JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Biology

Изучение надмолекулярной организации фотосинтетических мембранах внутри Фриз-трещиноватых тканях листа с помощью крио-сканирующей электронной микроскопии

Published: June 23, 2016
doi:
10.3791/54066
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, , , ,
1Department of Biological Chemistry,Weizmann Institute of Science, 2Department of Chemical Research Support,Weizmann Institute of Science, 3Institute of Plant Sciences,Agricultural Research Organization, Volcani Center

Summary

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Abstract

Крио-сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) замораживанием образцы, разрушенные позволяет исследовать биологические структуры на близких нативных условиях. Здесь мы опишем метод для изучения надмолекулярной организации фотосинтезирующих (тилакоидов) мембран внутри образцов листьев. Это достигается за счет замораживания высокого давления тканей листьев, сублимационной разрыва пласта, двухслойного покрытия и, наконец, крио-SEM визуализации. Применение метода покрытия двойного слоя позволяет приобретать большое увеличение (>) 100000 изображений с минимальным повреждением пучка к замороженным увлажненной образцов, а также минимальным воздействием зарядки. С помощью описанных процедур , мы исследовали изменения в распределении супрамолекулярного фотосистемы и светособирающей антенны белковых комплексов , которые имеют место в процессе обезвоживания Воскрешение растений Craterostigma pumilum, на месте.

Introduction

Кислородный фотосинтез, происходящих в древней цианобактерии, был унаследован водорослей и наземных растений эндосимбиотических событий, которые привели к развитию хлоропластов органелл. Во всех современных кислородных фототрофов, фотосинтетический перенос электронов и генерация протон-движущей силы и уменьшение мощности осуществляется в пределах уплощенными мешка типа везикул, называемых '' тилакоидов мембраны. Эти мембраны разместятся белковые комплексы, которые выполняют легкие управляемые реакции фотосинтеза и обеспечивают среду для энергетической трансдукции. Тилакоидную мембраны растений и (некоторые) водоросли дифференцируются на два различных морфологических доменов: плотно прижатыми мембранные области , называемые "грана" и штабеля мембраны , которые связывают Грана, называемые 'стромы ламели' 1. Различные исследования сублимационной разрушения растений и водорослей тилакоидного мембран проводились, начиная с начала 1970-х. При замораживанием ломаются, мембраныраскалывается по их гидрофобной сердцевины 2, генерируя exoplasmic лица (EF) и протоплазматическим лица (ПФ), в зависимости от клеточного отсека , который Половинки мембраны границы, как это первоначально придуман Брэнтон и соавт. . в 1975 году 3 растений и водорослей тилакоиды имеют четыре различных поверхностей разрыва: Efs, EFU, ФД и ОРП, с 'S' и 'U' , обозначающих "уложенных" и "разобран" мембранных областей соответственно. Белковые комплексы мембран, которые не расщепленная или сломанные, имеют тенденцию оставаться с или Е или Р стороне мембраны. Первоначальные наблюдения , что разные грани перелома тилакоидами содержат частицы различных размеров и плотности 4 и многочисленные исследования , которые следовали, привели к идентификации и корреляции между наблюдаемыми частицами и мембранных белковых комплексов , которые осуществляют легкие реакции 5-13 (см также обзоры 14,15).

FreЭз-Перелом опыты тилакоидного мембран , как правило , проводят на препаратах хлоропластов или изолированных мембранах тилакоидов (но смотри 16,17), на риск каких – либо изменений в структурной и / или надмолекулярной организации , которые могут возникнуть во время процедуры изоляции. После перелома, точные копии получают путем выпаривания платины / углерода (Pt / C), затем толстым слоем углерода (C), и , наконец , переваривание биологического материала 18. Реплики визуализируются с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Традиционная технология сублимационной перелом-реплики продолжает служить в качестве важного инструмента для изучения надмолекулярной организации фотосинтетических мембран и их адаптацию к различным, например., Свет, условия 19-23.

