Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Крио-сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) замораживанием образцы, разрушенные позволяет исследовать биологические структуры на близких нативных условиях. Здесь мы опишем метод для изучения надмолекулярной организации фотосинтезирующих (тилакоидов) мембран внутри образцов листьев. Это достигается за счет замораживания высокого давления тканей листьев, сублимационной разрыва пласта, двухслойного покрытия и, наконец, крио-SEM визуализации. Применение метода покрытия двойного слоя позволяет приобретать большое увеличение (>) 100000 изображений с минимальным повреждением пучка к замороженным увлажненной образцов, а также минимальным воздействием зарядки. С помощью описанных процедур , мы исследовали изменения в распределении супрамолекулярного фотосистемы и светособирающей антенны белковых комплексов , которые имеют место в процессе обезвоживания Воскрешение растений Craterostigma pumilum, на месте.
Кислородный фотосинтез, происходящих в древней цианобактерии, был унаследован водорослей и наземных растений эндосимбиотических событий, которые привели к развитию хлоропластов органелл. Во всех современных кислородных фототрофов, фотосинтетический перенос электронов и генерация протон-движущей силы и уменьшение мощности осуществляется в пределах уплощенными мешка типа везикул, называемых '' тилакоидов мембраны. Эти мембраны разместятся белковые комплексы, которые выполняют легкие управляемые реакции фотосинтеза и обеспечивают среду для энергетической трансдукции. Тилакоидную мембраны растений и (некоторые) водоросли дифференцируются на два различных морфологических доменов: плотно прижатыми мембранные области , называемые "грана" и штабеля мембраны , которые связывают Грана, называемые 'стромы ламели' 1. Различные исследования сублимационной разрушения растений и водорослей тилакоидного мембран проводились, начиная с начала 1970-х. При замораживанием ломаются, мембраныраскалывается по их гидрофобной сердцевины 2, генерируя exoplasmic лица (EF) и протоплазматическим лица (ПФ), в зависимости от клеточного отсека , который Половинки мембраны границы, как это первоначально придуман Брэнтон и соавт. . в 1975 году 3 растений и водорослей тилакоиды имеют четыре различных поверхностей разрыва: Efs, EFU, ФД и ОРП, с 'S' и 'U' , обозначающих "уложенных" и "разобран" мембранных областей соответственно. Белковые комплексы мембран, которые не расщепленная или сломанные, имеют тенденцию оставаться с или Е или Р стороне мембраны. Первоначальные наблюдения , что разные грани перелома тилакоидами содержат частицы различных размеров и плотности 4 и многочисленные исследования , которые следовали, привели к идентификации и корреляции между наблюдаемыми частицами и мембранных белковых комплексов , которые осуществляют легкие реакции 5-13 (см также обзоры 14,15).
FreЭз-Перелом опыты тилакоидного мембран , как правило , проводят на препаратах хлоропластов или изолированных мембранах тилакоидов (но смотри 16,17), на риск каких – либо изменений в структурной и / или надмолекулярной организации , которые могут возникнуть во время процедуры изоляции. После перелома, точные копии получают путем выпаривания платины / углерода (Pt / C), затем толстым слоем углерода (C), и , наконец , переваривание биологического материала 18. Реплики визуализируются с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Традиционная технология сублимационной перелом-реплики продолжает служить в качестве важного инструмента для изучения надмолекулярной организации фотосинтетических мембран и их адаптацию к различным, например., Свет, условия 19-23.
В нашем недавнем исследовании homoiochlorophyllous Воскрешение растений Craterostigma pumilum 24, мы стремились исследовать изменения в надмолекулярной организации OF тилакоидов мембраны, а также в целом клеточной организации, в процессе обезвоживания и регидратации. Уникальность homoiochlorophyllous видов воскресения в том, что они способны выжить условия высыханию в своих вегетативных тканях (листья), сохраняя при этом их фотосинтетического аппарата. После того, как вода доступна, эти растения восстановить и возобновить фотосинтетическую активность в течение нескольких часов до нескольких дней 25. Для этого исследования, крио-сканирование ЭМ (СЭМ) визуализация сублимационной сломана образцов листьев, сочеталось с замораживанием под высоким давлением для образца крио-иммобилизации. Эти процедуры обеспечивают средства для визуализации замороженных гидратированных биологических образцов в состоянии , близком к их родному государству 26. Один Основное преимущество состоит в том, что образцы исследуют непосредственно после сублимационной перелома и покрытия без каких-либо последовательных шагов. Это особенно актуально для исследования растений при различных относительного содержания воды (RWC), так как их состояние гидратации поддерживается в процессе подготовки. Каккогда-либо, один критический недостаток состоит в том, что замороженные гидратированных образцы могут пострадать от повреждения луча во время формирования изображения, особенно при сканировании при больших увеличениях, необходимых для точного измерения размера фотосинтетических комплексов. Чтобы преодолеть это, метод , называемый "двойной слой покрытия '(DLC) 27,28 в сочетании с использовались специфические условия формирования изображения крио-SEM. Они привели в образцах, которые значительно меньше света чувствительных и позволила выяснении ценную информацию о фотосинтетической белка надмолекулярной организации и других клеточных компонентов Воскрешение растений C. pumilum при высоких увеличениях на месте.
Техника, описанная в данной статье позволяет исследовать замораживанием сломана мембран в контексте хорошо сохранившимися высокого давления замороженных тканей растений с помощью крио-сканирующей электронной микроскопии. Основное преимущество использования этих процедур являетс?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Андрес Kaech (Университет Цюриха) за полезные советы по сканирующей электронной микроскопии изображений. Эта работа была поддержана исследований и развития Фонда США-Израиль Двусторонней сельского хозяйства (грант №. US-4334-10, ZR), Израильского научного фонда (грант №. 1034/12, ZR) и Научном программы Human Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). Исследования электронной микроскопии проводились на Ирвинга и Черна Московиц Центра нано- и био-нано изображений в институте Вейцмана.
ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |