается в oligodendrocклетки-предшественники YTE (OPCs). С помощью этой системы, взаимодействие между FGF - , BMP- и TGF - beta-сигнализации с участием Zeb1, Zeb2 и Twist2 наблюдались где TGF - beta-активация значительно улучшена миграцию клеток, что указывает на синергический BMP- / TGF - beta-взаимодействия. Результаты указывают на сеть, FGF-BMP- и TGF-beta-сигнализации, которые будут вовлечены в ЕМТ индукции и поддержания. Эта модель система актуальна для исследования EMT в пробирке. Он является экономически эффективным и показывает высокую воспроизводимость. Она также позволяет для сравнения различных соединений в отношении их миграции ответов (количественное измерение расстояния) и высокопроизводительного скрининга соединений ингибировать или усиливать EMT (качественное измерение). Модель поэтому хорошо подходит для тестирования библиотек лекарственных веществ, влияющих на EMT.

Введение

В течение нескольких стадиях эмбрионального развития, эпителиальные клетки теряют свою твердую приверженность друг к другу (например, плотные соединения) и приобретают миграционный фенотип в процессе , называемом эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT) 1. ЕМТ требуется для формирования дополнительных типов клеток, таких как мезенхимальные клетки нервного гребня, популяции , которая отделяет от нейроэпителии 2. ЕМТ не является существенным только в течение эмбриональной стадии , но также требуется на более поздних этапах взрослой жизни для поддержания физиологических процессов во взрослом организме, таких как заживление ран 3 и центральной нервной системы (ЦНС) регенерации в демиелинизирующих поражений 4.

Эпителиальные опухоли , как известно , для повторной активации EMT в качестве стадии инициирования по миграции, инвазии и метастазирования, в конечном счете , ведет к прогрессированию рака 1,3. ЕМТ действительно централизованно связан с сильной миграции 1,3. Клеточные шаги Conditioning, инициируя, претерпевая и поддержание EMT до конца не изучены и нуждаются в дальнейшем исследовании.

Здесь стандартизированная система в пробирке EMT модель , основанная на NSCs, с определенными факторами роста и средств массовой информации (без сыворотки и без использования фермента) представлен. Эта модель система имеет значение для ученых, работающих над ЕМТ. Белок семейства Snail, Зеб и Twist было показано , что иметь решающее значение для ЕМТ как в развитии и болезни 1. Улитка, Зеб и Twist семьи также участвуют в представленной системе. Система основана на конкретной области переднего мозга, которые, как правило, не претерпевают ЕМТ обеспечивает особое преимущество для изучения исходных событий во время EMT индукции.

Система модель потенциально может быть применена для изучения EMT в эпителии за пределами центральной нервной системы, так как ключевые EMT индукторы, такие как улитка, Зебом и скрутить белки, также найдены во время EMT в системах тканевых за пределами центральной нервной системы. Эта модель system позволяет стандартизированный изоляцию NSCs от развивающейся коры, чтобы изучить особенности стволовых клеток в целом и, в частности, EMT. С помощью этой системы, мы выделили NSCs, индуцированный ЕМТ и изучали последующую миграцию под действием FGF2 и BMP4. Мы наблюдали, что FGF-и взаимодействует BMP сигнализации с TGF-beta-сигнализации для содействия миграции клеток, что подтверждает модельной системы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных следовали «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных» (NIH публикации, 8 - е издание, 2011 г.) и были утверждены Комитетом по охране животных Базель (швейцарских руководство по уходу и использованию животных) путем. С помощью этих принципов протокол животное считается из "степени тяжести низших животных".

1. Подготовка расширения среды

Примечание: Работа в асептических условиях в качестве стандарта для тканевой культуры.

