Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Непрерывная инфузия IV является выбор маршрута для Лечение Аргинин-вазопрессин блокатор рецепторов Conivaptan у мышей, чтобы изучить Stroke-вызванных Отек мозга

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54170

⸱

1 сентября 2016 г.

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

В этой статье

Краткое содержание

Наши исследования показали, что благотворное влияние кониваптана зависит от метода доставки после экспериментального инсульта у мышей. Нами разработан протокол исследования доставки блокатора рецепторов через внутривенный катетер при формировании отека мозга у мышей, вызванного инсультом.

Аннотация

Инсульт является одной из основных причин заболеваемости и смертности в мире. Инсульт осложняется отеком мозга и других патофизиологических событий. Среди наиболее важных игроков в развитии и эволюции инсультом вызванных отеком головного мозга является гормон аргинин-вазопрессин и его рецепторов, V1a и V2. В последнее время V1a и V2 блокатор рецепторов Conivaptan привлекает к себе внимание в качестве потенциального лекарственного средства для уменьшения отека головного мозга после инсульта. Тем не менее, модели на животных, которые включают Conivaptan приложения в исследованиях инсульта должны быть изменены на основе возможных путей введения. При этом результаты 48 ч непрерывного внутривенного (IV) сравниваются с внутрибрюшинного (IP) Conivaptan лечения после инсульта у экспериментальных мышей. Мы разработали протокол, в котором окклюзия средней мозговой артерии соединяли с установкой катетера в яремную вену для IV лечения Conivaptan (0,2 мг) или транспортного средства. Различные когорты животных обрабатывали 0,2мг болюс Conivaptan или транспортного средства IP ежедневно. Экспериментальный инсульт-вызвал отек мозга оценивали у мышей после непрерывного IV и обработки IP. Сравнение результатов показало, что непрерывное введение IV из Conivaptan облегчает после ишемического отека мозга у мышей, в отличие от администрации ИС Conivaptan. Мы пришли к выводу, что наша модель может быть использована для будущих исследований Conivaptan применения в контексте инсульта и отека мозга.

Введение

Инсульт продолжает оставаться огромным бременем для пациентов и врачей. Модели инсульта у животных используются в лабораторных условиях уже почти два десятилетия. 1 Тем не менее, экспериментальные методы лечения, которые работают на животных, часто терпят неудачу у людей. 2 Это расхождение в результатах лечения может быть обусловлено различными факторами, такими как пути введения лекарств, используемых в исследованиях на животных, метаболизм и скорость выведения лекарств, а также многие другие аспекты. Одно из основных осложнений инсульта, отек мозга, находится в центре внимания современных исследований в области нейробиологии. Механизмы формирования отека мозга связаны с нарушениями водно-электролитного баланса, вызванными реакцией аргинин-вазопрессина (АВП) на ишемическое повреждение головного мозга. 3 Таким образом, АВП и его рецепторы (V1a и V2) являются основным направлением исследований формирования постишемического отека мозга. 3

Мы разработали методологию для изучения влияния блокатора рецепторов смешанного аргинина-вазопрессина (V1a и V2) кониваптана на постишемический отек мозга у мышей. 4 Молекулярные мишени кониваптана5 делают препарат подходящим кандидатом для исследования его свойств в облегчении отека мозга. Кроме того, кониваптан необходимо изучать в контексте патофизиологических событий инсульта. 6 При планировании этого исследования мы рассмотрели возможность сравнения результатов лечения с использованием двух различных путей введения кониваптана: внутривенно (IV)4 и внутрибрюшинно (IP). 7 Оценивалось влияние лечения на отек мозга, вызванный инсультом. Здесь подробно описаны протоколы хирургической индукции экспериментального инсульта путем окклюзии средней мозговой артерии (ОКАО) с последующим непрерывным лечением кониваптаном с использованием установки яремного катетера внутривенного введения. После индукции инсульта животные были случайным образом распределены на следующие группы: носитель или кониваптан (0,2 мг/сут) получали в/в или ИП.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию животных в научных исследованиях и были одобрены уходу и использованию животных комитета шведского медицинского центра. Все процедуры были выполнены с соответствующими асептики. Экспериментальные животные, используемые для исследования были мужчины, 3 месяца, дикого типа мышей С57 с массой тела от 25 до 27 г.

