Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Расширенная Покадровый прижизненной визуализации в режиме реального времени многоклеточных Динамика в опухоли микроокружения

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54042

⸱

12 июня 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Radiology, Albert Einstein College of Medicine, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование многофотонной микроскопии для выполнения расширенного замедленную съемку многоклеточных взаимодействий в реальном масштабе времени, в естественных условиях в одном разрешении клеток.

Аннотация

В микроокружении опухоли стромальные клетки хозяина взаимодействуют с опухолевыми клетками, способствуя прогрессированию опухоли, ангиогенезу, распространению опухолевых клеток и метастазированию. Многоклеточные взаимодействия в микроокружении опухоли могут приводить к преходящим событиям, включая направленную подвижность опухолевых клеток и проницаемость сосудов. Для количественной оценки проницаемости сосудов опухоли часто используются конечные эксперименты для измерения экстравазации сосудистых красителей. Однако из-за преходящего характера многоклеточных взаимодействий и проницаемости сосудов кинетика этих динамических событий не может быть различима. Путем мечения клеток и сосудистой сети инъекционными красителями или флуоресцентными белками, покадровая прижизненная микроскопия с высоким разрешением позволила в режиме реального времени напрямую визуализировать переходные процессы в опухолевом микроокружении. В данной статье мы опишем метод использования многофотонной микроскопии для выполнения расширенной прижизненной визуализации у живых мышей с целью непосредственной визуализации многоклеточной динамики в микроокружении опухоли. Этот метод детализирует стратегии клеточного мечения, хирургическую подготовку кожного лоскута молочной железы, введение инъекционных красителей или белков через катетер хвостовой вены и получение покадровых изображений. Покадровые последовательности, полученные с помощью этого метода, облегчают визуализацию и количественное определение кинетики клеточных событий подвижности и проницаемости сосудов в микроокружении опухоли.

Введение

Распространение опухолевых клеток из первичной опухоли молочной железы было показано, включать не только опухолевые клетки, но у себя стромальных клеток, включая макрофаги и эндотелиальные клетки. Кроме того, сосудистую сеть опухоли является ненормальным с повышенной проницаемостью 1. Таким образом, определение того, как опухолевые клетки, макрофаги и эндотелиальные клетки взаимодействуют посредничать проницаемость сосудов и опухолевых клеток intravasation в микросреды первичной опухоли имеет важное значение для понимания метастазирования. Понимание кинетики проницаемости сосудов, опухолевых клеток intravasation и основной механизм передачи сигналов многоклеточных взаимодействий в микроокружение опухоли может предоставить важную информацию в разработке и введению анти-терапии рака.

Основным средством изучения опухолевой сосудистой проницаемости в естественных условиях было измерение экстраваскулярных красителей , таких как голубой Эванса 2, декстраны с высокой молекулярной массой (155 кДа)3 и флуорофор или радиоиндикаторные-конъюгированные белки ( в том числе альбумин) 4 в фиксированные моменты времени после инъекции красителя. Достижения в области микроскопии, животные модели и флуоресцентные красители позволили визуализации клеточных процессов и проницаемости сосудов в живых животных через прижизненной микроскопии 5.

Живое животное изображений с приобретением статических изображений или короткое время покадровой последовательностей в течение нескольких моментов времени не позволяет для полного понимания динамических событий в микроокружение опухоли 6,7. В самом деле, статическое получение изображений в течение 24 часов , показали , что опухоль сосудистая негерметичен, однако динамика проницаемости сосудов не наблюдалось 6. Таким образом, расширенное время непрерывной покадровой изображений до 12 часов захватывает кинетики динамических событий в микроокружение опухоли.