В нашем недавнем исследовании homoiochlorophyllous Воскрешение растений Craterostigma pumilum 24, мы стремились исследовать изменения в надмолекулярной организации OF тилакоидов мембраны, а также в целом клеточной организации, в процессе обезвоживания и регидратации. Уникальность homoiochlorophyllous видов воскресения в том, что они способны выжить условия высыханию в своих вегетативных тканях (листья), сохраняя при этом их фотосинтетического аппарата. После того, как вода доступна, эти растения восстановить и возобновить фотосинтетическую активность в течение нескольких часов до нескольких дней 25. Для этого исследования, крио-сканирование ЭМ (СЭМ) визуализация сублимационной сломана образцов листьев, сочеталось с замораживанием под высоким давлением для образца крио-иммобилизации. Эти процедуры обеспечивают средства для визуализации замороженных гидратированных биологических образцов в состоянии , близком к их родному государству 26. Один Основное преимущество состоит в том, что образцы исследуют непосредственно после сублимационной перелома и покрытия без каких-либо последовательных шагов. Это особенно актуально для исследования растений при различных относительного содержания воды (RWC), так как их состояние гидратации поддерживается в процессе подготовки. Каккогда-либо, один критический недостаток состоит в том, что замороженные гидратированных образцы могут пострадать от повреждения луча во время формирования изображения, особенно при сканировании при больших увеличениях, необходимых для точного измерения размера фотосинтетических комплексов. Чтобы преодолеть это, метод , называемый "двойной слой покрытия '(DLC) 27,28 в сочетании с использовались специфические условия формирования изображения крио-SEM. Они привели в образцах, которые значительно меньше света чувствительных и позволила выяснении ценную информацию о фотосинтетической белка надмолекулярной организации и других клеточных компонентов Воскрешение растений C. pumilum при высоких увеличениях на месте.