1. В Vivo Stroke Induction

  1. Предварительно пальто Нить с зубными смолой перед операцией.
    1. Вырезать 12 мм длинный кусок нити из 7-0 нейлоновой нити. Смешайте 2 части смолы с 1 частью отвердителя, а затем сразу же окунуть кончик нити в смесь для покрытия около 1/3 от всей длины. Удалите его быстро и убедиться, что она покрыта гладкой поверхностью слоя зубной смолы.
    2. Воздух сухой нити в течение 2 часов перед использованием.
  2. Поместите курсор вн анестезии индукции камеры (2 шт L), и установите поток 1,5% изофлуран в 25% обогащенного кислородом воздуха в помещении на 2 л / мин входя в камеру.
  3. Разрешить мыши , чтобы оставаться в индукционной камере до тех пор , пока полностью под наркозом, 8 , как определено отсутствие реакции на хвост крайнем случае.
  4. Поместите курсор на операционный стол с подогревом подушки и установить изофлуран концентрации на 1% для поддержания анестезии поставляется спонтанно через носовой конус.
  5. Зажим для волос на передней и задней части шеи, и распылить шею спиртом. Применяют ветеринарную глазной мази на обоих глазах.
  6. Для того, чтобы постоянно контролировать температуру тела, использовать ректальное датчик температуры, соединенный с цифровым дисплеем во время операции.
  7. Поместите мышь в положении лежа на спине, применять повидон-йод 10% раствор скраб для дезинфекции, накрыть стерильной драпировки, а затем сделать срединный разрез вдоль шеи с размером 10 хирургическим скальпелем.
  8. Временно лигирования левой общей сонной артерии (CCA) с 6,0 шелковым швом.
  9. Поместите другой галстук на левой наружной сонной артерии (ЭКА).
  10. Поместите капиллярный клип на внутренней сонной артерии (ВСА).
  11. Вырезать небольшое отверстие на наружной сонной артерии с микрососудистых ножницами. Вставьте нить, изготовленный из нейлона 7-0 шва, покрытого зубной смолой в отверстие в ЕСА, и продвигать его cephalically, при удалении клипа, пока не почувствуете сопротивление (около 5-7 мм от точки бифуркации ОСА).
  12. Поместите временную связь на внутреннюю сонную артерию, чтобы закрепить нити на месте. Обратитесь к диаграмме, рис 1А. Закройте кожу с шелковой нитью, и пропитать рану на передней части шеи с 0,2 мл 0,5% бупивакаина, как и в шаге 2.6.
  13. Разрешить мышь, чтобы пробудиться от анестезии и восстановить сознание в камере регенерации в течение 60 мин. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришелдостаточное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее положение.
  14. Проверьте мышь для неврологического дефицита подсчета очков (NDS) следующим образом: 0 = нормальное функционирование двигателя, 1 = сгибание туловища и контралатерального передней конечности на гидроборте, 2 = кружили на противоположной стороне, но нормальной осанки в состоянии покоя, 3 = наклоняясь к контралатеральной сторона в состоянии покоя, 4 = отсутствие спонтанной двигательной активности. 4,9
    1. Для тестирования NDS, поднимите мышь за хвост и поместите на ровную поверхность для наблюдения (2-3 мин). В качестве альтернативы, наблюдать мышей в камере регенерации. Исключено мышей, которые проявляют NDS ниже, чем 2 из эксперимента из-за недостаточной окклюзии MCA.
      Примечание: лазерной допплеровской флоуметрии метод может быть использован для подтверждения MCA окклюзия 9-11.
  15. Повторно анестезию животного через 60 мин восстановления в индукционной камере, как описано выше, повторно стерилизовать предыдущий разрез кожи с 10% -ным раствором чистящей повидон-йода, и снова открыть хирургическую намотан напередняя часть шеи путем разрезания и удаления шелковой нити.
  16. Для удаления нити из ECA выполните следующие действия:
    1. Поместите капиллярный клип на ICA. Развяжите шов на ICA и вытяните нить из удерживая клип открытым.
    2. Закройте зажим и поместите галстук на ECA проксимальнее разреза.
    3. Снимите зажим и снимите лигатуры из ОАС, чтобы восстановить приток крови к мозгу. Обратитесь к диаграмме, рис 1В.