  1. Возьмем две 15 мл пробирки и добавляют 5 мл L-глутамина DMEM / F12 (1: 1) с 500 мл среды бутылки в каждую из двух 15 мл пробирок. К первой 15 мл пробирку, добавляют 50 мг человеческого Apo-трансферрин, 50 мкл путресцина 1 М маточного (конечная концентрация 0,1 мМ) и 30 мкл селена натрия 500 мкМ сток (конечная концентрация 30 нМ).
    1. Смесь фильтруют через шприцевой фильтр 0,2 мкм в исходную DMEM / F12 бутылки.
  2. Ко второй 15 мл пробирку, добавляют 12,5 мг инсулина. Добавить6 - 9 капель 1 М NaOH. Vortex, чтобы полностью растворить инсулин. Смесь фильтруют через шприцевой фильтр 0,2 мкм в исходную DMEM / F12 бутылки.
    Примечание: NaOH является токсичным и едким веществом. Используйте защитные перчатки, пальто, и защитные очки.
  3. Добавьте 5 мл пенициллина (10000 ЕД / мл) / стрептомицина (10000 мкг / мл) / амфотерицин В (25 мкг / мл) в бутылке / F12 DMEM.
  4. Добавляют 5 мл 200 мМ L-глутамина на складе свеже размороженной или олигопептиды, содержащие глутамин (200 мМ L-аланил-L-глутамин-дипептид) к флакону / F12 DMEM.
  5. Встряхнуть хорошо. Приготовьте 50 мл аликвоты.
    Примечание: Расширение среда может храниться в течение не менее 2-х недель при температуре 4 ° С. Аликвоты трубки показывают меньшие изменения рН среды по сравнению с хранящейся в 500 мл бутылки.

2. Приготовление пассирования среды

  1. К 1 л Ca 2 + - и Mg 2 + -бесплатно HBSS медиа, добавьте 990.85 мг глюкозы (5 мМ конечная концентрация) и 840.10 мг NaHCO 3 (10 мМ конечная концентрация). Отрегулируйте рН до 7,3 с HCl (1 M складочном). Фильтр стерилизовать с фильтром 0,2 мкм и составлять 50 мл аликвоты.
    Примечание: Пассирование среда может храниться в течение не менее 4 недель при температуре 4 ° С.

3. Подготовка факторов роста

  1. Приготовьте стерильную 1X PBS с 1% BSA (PBS-BSA) в одиночку или с соляной кислотой (HCl) при 4 мМ (PBS-БСА-HCl).
    Внимание: HCl вызывает коррозию и токсичен и требует специальных мер безопасности (пальто, очки, перчатки, капюшон).
  2. Растворить 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого фактор роста фибробластов 2 (rhFGF2) в PBS-BSA (10 нг / мл конечной концентрации), 10 мкг / мл рекомбинантного человеческого костного морфогенетического белка 4 (rhBMP4) в PBS-BSA (10 нг / мл, конечная концентрации), и 20 мкг / мл рекомбинантного человеческого фактора роста трансформирующий & beta; 1 (rhTGFβ1) в PBS-БСА-HCl (40 нг / мл, конечная концентрация).
    1. Не фильтровать стерилизовать. Подготовить аликвот.
      Примечание: аликвоты фактор роста можно хранить при-20 ° C в течение по крайней мере 2-х лет.

4. Покрытие клеточных культуральных чашках

  1. Растворите 1,875 мг поли-L-орнитин (ПЛО) в 500 мл дистиллированной H 2 O , чтобы приготовить 250X ПЛО запас. Фильтр стерилизовать с помощью шприца 0,2 мкм фильтр и сделать 2 мл аликвоты.
    Примечание: Эти аликвоты можно хранить при -20 ° С в течение не менее 2-х лет.
  2. Растворите 1 мг бычьего фибронектин в 1 мл стерильной дистиллированной H 2 O , чтобы подготовить 1,000x фибронектина запас. Не вихрь, так как это может свернуться липкий белок. Осторожно встряхните вручную в течение 10 мин.
    1. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре при периодическом встряхивании. Проверка полного растворения. Подогреть раствор до менее чем 37 ° С для полного растворения фибронектина. Не фильтровать-стерилизовать.
      Примечание: Раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Использование плазмы предварительно обработанных пластиковой посуды клеточной культуры (100 мм или другие размеры, требуемые дляэксперимент). Для оценки миграции, используют 35 мм блюда с сеткой 500 мкм. Инкубируйте блюда в течение ночи с 2 мл 1x ПЛО в течение 12 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе тканевых культур с. Промыть два раза с 2 мл 1X PBS.
  4. Добавить 2 мл 1x фибронектина (/ мл конечной концентрации 1 мкг) и инкубировать блюда в течение минимум 12 часов при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Удалить фибронектина как раз перед металлизации клетки.
    Примечание: посуда, покрытой фибронектином, могут храниться в течение не менее 2-х недель при 37 ° С.