Protocol

1. Крио-фиксация листьев ТКАНЕЙ при замораживании высокого давления Примечание: В данном разделе описывается, как проводить замораживание высокого давления тканей листьев для эксперимента сублимационной перелома. По соображениям , связанным с образцами растений см 29. Это может быть адаптирована для других типов тканей или образцов с некоторыми изменениями. Используя угол лезвия бритвы, царапают дно 0,1 мм полость алюминиевой пластинки 0,1 / 0,2 мм (рисунок 1). Приготовьте по меньшей мере десяток тромбоциты (6 образцов). Примите соответствующие меры предосторожности, чтобы не создать следы ножей на окружности диска. После того, как царапины, мыть диски в абсолютном этаноле, дайте им высохнуть и храните его в чистом блюде. Подготовить машину замораживания высокого давления в соответствии с инструкциями изготовителя. Заполните камеру спирта морозильной машины под высоким давлением с изопропилового спирта. Приготовьте самодельную вакуумнепроницаемую помощь infiltratioп устройство заменить газ, найденный в ткани листьев с жидкостью. Плотно соединить 200 мкл кончиком пипетки к концу 10 мл шприца. Отрезанные ~ 1 см кончика. Сделайте отверстие в крышке трубки микроцентрифужных 1,5 мл до плотно прилегать кончик вырезать. Вакуум может быть создана внутри трубки, потянув за поршень шприца. Вырезать небольшой кусочек листа от растения, используя лезвие бритвы и с помощью пинцета поместите лист внутри микроцентрифужных трубки, наполовину заполненной 1-гексадецена. Проникнуть межклеточные пространства листа с жидкостью, осторожно потянув поршень для создания вакуума, удерживайте в течение примерно 30 секунд, а затем медленно отпустите поршень. Удалите кусок листа из трубки с помощью пинцета. Обрежьте лист с бритвенным лезвием в случае его толщина более 0,2 мм и вырезать небольшой кусок, который будет вписываться в тромбоцитов. Поместите чистую пластинкам с поцарапанной стороной вверх в держатель морозильной машины, а затем поместить отрезанный кусок леаф в тромбоцитов. Заполните оставшееся пространство вокруг листа с 1-гексадецена. Закройте бутерброд с использованием другого количества тромбоцитов, с царапинами, с которыми сталкивается лист. Закройте и затяните держатель и вставить его в камеру машины. Затем нажмите кнопку "Jet" заморозить (~ 2,100 бары для 300 – 500 мс), и быстро перевести держатель в жидкий азот. Осторожно удалите замерзший бутерброд из держателя с использованием предварительно охлажденного пинцета, следя за тем, чтобы не раздробить бутерброд. Примечание: Закрытые замороженные бутерброды могут быть замораживанием сломана немедленно или хранятся в жидком азоте для последующего использования. Используйте защитную одежду и очки при работе с жидким азотом. 2. Замораживание-трещины и двухслойные покрытия 27,28 Подготовить машину разрушения замораживанием для использования, в том числе и пушки для испарения платины / углерода (Pt / C) и углерода, в соответствии с инструкциями изготовителя. Поместите пистолет Pt / C на 45 градусов рисуетсяй углерод пушки под углом 90 градусов. Предварительная программа схема покрытие из 2-нм слой Pt / C (скорость покрытия 0,02 – 0,04 нм / с) и 6 нм слоем углерода (при ~ 0,1 нм / с). Введите установку на экране аппарата сублимационной перелома в. Выберите номер пользователя, где будет сохранена схема покрытия. Выберите Pt / C для 'Layer 1'. Выберите временные рамки, например., 5 мин (превысить необходимое время , необходимое для завершения покрытия). При помощи кнопок вверх-вниз стрелки, чтобы определить толщину 2 нм. Нажмите кнопку "Layer", чтобы перейти к Layer 2. Повторите шаг 2.1.1.2, за исключением выбора углерода и определяют толщину 6 нм. Проверить и отрегулировать работу пистолета. Выберите "Layer 1". Выберите Pt / C пистолет, нажав на кнопку 'GUN1' и нажмите кнопку 'ON' на блоке управления Испарение машины сублимационной перелома. Монитор скорости испарения и настроить его с помощью регуляторов напряжения и выбросов ЕНТIL достигая скорости 0,02 – 0,04 нм / с. Нажмите 'OFF', чтобы выключить пистолет Pt / C. Выбрать 'Layer 2'. Повторите 2.1.2.1, за исключением того, выберите 'GUN2' и настроить для скорости испарения ~ 0,1 нм / с. Охлаждают этап системы разрушения замерзнуть до -140 ° С или -160 ° С (для гидратированных или обезвоженных листьев, соответственно). Прикрепите шаттл передачи вакуума крио к машине и заполнить ее камеру с жидким азотом. Давление в охлажденной камере сублимационной разрушения, как правило , между 1 – 8 х 10 -7 мбар. Вставьте держатель образца сублимационной разрыва пласта (подходит для 3-мм тромбоцитов) в погрузочной станции. Наводнение камеру погрузочной станции с жидким азотом. Загрузите два замороженных бутерброды на держатель один за другим с помощью пинцета класса с высокой точностью. Заверните первый сэндвич в держатель, а затем переверните держатель, чтобы проверить, что он надежно крепится на месте. Повторите эти действия для второй бутерброд. Detach охлажденный трансфер из машины разрушения замораживанием и подключить его к погрузочной станции. Откройте челночный клапан, ввести втягивания руку в держатель и зафиксировать его на место. Повторно ввести руку с держателем в челноке и закройте челночный клапан с помощью ручки загрузочной станции. Прикрепите шаттл к машине сублимационной разрушения и ввести держатель в камеру с втягивания руку. Отделите трансфер из машины. Совместите сублимационной перелом микротомных нож на высоту таким образом, что она будет скостить верхние пластинками бутербродов. С помощью микротома нож быстро разбивают бутерброды, а затем сразу же поднять его, чтобы предотвратить загрязнение образцов обломками цепляния к ножу, и поверните охлажденный затвор над вновь обрабатываемые плоскости, чтобы оградить образцы от возможного загрязнения молекулами воды в камера. Coat образцы с платины и углерода. Введите 'Layer 1' на СБНReen. Включите Pt / C пушки, нажав на кнопку 'GUN1', а затем кнопку "ON". Проверьте скорость испарения и как только он достигает 0,02 – 0,04 нм / с, одновременно выставить образцы