Этот протокол описывает использование расширенного покадровой multiphotна прижизненной микроскопии для изучения динамических многоклеточные событий в опухоли микроокружения. Несколько типов клеток в опухоли микроокружения помечены инъекционные красителей или с использованием трансгенных животных, экспрессирующие флуоресцентные белки. Использование вены катетер хвоста сосудистые красители или белки могут быть инъецированы после начала обработки изображений для получения кинетических данных многоклеточных событий в микроокружение опухоли. Для получения изображений живых клеток опухоли молочной подвергается через хирургической подготовки кожного лоскута. Изображения приобретаются на срок до 12 часов с использованием многофотонного микроскопа , оборудованного с несколькими фотоумножителей (ФЭУ) детекторов 8. При использовании соответствующих фильтров, алгоритм вычитания позволяет 4 детекторов PMT приобрести 5 флуоресцентные сигналы в опухоли микроокружения одновременно 9. Высокое разрешение многофотонная прижизненной микроскопии захватывает одного элемента разрешения визуализации опухоли стромы взаимодействий в микроокружение опухоли, что приводит к лучшему Understanding проницаемости сосудов и intravasation опухолевых клеток 10-13. В частности, расширенные прижизненной визуализации выявили высоколокализованной, транзиторные сосудистых событий , которые происходят проницаемости селективно на участках взаимодействия между опухолевой клетки, макрофаг и эндотелиальных клеток (определяемой как Опухоль микросреде метастаз, TMEM 14) 13. Кроме того, опухолевые клетки intravasation происходит только при TMEM и пространственно и временно коррелирует с проницаемостью сосудов 13. Одно разрешение клеток динамики этих событий стало возможным благодаря использованию расширенного покадровой многофотонной микроскопии флуоресцентно меченых клеток в опухоли микроокружения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с действующими нормами и правилами для использования позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения колледжа Альберта Эйнштейна медицины Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Создание флуоресцентно меченных Опухоли и ассоциированные с опухолью макрофаги

  1. Сформировать флуоресцентно меченных опухолевых клеток путем скрещивания спонтанное, автохтонное, методами генной инженерии молочной железы мышей модели рака , где вирус опухоли длинный концевой повтор молочной железы мышей приводит в движение полиома средний Т - антиген (MMTV-PyMT) с трансгенных мышей с флуоресцентными репортерами [то есть усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP), усиливается бирюзового флуоресцентный белок (ECFP) или Dendra2] 8,9.
  2. Флуоресцентно макрофаги этикеток в PyMT животных с флуоресцентно меченных опухолевых клеток путем скрещивания генетически сконструированные модели мыши с myeloid- и macrophage- конкретных флуоресцентных репортеров [т.е. MacGrееп 15 или MacBlue мышей Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
  3. В качестве альтернативы, генерировать флуоресцентно меченных опухоли через ортотопической трансплантации флуоресцентно меченных опухолевых клеток PyMT (сингенных), линии клеток рака молочной железы человека или первичных производных больного человека опухолей (ксенотрансплантатов) 11,17.
    1. Имплантат флуоресцентно меченных PyMT выход опухолевых клеток в сингенных мышей с флуоресцентным белком-меченых миелоидных клеток генерировать животных с флуоресцентно меченый опухолевых клеток и миелоидных клеток 13.
  4. Вводят 100 мкл 10 мг / кг флуоресцентный 70 кДа декстрана путем внутривенной (IV) в хвостовую вену в тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID) мышей с ксенотрансплантатов опухолей клеточных линий человека или первичных опухолей пациентов, полученных на флуоресцентно макрофагов этикетки 2 ч до начала прижизненной визуализации.

2. Настройка микроскопа и обработки изображений Подготовка

Примечание: Эта процедура описывает настройкудля прижизненной визуализации на многофотонном микроскопа 8.

  1. Включите все микроскопа и лазерных компонентов, включая двухфотонными лазеров и детекторов.
  2. Включите поле нагрева до 30 ° С, чтобы предварительно нагреть почву. Этот шаг имеет решающее значение для поддержания физиологической температуры животного.
  3. Для использования на инвертированный микроскоп месте выполненный на заказ этап вставки на столик микроскопа. Обычай вставка представляет собой лист толщиной 1/8 "алюминий механической обработке, чтобы поместиться в стадии вставки пространства и с 1" диаметр сквозного отверстия в центре для работы с изображениями.
    1. Протереть столик микроскопа и этап вставки с 70% этанола и сухого воздуха.
    2. Поместите большой капли воды на объектив микроскопа 20X, 1,05 NA поддерживать оптический контакт с защитным стеклом.
    3. Место покровного стекла (# 1,5 толщина) через порт формирования изображения на столике микроскопа вставки. Закрепить на месте с помощью лабораторной лентой.
    4. Используйте дырокол пробить 2 см х 2 см отверстиев гибкой резиновой прокладки и поместите резиновую прокладку на столике микроскопа с отверстием в прокладке совмещено с отверстием в пользовательской стадии вставки.