5. Унифицированная Вскрытие и подготовка коркового субвентрикулярная зоны (СВЗ)

  1. Получить крысы эмбриональных день 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) и E13.5 мыши (C57BL / 6) эмбрионов от таймерной-спариванию. не Мате животных с 18:00 до 08:00 следующего утра. Полдень после дня вязки считается E0.5.
  2. Обезболить беременных животных с 5% изофлуран и 0,8 л / мин потока кислорода. Проверьте реакцию при сжатии лапой с острым диссперегиба щипцами. Обезглавьте животное. Избегайте CO 2 удушья , как CO 2 влияет на восстановление стволовых клеток.
  3. Получение эмбрионов с помощью кесарева сечения.
    1. Поместите животное в положении лежа на спине и дезинфицировать меха с 70% этанола. Используйте хирургические щипцы и ножницы, чтобы сделать V-образный разрез кожи около 8 см в нижней части живота над маткой. Надрезать только кожа с мехом, сохраняя при этом мышечные стенки нетронутыми.
    2. Используйте свежие щипцы и ножницы, чтобы надрезать мышцы и брюшной мышечной стенки, чтобы войти в брюшину.
    3. Определить матка в нижней задней брюшины. Удалить матку резкого отделения от окружающих тканей.
    4. Промыть матку с эмбрионами с стерильного 1x PBS и место в ледяной 1x PBS.
    5. Используйте остроконечный ножницы , чтобы открыть утробные стены , чтобы освободить эмбрион эмбрионом под микроскопом рассечение (3х кратным увеличением, Фигура 1В). Используйте пару щипцов для удаления эмбриональные оболочки ( Рисунок 1В). Держите эмбрионов в расширительном среде на льду.
    6. Проверьте правильность стадии развития Атласом Проявочной Rat нервной системы 5. Правильный размер эмбриона показан на рисунке 1В.
    7. Проверьте правильность возраста дополнительно наличием начала формирования цифр в передней лапы крысы (FL) , как показано на рисунке 1А.
      Примечание: задняя конечность (HL) еще не показывают цифры разделения (рис 1B).
  4. Для диссекции, трансфер эмбрионов с непокрытыми чашках Петри, заполненных охлажденным льдом 1x PBS. Выполните рассечение под стерео микроскопом рассечение (3X до 20X увеличением) с использованием автоклавного тонких щипцов.
    Примечание: Чашки Петри предотвратить прикрепление ткани к поверхности посуды, которая может произойти с плазменными покрытием посуды для культивирования клеток. Уточненные проволоки иглы вольфрама или аналогичные также полезны для определенных этапов рассечение.
  5. Снимите кожу головы и череп, начиная в интеrsection развивающегося телэнцефалоне (TEL) и диэнцефалона (DI) (рис 1B), потянув одновременно спереди и сзади с двумя щипцами, чтобы получить доступ к развивающейся нервной трубки (рис 1C).
  6. Определение среднего мозга-заднего мозга-граница (MHB, черная стрелка голову на рисунке 1В-D), отделение мезенцефалона (MES) от ромбовидный мозг. Вырезать ромбовидный мозг как раз на уровне или ниже MHB (рис 1D, треугольной стрелкой).
    Примечание: Дополнительное подкожное пространство в MHB облегчает удаление кожи без ущерба для нервной трубки.
  7. Разорвите связь между телэнцефалона / диэнцефалона у основания черепа с лицевого скелета (рис 1E). Это приводит блок , содержащий телэнцефалона, промежуточного и среднего мозга (TEL-DI-MES) (рис 1F-H).
  8. Перенести блок TEL-DI-MES в расширительном среде на льду. Держите его COMPLETEly покрыты в расширительном среде в непокрытую Петри. Держите блок на мезенцефалона с парой щипцов, чтобы избежать касания телэнцефалона, который содержит корковой SVZ с NSCs.
  9. Повторите шаги 5,5 до 5,8 со всеми эмбрионами (рис 1F-H).
  10. Передача одного TEL-DI-MES блок на свежий ледяной 1x PBS. Сокращение вдоль пунктирной линии на переднем мезенцефалона (рис 1F-H), отделяя мезенцефалона от промежуточного мозга, как показано на рисунке 1I.
  11. Отделить DI от TEL разрезанием вдоль пунктирными линиями на рисунке 1F. См изолированный телэнцефалоне на рис 1J.
  12. Разделение двух полушарий конечного мозга, разрезанием вдоль пунктирной линии на рисунке 1J. Это приводит к двум разделенными полушариями , как показано на рисунке 1К.
    Примечание: левое полушарие увеличивается на рисунке 1 л.
  13. Определить срединную бандуlionic Возвышение (MGE, рис 2А; *) и боковые ганглионарный бугорок (LGE, рис 2А; +) виден через interventriculare будущего отверстия.
    1. С помощью пинцета или иглы, рассекают вдоль прямой линии на пересечении между MGE и LGE и передней коры головного мозга (АНТ-CTX, рис 2В). Вырезать прямую через кору, гиппокамп (бедра) и сосудистое сплетение (CP). Это отделяет переднюю кору головного мозга , включая обонятельные луковицы (ОВ) от ганглиозных возвышений (GE, рис 2B, C).
  14. Вырезать вторую прямую линию на пересечении хвостового ганглионарный бугорок (КГЭ, рис 2C, D) и задней коры (рис 2С), опять прорезая кору, гиппокамп и сосудистом сплетении.
  15. Расплющить телэнцефалона. Полностью удалить задний полюс и обонятельной луковицы (рис 2D). идентифицироватькорковый рубчик , содержащий гиппокампе и сосудистое сплетение (рис 2С), как определено выше 6,7.
    Примечание: Гиппокамп имеет более тонкий, чем нейроэпителии коры. CP содержит красные сосуды.
    1. Отделить кортикальный рубчик от коры, в результате чего размер коры , идентичный размеру ганглиозных возвышений (рис 2D). Это приводит к блоку коры (ткани - мишени) и ганглиозных возвышений (GE, рис 2D).
  16. Переверните блок Cortex-GE с желудочковой (внутренней) стороны к поверхности посуды.
    Примечание: Внешняя поверхность полусферы столкнется экспериментатору (рис 2E). На внешней поверхности сосуда являются содержащие Оболочек крови (рис 2E).
    1. Зафиксируйте GE на поверхность тарелки с левой стороны и очистить мозговые оболочки с парой щипцов в правой (доминирующий) стороны (рис 2F ).
      Примечание: Это технически наиболее требовательных шаг, поскольку мозговые оболочки сильно прилипают к коре головного мозга. Разделение оболочках из коры облегчается за счет сокращения совершенно прямую линию (не зазубренный) на этапах 5.13.1 и 5.14.
  17. Повторите шаги 5,12 до 5,16 для другого полушария и всех эмбрионов. Обрежьте корку вдоль LGE на расстоянии половины основного диаметра LGE (рис 2G, 2H). Расчлененный коры головного мозга охватывает область 1,2 мм х 2,4 мм (рис 2Н) и включает в себя СВЗ / зародышевый слой с NSCs.