и нажмите кнопку "Measure" для контроля толщины нанесенного слоя. Примечание: пистолет выключится автоматически, когда толщина достигнет предварительно выбранное значение. Накройте образцы с затвором при Pt / C испарение завершается. Нажмите кнопку "Layer", чтобы перейти к 'Layer 2'. Повторите шаги 2.8.1 и 2.8.2, за исключением выбора 'GUN2' (для углерода) и скорость испарения ~ 0,1 нм / с. Подогреть этап системы разрушения замораживания до -120 ° С. 3. Cryo-сканирующей электронной микроскопии Подготовка растрового электронного микроскопа для крио работы. Выберите Stage / Stage Initialise из главного меню и подтвердите выбор. Выберите Инструменты / GotO панель, и откройте панель "Airlock", выбрав его из списка. Нажмите кнопку "Закрыть колонке камеры клапана. Vent микроскопа камеру, нажав на кнопку Vent на вкладке "вакуум". Выберите Инструменты / Гото Панель и откройте "Сценическое пункты списка 'панель. Выберите позицию крио-обмена, чтобы переместить сцену к соответствующим координатам для приема держателя образца. Примечание: "крио-обмен позиции 'предварительно установлен, чтобы быть в соответствие с положением блока вакуумного переноса. Откройте образец камеры с чистой пары перчаток и вставьте крио-сцену на главной сцене микроскопа. Закройте камеру и нажмите кнопку насоса под "вкладке вакуума". Охлаждают микроскоп до -120 ° С. Заполните микроскоп Дьюара с жидким азотом. Включите функцию тепла на блоке управления крио-передачи до -120 ° С, как только температура на стадии опускается ниже -120 ° С. AttACH шаттл крио-передачи в микроскоп и передать держатель образца с помощью втягивания руку на столик микроскопа крио (как в шаге 2.5). Отделить шаттл от микроскопа. Нажмите на кнопку "Открыть колонке камеры клапана 'в Airlock панели. Осторожно переместите держатель образца близко к линзы объектива (рабочее расстояние 1 – 2 мм) с помощью джойстика. Выберите диафрагму 10 мкм в закладке 'проемы. Дважды щелкните поле EHT на вкладке "Gun". Введите 10 (кВ) для цели EHT и нажмите кнопку OK. Нажмите на вкладку нижней EHT и выберите "EHT On". Выберите 'InLens' от детекторов в раскрывающемся списке на вкладке "детекторами. Оптимизация условий формирования изображения (фокус, яркость и контрастность, выравнивание луча, астигматизм) в зависимости от обстоятельств. Нажмите на вкладку "Сканирование". Выберите быстрое сканирование ( 'Скорость сканирования = 1', что соответствует времени выдержки от 100 нсек на пиксел), чтобы свести к минимуму повреждение луча, иа 'разрешение Store' 1024 х 768 пикселей. Выберите 'Line Avg "в раскрывающемся списке" Шумоподавление ". Отрегулируйте значение N 20 – 30 строк для поиска. Перемещение образца использовать функцию 'Centre Point' (нажав Control-вкладку на клавиатуре) для поиска областей с сломанных клеток и хлоропластов (Фигуры 2А и 2В). Получение изображений трещиноватых хлоропластов при низких увеличениях (50 – 70 КХ) (рис 2С и 2D). Используйте функцию 'Центр' Feature (нажатием-Shift-Tab управления на клавиатуре) , чтобы увеличить в интересных граней хлоропласта трещин и получать изображения при больших увеличениях (100 – 200 кХ, 3 и 4). Используйте те же параметры, что и в шаге 3.6 для получения изображения, но изменить строку значение Avg к N> 100 для снижения уровня шума 30. Нажмите Стоп-кадр на основном блоке управления микроскопом или на вкладке "Сканирование", чтобы остановить процесс сканирования и сохраненияизображение, нажав кнопку "Сохранить" TIFF. Анализ 4. Изображение Примечание: В данном разделе описывается короткая процедура для сегментации мембранных частиц от замораживанием разрушения SEM изображений с использованием открытого исходного кода пакета Фиджи 31. Аналогичные результаты можно получить с помощью другого программного обеспечения для анализа изображений. Открытое изображение с Фиджи путем перетаскивания файла изображения в главном окне программы. Преобразовать изображение в 8-бит, выбрав изображение / тип / 8-бит. Выберите изображение / Настройка / Яркость / Контраст и при необходимости отрегулировать (рисунок 5А). Используя инструмент Straight Line, нарисуйте линию размер вложенного изображения шкалы бар. Выберите Анализировать / Set Scale. Введите необходимую информацию масштаба (известное расстояние и единица измерения длины) и нажмите кнопку ОК. Сохранить изображение масштабируется регулируется. Выбор процесса / Фильтры / Гауссово размывание (1,5 радиуса нм) и нажмите кнопку OK (рисунок 5б). Выберите изображение / Настройка / АВТо Local Threshold ( с использованием метода Niblack) и нажмите OK (рисунок 5в). Выберите Edit / Инверсия а затем обработать / Binary / водораздела (рис 5D). Нарисуйте рамку вокруг области интереса (ROI) с помощью инструмента выделения областей произвольной формы. Добавьте выбор менеджеру ROI, выбрав Edit / Selection / Добавить в диспетчере или нажав 'T'. Выберите Edit / Clear снаружи (Рисунок 5E). Выберите Анализ / Set Измерения, выберите соответствующие параметры (например, площадь, пригодный эллипсов). Выберите Анализ / Анализ частиц. Введите соответствующий диапазон для размера частиц и отметьте "Показывать результаты ',' Добавить к менеджеру 'и, в случае необходимости," Исключить по краям "вариант и нажмите кнопку ОК. Результат показан на рисунке 5F. Откройте сохраненный файл масштабируется изображенную (шаг 4.2). Выберите "Показать все" и снимите флажок "Ярлыки" в ROI Manager. Обзор выбранного учале укладывают на исходное изображение и вручную добавлять или удалять выбранные с помощью "Добавить" или "Удалить" кнопки на ROI Manager. Исправьте все необходимые выборы с помощью инструмента Selection и Freehand кнопку "Обновить" в ROI Manager (Рисунки 5G и 5H). Анализ данных с использованием полученных измерений. В окне Результаты нажмите кнопку Результаты / Обобщить, чтобы получить, например, средняя площадь, а значит, большой и малой осей частиц, перечисленных в ROI Manager. Нажмите Результаты / Distribution, выберите параметр (например, Area) и нажмите кнопку OK, чтобы просмотреть гистограмму для этого параметра.