2. Установка IV Катетер в яремную вену для непрерывного лечения 48 ч

Примечание: Приступить к установке катетера сразу после стадии 1.16.3 без пробуждения мыши.

  1. Использование двух различных размеров гибкой трубки: вставить внутреннюю трубку (0,94 мм Наружный диаметр, чтобы содержать лекарственное средство будучи проникнуты) в наружную трубу (3,18 мм Наружный диаметр, для защиты внутренней трубки).
  2. пкружева мышь в лежачем положении, применяют 10% повидон-йод раствор скраб для дезинфекции, и сделать 1 см разрез а на задней части шеи с размером 10 хирургическим скальпелем. Переверните мышь в положении лежа на спине, повторно стерилизовать переднюю часть шеи с 10% -ным раствором чистящей повидон-йода, и снова открыть хирургической раны на передней поверхности шеи. Туннель трубки под кожей от разреза, сделанного на задней части к передней части шеи, и экстериоризоваться его из открытой раны 1 см.
  3. Удалить подкожной жировой ткани из левой части передней части шеи около 1 см в поперечном направлении от средней линии. Найдите левую яремную вену, место две связи вдоль вены 5 мм друг от друга, и слегка растянуть вену. Сделайте небольшое отверстие на яремной вены между двумя связями с микрососудистых ножницами; вставьте кончик внутренней трубки 5 мм глубиной каудально (по направлению к сердцу).
  4. Закрепите трубку обеими связями с яремной вены. Закройте кожу на передней поверхности шеи3-0 шов шелковой нитью. Обратитесь к диаграмме, рис 1С.
  5. Закрепить трубку к коже на задней части шеи с швом, и подсоединить трубку к инфузионным IV насоса через вертлюг. Поворотное позволяет свободное перемещение мыши внутри клетки с полным доступом к пище и воде.
  6. Проникнуть надрезы кожи на передней и задней части шеи с 0,2 мл 0,5% бупивакаина, чтобы предотвратить послеоперационную боль.
    Примечание: В зависимости от институциональных конкретных протоколов животных, животных можно лечить с помощью опиоидов, НПВС или антибиотики до и после проведения операции. Тем не менее, упомянутые способы лечения могут изменить результаты ишемического исхода инсульта (см Обсуждение раздел). 11-14
  7. Разрешить животное не пробуждать в камеру регенерации, а затем разместить животное в отдельной клетке до конечной точки эксперимента. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания стернальнаяотдохновение.
  8. Установить скорость инфузии для непрерывного 48 ч лечения IV от Conivaptan (0,14 мг / мл в 5% декстроза) или транспортного средства при 1,5 мл / кг / ч, 4 и начать вливание.
    Примечание: Общее количество IV заваренного Conivaptan должно быть приблизительно 0,2 мг / мышь / день в общем объеме 1,44 мл.
    Примечание: Выполнить внутрибрюшинных (в) инъекции Conivaptan два раза в день с общим объемом 0,2 мг в 1,44 мл 5% раствора декстрозы. Внедрение IP - инъекции , как описано ранее. 15 Restrain мышей, захватывая кожу задней поверхности тела и хвоста. Вводят Conivaptan или транспортное средство в левом нижнем квадранте живота с использованием 26 G / 1/2 дюйма иглы. 15
  9. Обратите внимание на животных два раза в день в течение всего периода эксперимента (48 ч). Дайте животным, чтобы иметь полный доступ к пище и воде. Если животное проявляет признаки бедствия или одышки обратитесь к ветеринару. Если эвтаназия необходима для животного в тяжелой дистССГ относятся к шагу 3.1 ниже, и исключить животное из исследования.