6. Подготовка эксплантата культур

  1. Отрежьте корку в эксплантатах диаметром менее 400 мкм (рис 2i). Используйте сетку с 400 мкм (Дополнительный рисунок 1) , расположенную ниже рассечение чашки Петри для справки (рис 2Н и 2I). Передача всех эксплантов в свежую чашку Петри с льдом соЛ.Д. расширение среднего.
  2. Удалить фибронектина из тканевой культуры блюдо (шаг 4.4). Дайте ему высохнуть. Добавляют 1 мл среды холодного расширения в центре 35 мм блюдо с сеткой размерностью 10 мм х 10 мм (рисунок 3). Разрешить среда для формирования сферической капли (рисунок 3).
  3. Вставьте до 8 эксплантов в центре капли. Эксплантаты должен быть идеально расположен на сетке, по меньшей мере, 3 мм расстояние между друг с другом для анализа миграции (см раздел 8).
  4. Инкубируйте блюдо в течение приблизительно 1 часа в инкубаторе для клеточных культур (37 ° C, 21% O 2, 5% СО 2) для прикрепления эксплантов. Разрешить эксплантаты отстояться и прикрепляются к поверхности, покрытой фибронектином. Не трясите блюдо, так как эксплантов может отсоединиться и выйти из оптимального центра сетки.
  5. Через 1 ч инкубации (37 ° С, 21% O 2, 5% СО 2), заполнить блюдо в общем объеме 2 мл среды расширения плюс роста Fактеры или вещества, представляющие интерес для тестирования и инкубировать.
    Примечание: Ни один ферментативное расщепление, ни в сыворотке крови или центрифугирование необходимы для подготовки эксплантов. Это является оптимальной для целостности клеток.