Representative Results

На рисунке 1 показана крио-SEM изображения пластинок , содержащих высокого давления заморожен, сублимационной трещиноватых Craterostigma pumilum кусочки листьев. В некоторых образцах, большие участки трещиноватых клеток получаются (Рис . 1А) В дру?…

Discussion

Техника, описанная в данной статье позволяет исследовать замораживанием сломана мембран в контексте хорошо сохранившимися высокого давления замороженных тканей растений с помощью крио-сканирующей электронной микроскопии. Основное преимущество использования этих процедур являетс?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Андрес Kaech (Университет Цюриха) за полезные советы по сканирующей электронной микроскопии изображений. Эта работа была поддержана исследований и развития Фонда США-Израиль Двусторонней сельского хозяйства (грант №. US-4334-10, ZR), Израильского научного фонда (грант №. 1034/12, ZR) и Научном программы Human Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). Исследования электронной микроскопии проводились на Ирвинга и Черна Московиц Центра нано- и био-нано изображений в институте Вейцмана.

Materials

ethanol abs Bio-Lab 052505
isopropanol Bio-Lab 162605
1-hexadecene Sigma-Aldrich H7009
0.1/0.2 platelets Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland 241 Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
high-precision-grade tweezers Electron Microscopy Sciences 72706-01 Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
high-pressure freezing machine Bal-Tec HPM 010 High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
freeze-fracture system Leica Microsystems EM BAF 060
cryo preparation loading stage Leica Microsystems 16770228
specimen holder for univeral freeze fracturing Leica Microsystems 16LZ04746VN Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
vacuum cryo-transfer shuttle Leica Microsystems EM VCT 100
scanning electron microscope Zeiss Ultra 055
cryo SEM stage Leica Microsystems 16770299905
image acquisiton software SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
image analysis software Fiji/Image J, National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes – Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I – Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II – Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface – Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes – a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity – Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy–present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Tags

Cryo-scanning Electron MicroscopyFreeze-fractureSupramolecular OrganizationPhotosynthetic MembranesHigh-pressure Freezing
Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Charuvi, D., Nevo, R., Kaplan-Ashiri, I., Shimoni, E., Reich, Z. Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (112), e54066, doi:10.3791/54066 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image