3. Получение хвостовую вену катетером и реагенты для инъекций во время съемки

  1. Сокращение длины 30 см из полиэтилена (ПЭ) труб.
  2. Использование щипцов, переместите металлическую иглу 31 G иглу назад и вперед, пока она не обрывается пластиковой арматуры.
  3. Использование щипцов, вставьте тупой конец иглы в отдельных ПЭ труб.
  4. Вставка 31 G иглу в другой конец трубки PE.
  5. Заполните 1 куб шприц со стерильным фосфатным буферным раствором (PBS) и вставить его в 31 G иглы и промойте весь воздух из трубки и иглы с PBS. PBS , используется для поддержания гидратации и осмолярности крови 9,18, также могут быть использованы , однако изотонический солевой раствор.
  6. Заполните 1 куб шприц с 200 мкл 3 мг / кг 155 кДа декстрана-тетраметилродамин (TMR) Или квантовые точки для сосудистой маркировки.
  7. Приготовьте любые другие инъекционные белки , такие как 165 аминокислотного изоформы сосудистого фактора А роста эндотелия (VEGFA 165) в 1 куб.см шприцем и помещают на лед. Вводят 0,2 мг / кг VEGFA 165 19 при концентрации 0,05 мг / мл.

4. Размещение пребывающей в хвостовую вену Катетера

  1. Место животное под анестезией с использованием индукционной камере с 5% изофлуран с O 2 в качестве газа - носителя.
  2. Перенесите мышь к хирургическому платформе, когда он будет полностью под наркозом и не отвечает на носок крайнем случае.
  3. Открыть изофлуран анестезии линии хирургической платформы, закрыть анестезию линию к индукции камеры и поместите носовой конус над мордой животного. Снизить изофлуран от 5% до 2,5%.
  4. Применение глазной мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
  5. Нагреть животное под нагревательной лампойеще в течение 2 мин, чтобы увеличить циркуляцию в хвосте, как циркуляция замедляется с глубокой анестезией.
  6. Стерилизовать хвостовую вену мыши с 70% этанола.
  7. Вставьте кончик 31 G иглы из катетера, выполненного в разделе 3 в боковую хвостовую вену животного и толкать иглу в 2-3 мм.
  8. Отступите на шприц, чтобы увидеть кровь, обеспечивая катетер помещают в хвостовую вену.
  9. С помощью 1 см длины лабораторной ленты размещены над иглой, чтобы удерживать иглу на месте параллельно с веной вдоль длины хвоста.

5. лоскут кожи хирургическая процедура, чтобы Выставляют опухоли молочной железы

  1. С животного на платформе хирургической тампоном опухоли и вентральной поверхности с 70% этанола. Примечание: Как описано выше, эта процедура не выполняется полностью в асептических условиях. Для длительных сеансов визуализации, где инфекция может стать сбивающий фактор, то рекомендуется использовать правильную технику асептики.
  2. Использование STERIле щипцов, поднимите брюшного кожу и стерильными ножницами сделать подкожный надрез вдоль вентральной срединной линии примерно на 1 см в длину. Избегайте прокалывание брюшины во время разреза.
  3. Аккуратно разрезать соединительную ткань имеется молочную железу и опухоль от брюшины подвергать опухоли молочной железы.
  4. Используя ножницы и пинцет, аккуратно удалите и срезаем фасции и жир с открытой поверхности опухоли при сохранении целостности опухолевой сосудистой и сводя к минимуму кровотечение. Этот шаг имеет решающее значение в поддержании архитектуры опухоли и сосудистой снабжение опухоли.

6. Подготовка животных для микроскопии

  1. Перенести животное на сцену подогретого визуализации с облученной опухоли, размещенной на покровное на этапе вставки над объектива микроскопа для работы с изображениями. Позаботьтесь перевести хвостовую вену катетер осторожно с животным, чтобы не смещать иглу.
  2. Место йе анестезии носа конус над мордой животного для поддержания анестезии набор на 3% изофлуран.
  3. Поместите животное так, чтобы опухоль лежит в отверстие резиновую прокладку и вступает в контакт с покровным стеклом.
  4. Используйте две резиновые прокладки, чтобы мягко держать опухоль на месте и зафиксировать их на столике микроскопа с лабораторным лентой, чтобы уменьшить движение во время захвата изображения.
  5. Наполните камеру от резиновую прокладку с PBS, чтобы сохранить ткани гидратированный и поддерживать оптический контакт с покровным.
  6. Начать мониторинг жизненно важных признаков животного с пульсоксиметр зондом. Приложить датчик клип на бедро животного. В качестве альтернативы можно использовать хомут, который выполнен с возможностью установки вокруг шеи.
  7. Поместите коробку нагрева над животным для поддержания 30 ° C 20.
  8. Медленно уменьшить уровень изофлуран до 0,5-1% для поддержания анестезии и поддержания кровотока.

7. Получение изображения и инъекция Fluorescлор Красители и инъекционные Белки

  1. Использование фокус окуляра микроскопа на флуоресцентном опухолевых клеток на поверхности опухоли.
  2. Выберите интересующую область, находя участки с распущенными кровеносных сосудов. Выбор области интереса плавных кровеносных сосудов является критическим для оценки сосудистую сеть опухоли.
  3. После того, как область интереса выбран переключатель микроскопа в режим многофотонном визуализации.
  4. Установите верхний и нижний пределы в Z-серии. Установить верхний предел Z-серии с помощью фокуса регулятора для перемещения цели в нужное место начала и нажав на кнопку позиции Z "Top". Определить верхний предел Z-серии, визуализовав сеть из волокон коллагена на поверхности опухоли в канале генерации второй гармоники (SHG) и наблюдения, когда никакие клетки, но только коллагеновые волокна не видны.
    1. Установите нижний предел серии Z, перемещая цель на нужную глубину изображения (TypicaLLY 50 - 150 мкм) и нажав на кнопку Z позицию "Bottom".
    2. Устанавливает размер шага, введя нужное значение в поле размера шага. Определить размер шага на основе соображений, для разрешения и времени приобретения (как правило, используется 2 мкм для 3D реконструкции высокого разрешения и в противном случае 5 мкм).
  5. Установить интервал времени покадровой путем переключения на панели Time-Lapse и введя желаемое время впасть в поле Time-Lapse. Для оптимального временного разрешения установить интервал времени до 0 сек для непрерывной визуализации. Примечание: в течение длительного времени покадровой съемки рекомендуется установить интервал времени до 10 секунд между приобретениями для пополнения объективного иммерсионной жидкости.
  6. После того как параметры для визуализации определены, медленно вводят 155 кДа декстрана-TMR.
    1. Удалите шприц с PBS в хвостовую вену катетер и заменить шприц, содержащий 155 кДа декстрана-TMR, стараясь не вводить никаких пузырьков в Liсеверо-восток
    2. Медленно впрыснуть 155 кД декстраном TMR в мышь, с максимальным объемом 200 мкл, и заменить шприц с шприц, содержащий PBS. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Выполните инъекцию медленно и принять меры предосторожности, чтобы избежать попадания раствора вне вены.
  7. Начало приобретение покадровой обработки изображений Z-стека, нажав на Z-Stack и кнопки ЗАМЕДЛЕННАЯ нажимать их, а затем нажав на кнопку записи.
  8. Если другие флуоресцентные декстраны, то есть, 10 кДа декстран-изотиоцианат флуоресцеина (FITC), или белки, т.е. VEGFA 165, были подготовлены заранее, вводить их после начала захвата изображения для при = 0 мин начала.
    1. Удалите шприц с PBS в вену катетера хвост и заменить шприц , содержащий 10 кДа декстрана-FITC или VEGFA 165, стараясь не вводить никаких пузырьков в линию.
    2. Медленно вводят уколы в мышь через хвостовую вену катетери заменить шприц с помощью шприца, содержащего PBS.
  9. Каждый 30-45 мин, медленно вводят 50 мкл PBS или физиологический раствор для поддержания гидратации животного.

8. Эвтаназия

  1. При прекращении получения изображения, усыпить животное.
    1. Увеличение изофлуран до 5%.
    2. Держите животное под 5% изофлуран до 30 секунд после того, как она перестает дышать и удалить животное со сцены.
    3. Выполните шейки дислокации, чтобы обеспечить полную эвтаназию.

Обработка 9. Изображение

  1. Получение изображений на 16-битных файлов TIFF для каждого отдельного канала в каждый момент времени и сохранить последовательно.
  2. Выполните разделение спектрального перекрытия (т.е., GFP и CFP), устранение ху дрейфа и генерации фильмов из покадровой последовательностей с использованием установленных методов в ImageJ 9. Выполнение 3D поверхностных реконструкций изображений с высоким разрешением 13,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Расширенный покадровой прижизненной микроскопии позволяет одного элемента разрешения визуализации многоклеточных процессов в опухоли микроокружения. По флуоресцентно опухолевых клеток маркировки, макрофагов, сосудистого пространства и визуализации сети коллагеновых волокон с использованием второго сигнала генерации гармоник, несколько отсеков в микросреды опухоли одновременно отслеживается во время съемки. Опухолевые клетки , меченные флуоресцентными белками могут быть получены в трансге...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Межклеточных взаимодействий, которые происходят спонтанно в микроокружение опухоли может привести к изменениям в опухолевых клеток моторики и intravasation. Высокое разрешение прижизненной визуализации тканей живого опухоли позволяет визуализировать многоклеточных динамики , которые могут быть весьма переходная 10,13,24. Конечная точка в анализах естественных условиях или покадровой изображений , полученных с помощью дискретных моментов времени может обеспечить существенную информацию о моле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Министерством обороны груди Программа исследований рака под номером премии (ясень, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 и Программа комплексной обработки изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
155 кДа декстран-тетраметилродамина изотиоцианатSigma AldrichT1287восстанавливается в дозе 20 мг/мл в 1x PBS
70 кДа декстран-Texas RedLife TechnologiesD-1830восстанавливается в дозе 10 мг/мл в 1x PBS
10 кДа декстран-флуоресцеин изотиоцианатSigma AldrichFD10Sвосстанавливается в дозе 20 мг/мл в 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum DotsLife ТехнологииQ21561MPразбавления 25 μ l в 175 μ l из 1x PBS для инъекций
мышей MMTV-PyMTЛаборатория Джексона2374
Csf1r-ECFP мыши (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)Лаборатория Джексона26051
Csf1r-EGFP мышиЛаборатория Джексона18549
1x PBSLife Technologies
Изоэтезия (изофлуран)Henry Schein Animal Health50033250 мл
шприц OxygenAirTech
1 мл, туберкулиновый наконечникBD309659
30 г x 1 (0,3 мм x 25  мм) иглаBD305128
Полиэтиленовая микро медицинская трубка Scientific Commodities IncBB31695-PE/1внутренний диаметр 0,28 мм x внешний диаметр 0,64 мм
Покровное стекло для микроскопаCorning2980-225толщина 1,5, 22 x 50  мм
ФизиоSuite MouseSTAT пульсоксиметр, программное обеспечение и датчикиКент Научная
лабораторная лентаFisher Scientific159015R
мягкая резиновая прокладкаMcMaster-Carr8514K62Ультрамягкая полиуретановая пленка, 3/16" Толстый, 12" x 12", 40 Oo Durometer, плоская задняя жесткая
резиновая прокладкаMcMaster-Carr8568K615Высокопрочный неопреновый резиновый лист толщиной 1/4", 12" x 12", 50  Дюрометрический
микроскопOlympusМикроскоп представляет собой изготовленный по индивидуальному заказу двухлазерный многофотонный микроскоп на основе стенда Olympus IX-71 с объективом 20X 1.05NA.
Набор 7-дыроколовMcMaster-Carr3429A12диаметром от 1/4" до 1" для перфоратора с ударным молотком

Ссылки

  1. Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
  2. Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
  3. Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
  4. Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
  5. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
  6. Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
  7. Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
  8. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  9. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
  10. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  11. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  12. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
  13. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  14. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  17. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
  19. Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
  20. Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors. In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).
  21. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807(2011).
  22. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  23. Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
  24. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  25. Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  26. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  27. Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
  28. Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
  29. Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790(2013).
  30. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  31. Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мультифотонная микроскопияпроницаемость сосудовтаймлапс-визуализацияклеточное мечениелоскут кожи молочной железыэкстравазация декстранамечение квантовыми точками
Расширенная Покадровый прижизненной визуализации в режиме реального времени многоклеточных Динамика в опухоли микроокружения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.