3. Оценка Stroke-вызванных Отек мозга в конечной точке

  1. Жертвоприношение мышь более чем на-обезболивающее с 5% изофлуран.
  2. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез кожи над кости черепа вдоль средней линии, и убрать кожу, чтобы выставить весь череп над мозгом. Начиная с затылочного отверстия, вырезать кости черепа в поперечном направлении по периметру головного мозга с каждой стороны, и осторожно поднимите его, не касаясь мозга под ним. Sever мозг от позвоночника и нервы, прикрепленные на основании черепа.
  3. Удалить мозг, отделить его от обонятельной луковицы и мозжечка, и рассекать головной мозг вдоль межполушарной щели в ишемических и неишемической полушарий головного мозга, как описано выше. 9
  4. Оценка отека мозга путем сравнения влажного к сухому соотношениях (WDR) , как описано выше 4,9. Взвесьте тканидо и после сушки в течение 3-х дней при температуре 100 ° С в печи. Вычислить содержание воды в мозге (BWC) в качестве% H 2 O = (1-сухой вес. / Влажного веса.) Х 100%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Температура тела животных был в пределах физиологической нормы и стабильными в течение хирургической процедуры индукции инсульта. Две мыши, которые выставляются NDS ниже, чем 2 сразу после МСАО были исключены из исследования.

MCAO у мышей производит объем инфаркта в ипсилатеральной полушарии в 48 ч. Оценка TTC-окрашенных срезов показывает , что около 50% от полушария зависит от инфаркта после MCAO (рис 1D), ка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование имеет важное значение для доклинических исследований инсульта. Это исследование показывает, что непрерывное вливание IV Conivaptan (0,2 мг / сут) после инсульта у экспериментальных мышей эффективно уменьшает отек мозга после 48 ч лечения. Эффект IP-инъекции в той же дозе Conivaptan на отек головного мозга также была исследована. Лечение Conivaptan обоими IV и IP-маршрутов производит aquaresis у мышей, как указано: 1) увеличение осмоляльности плазмы несколько выше физиологических уровней; и 2) снижение о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим шведское медицинский центр для предоставления финансовых средств и объектов. Мы также благодарим Craig Hospital за щедрое использование лабораторных помещений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ГрелкаK& H Manufacturing Inc1060
Монитор температуры с ректальным зондомPhysitemp7029
Шелковая шовная катушка, 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
Шелковый шов на иглу, 3-0Ethicon1684G
нейлоновый шовный материал, 7-0Ethicon1696G
Стоматологическая смола полисилоксан с отвердителемHeraeus Внутривенный насос для
Kent ScietificGT0897
Поворотный 22GAЛабораторная трубка Instech375/22PS
, 0,94 мм x 0,51 ммЛабораторная трубка Dow Corning508-002
3,18 мм x 1,98 ммDow Corning508-009
микроинфузии Kulzer 65817930 ,

Ссылки

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Введение кониваптанавнутрибрюшинное лечениеокклюзия средней мозговой артериикатетеризация яремной веныоценка отека мозгамышиная модель инсультапуть введения препаратаблокатор V1a- и V2-рецепторовпосишемический отек мозга
Непрерывная инфузия IV является выбор маршрута для Лечение Аргинин-вазопрессин блокатор рецепторов Conivaptan у мышей, чтобы изучить Stroke-вызванных Отек мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.