7. Подготовка НСК одноклеточ- культуры

  1. Разминка расширение и пассирования среду при 37 ° С.
  2. Передача расчлененные части коры (от стадии 5.17) в 15 мл пробирку со средой холодной расширения (труба A). Центрифуга коры головного мозга штук в течение 5 мин при 1200 х г. Аспирируйте супернатант. Добавить 200 мкл среды предварительно нагреты расширения для ресуспендирования коры головного мозга штук.
  3. Добавьте 700 мкл подогретого пассирования среды к 15 мл трубки с наконечником P1,000 (труба A). Аккуратно ресуспендируют осадок. Поместите наконечник в нижней части 15 мл трубки. Аккуратно и медленно диссоциируют кусочки ткани путем отсасывания три раза с наконечником P1,000.
    Примечание: Пассирование среда способствует разделению клеток и требуется, чтобы избежать использования ферментов.
  4. Дайте трубку сидеть в течение 30 до 60 секунд для больших (тяжелых) недиссоциированных части, чтобы осесть на дно. Одиночные диссоциированные клетки остаются в надосадочной жидкости. Помещают около 700 мкл супернатанта в свежую 15 мл трубки (трубки B).
  5. Повторите шаги 7.3 и 7.4, чтобы отделить большие куски.
  6. Повторите шаги 7.3 и 7.4 во второй раз, чтобы отделить крупные куски. Перенесите все супернатант в свежую 15 мл трубки (трубки B).
  7. Добавить расширительный среду до общего объема 5 мл. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Оценка омертвевших клеток трипановым-синим окрашиванием.
    Примечание: Малые NSCs переносят шаги 7.2 до 7.6 лучше, чем большие клетки. Из 10 эмбрионов ожидают около 4 × 10 6 клеток с 10% мертвых клеток.
  8. Для расширения NSCs, пластины 1,5 × 10 6 клеток на 10 см , покрытой фибронектином блюдо культуры ткани в объеме 8 мл среды расширения. Для стандартного расширения, добавьте 8 мкл 1,000x rhFGF2 запаса. Добавить 8 мкл rhFGF2 каждый день и изменить менядиам каждый день.
    Примечание: Кора на данном этапе развития содержит большинство NSCs и лишь меньшинство дифференцированных клеток. Дифференцированные клетки меньшинства не реагируют на rhFGF2 обращения и умирают во время культивирования расширения.
  9. Проход расширился NSCs на 60% слияния.
    1. Для прохождения NSCs, удалите расширения среды. Вымойте клетки быстро три раза с 5 мл пассирования среды. Подождите 2 - 4 мин. Без Са 2+ и Mg 2+ клетки медленно отделяться от поверхности, округление. Проверьте отряд клеток под микроскопом фазы. Подождите еще несколько минут, если это необходимо, пока не наблюдается визуально отрыв от поверхности.
      Примечание: Отдельные клетки полностью отделить, но большинство клеток будет по-прежнему придерживаться поверхности посуды. Продолжительность, необходимое для отрыва зависит от продолжительности фибронектина покрытия. Короткий фибронектина покрытие (12 ч или менее) приводит к более быстрому открепления клеток. Для более длительных экспериментов (>; 1 неделя) фибронектина покрытие более 24 ч рекомендуется.
  10. С помощью 10 мл пипетки, чтобы аккуратно открепления клеток с поверхности. Собирают пассирования среду 5 мл с клетками и передавать его в свежую 15 мл пробирку. Повторите с дополнительными 5 мл пассирования среды.
  11. Диссоциируют клеток в 15 мл пробирку с помощью пипетки вверх и вниз три раза, помещая 10 мл пипеткой в ​​нижней части трубы. Спин пробирку в течение 15 мин при 1200 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 2 мл среды расширения. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Используйте трипановым синим для оценки мертвых клеток.
    Примечание: После расширения до 60% слияния, ожидать 4 - 5 × 10 6 клеток с мертвой подсчета клеток на уровне около 10%.
  12. Пластина 8 х 10 5 клеток на 10 см блюдо для дальнейших пассажей.

8. Оценка миграции

  1. Для оценки миграции, изолировать эксплантов в соответствии с разделом 5. Семя эксплантов в35 мм сетки блюда. Через час после посева, добавьте FGF2 (rhFGF2). Поместите блюда в инкубаторе C 37 ° в течение 2-х дней.
    Примечание: Для оптимального крепления эксплантов, избегать перемещения блюд.
  2. Удалить среду на 1000 мкл кончика. Добавляют 2 мл расширения среды на 1000 мкл кончика , начиная с внутренней окружности (рисунок 3). Это уменьшает поверхностное натяжение на эксплантов.
  3. Добавьте факторы роста сами по себе или в комбинации, как требуется для эксперимента. Используйте FGF2 / BMP4 / TGF 1 в качестве положительного контроля. Примечание: В этом эксперименте, 2 мкл FGF2 на 35 мм блюдо, 2 мкл BMP4 и 4 мкл TGF 1 добавляют отдельно и в комбинации (рисунок 5).
    1. Добавление дополнительных факторов и / или тестируемых веществ. Держите посуду снова нетронутым в течение 2 дней при температуре 37 ° С.
  4. Возьмите фотографии эксплантов на инвертированный микроскоп.
    Примечание: Живые эксплантов дают лучшие изображения фазового контраста, чем фиксированные клетки. Оба они могут быть использованы.
  5. Для миграцииоценки, использовать графическое программное обеспечение , которое позволяет производить измерения элементов изображения (например, Фиджи 8).
  6. Измерьте блюдо сетки на расстоянии 500 мкм в пикселях и использовать его в качестве внутреннего стандарта.
  7. Определить центр эксплантов в качестве начальной точки миграции. Измерьте расстояние между центром эксплантов и внешней группой из 10 клеток.
    Примечание: Все клетки мигрируют центробежно от эксплантов. Они спонтанно образуют лист на периферии при обстоятельствах тестируемых (рисунок 5).

9. Оценка вторжения

  1. Готовят покрытой фибронектином культуры ткани, 24-луночные планшеты в соответствии с разделом 4 Протокола.
  2. Поместите 300 мкл теплой среды расширения в верхнюю лунку инвазии клеток камер. Инкубируйте камеры в течение 30 мин при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  3. Удалите среды расширения из верхней скважины и поместите камеру Бойдена в покрытую пластину 24-луночного.
  4. Добавить 500 мкл теплой среды расширения с 0,5 мкл rhFGF2 и 0,5 мкл rhBMP4 до дна скважины.
  5. Прохождение NSCs и подсчитывать, как описано в разделе 7. Проходы 1 до 4 пригодны.
  6. Пластина 5 х 10 5 клеток в объеме 300 мкл теплой среды расширения с 0,3 мкл rhFGF2 и 0,3 мкл rhBMP4 в верхней лунке камеры Бойденом.
  7. Культура сеяные NSCs в течение 24 часов.
  8. Добавьте дополнительные факторы и / или тестируемых веществ в камеру и культуре клеток в течение еще 48 часов.
    Примечание: Если клетки являются инвазивными, они будут проходить от верхней скважины через базальной мембраны слоя до забоя скважины. Инвазивные клетки будут цепляться к нижней части камеры Бойден.
  9. Следуйте протоколу, предоставляемая производителем. Используйте ватные тампоны (входит в состав набора для анализа вторжения), чтобы удалить неинвазивных клетки в верхней скважины путем очистки в два раза.
  10. Удалите среду из лунок и добавляют среду расширения 500 мклплазменной мембраны пятно для живых клеток и с DAPI ядерной красителя в лунки.
  11. Инкубировать в течение 10 мин при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
    Примечание: красители будут интегрированы в мембрану и ядра инвазионных клеток, соответственно, для оптимальной визуализации 8. Вариант: Опустить мембранный краситель плазмы при многоцветной иммуноцитохимия планируется.
  12. Удалите среду с красителями и дважды моют с расширением среды. Визуализируйте и считать инвазивные клетки с перевернутой флуоресцентного микроскопа , как было показано ранее 8.
    Примечание: Некоторые инвазивные клетки могут быть отделены от нижней части камеры и упала на поверхность значительно ниже, где они прилипают к поверхности с покрытием. Для полного анализа включают клетки на поверхности скважины.
  13. Удалите среду и фиксации клеток в ледяном свежие 4% PFA в течение 10 мин. Вымойте 3x с 1x PBS. Выполните иммуноцитохимии по инвазивным клеток, как описано выше 8-10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эта система модель ЕМТ основана на стандартизированном изоляции NSC , как в виде отдельных клеток или в качестве эксплантов из определенной области развивающейся нервной трубки, центральная кора головного мозга (фигуры 1 и 2). Для количественной оценки, эксплантаты высевают право в центре 500 мкм сетки блюдо культуры (рисунок 3). Эксплантатов центральной коры вначале были облучены FGF2 в течение двух дней, а затем еще на два дня в различ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании стандартизированная система EMT анализа с использованием NSCs описана (суммированы в дополнительном рисунке 3). Стандартизация обеспечивает воспроизводимость (таблица 1 и 2). Эти NSC, происходят из развивающейся коры, ткани, которые обычно не претерпевает ЕМТ. Это является преимуществом для анализа ранних этапов в ЕМТ. Первые шаги в ЕМТ не могут быть адекватно изучены в опухолевых клетках, которые накопились генетические изменения, и, возможно, уже принятых функции Е...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследование проводилось при поддержке Университета научного фонда Basel и Швейцарского Национального научного фонда за счет гранта в MHS и АГ (SNF IZLIZ3_157230). Мы благодарим: д-р Tania Ринальди Буркат за щедрое предоставление инфраструктуры; все члены группы Bettler для обсуждения и замечания. Мы благодарим Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Швейцария) для профессионального и грамотного монтажа Full HD видеокамеры MC170 (Leica Microsystems, Швейцария).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BMP4, rhBMP4RnD Systems 314-БП-01М
Инсулин поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma I1882
Камера Бойдена, анализ клеточной инвазии CytoSelectCell BiolabsCBA-11024-луночная система планшетов
Чашка для клеточных культур с сеткойIbidi 500 мм, 35 мм80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045Краситель для плазматической мембраны, использование в соотношении 1:1,000.
DAPILifeTechnologiesD1306Stock в дозе 5 мг/мл. Используйте в соотношении 1:10 000. Канцерогенный. Требуется соответствующая защита (перчатки, пальто, очки).
DMEM/F12 1:1 средний флаконGibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
Фибронектин, бычий Sigma F4759
Добавка Глутамакс Gibco Invitrogen 35050-061
Графическое программное обеспечение с функцией измерения пикселейFijifiji.sc/Fijiверсии 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS mediaSigma H9394
Человеческий апо-трансферринSigmaT1147Возможный раздражитель легких. Избегайте вдыхания. Используйте соответствующую защиту.
L-глютаминGibco Invitrogen 25030-024
Нестин, мышиное антитело против нестинаGenetexGTX26142использование в 1:100, 4% фиксация PFA, Triton X100 в дозе 0,1%
Olig2, антитело кролика против Olig2Предоставлено Hirohide TakebayashИспользованиев соотношении 1:2,000, фиксация PFA 4%, Triton X100 в дозе 0,1%
пенициллин/стрептомицин/фунгизонGibco Invitrogen 15240-062
Подопланин, антитело к подопланинумыши AcrisDM3614PИспользовать при 1:250, 4% фиксации PFA, избегать Triton X100
Poly-L-орнитинSigma P3655
ПутресцинСигма P5780Раздражитель кожи и глаз. Требуется соответствующая защита.
Селенит натрияSigma S5261
Sox10, Кролик против Sox10 антителоMillipore ChemiconAB5774Использование при 1:200, 4% фиксация PFA, Triton X100 при 0,1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
Чашки Петри без покрытияFalcon Corning351029

Ссылки

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Нейральные стволовые клеткииндукция ЭМПэксплант-культурамиграция клетоксигналинг TGF-бетаобработка BMP4диссекция корыпокрытие фибронектиномвысокопроизводительный скрининг
Модель энзимов и бессывороточной Neural стволовых клеток культуры для ЕМТ Исследование Пригоден для обнаружения лекарственных средств
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.