Методическая статья

Обнаружение РНК-связывающих белков In Vitro РНК спускающее в адипоцитов культуры

DOI:

10.3791/54207

⸱

22 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выпадающий протокол РНК оптимизирован здесь для обнаружения взаимодействий между РНК-связывающих белков (ОДП) и некодирующих, а также кодирования РНК. Фрагмент РНК из рецептора андрогена (AR) был использован в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как извлечь ее из ОПБ lystate первичных бурых адипоцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК-связывающие белки (ОДП) появляются в качестве регулирующего слоя в развитии и функционировании жировой ткани. ОДП играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционных уровнях, влияя на стабильность и поступательное эффективность мРНК мишеней. РНК выпадающий метод широко используется для изучения взаимодействия РНК-белок, который необходим, чтобы выяснить механизм, лежащий в основе функции ОДП ", а также длинные некодирующие РНК» (lncRNAs). Однако высокая липидный изобилие в адипоциты представляет собой сложную техническую задачу в проведении этого эксперимента. Здесь подробно выпадающий протокол РНК оптимизирован для первичной культуры адипоцитов. Фрагмент РНК из (AR) 3 'нетранслируемой области рецептора андрогена (в 3'UTR), содержащие аденилатной-uridylate богатых elementwas, используемые в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как получить его RBP партнера, Гур белок, из адипоцитов lystate. Описанный здесь способ может быть применен для обнаружения взаимодействий междуОДП и некодирующие РНК, а также между ОДП и кодирование РНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ОДП представляют собой белки, которые связываются с двойной или одноцепочечной РНК в клетках и участвуют в формировании РНК-белковых комплексов. ОДП может связать различные виды РНК, включая мРНК и длинных некодирующих РНК (lncRNAs), и оказывают свое влияние на пост-транскрипционных уровнях. Оба ОДП и lncRNAs появляются в качестве новых регуляторов в развитии жировой и функции 1,2,3. Для того, чтобы понять механизм RBP- и lncRNA-опосредованной регуляции клеточных путей, часто бывает необходимо, чтобы обнаружить взаимодействие между конкретной молекулы РНК и одного или нескольких ОДП, и, иногда, чтобы определить полный спектр белковых партнеров РНК транскрипт. Тем не менее, этот эксперимент может быть сложной задачей из-за высокого содержания липидов в адипоцитах. Протокол спускающее РНК , описанный здесь может быть использовано для получения белковых партнеров специфической РНК из адипоцитов лизатов первичных культур 4,5.

Обоснование для этого протоCol можно суммировать следующим образом. РНК приманку в пробирке транскрипции из матрицы ДНК, меченного биотином и конъюгированные с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами 4. РНК приманку инкубируют с клеточными лизатов, чтобы обеспечить образование РНК-белковых комплексов, которые впоследствии снесенных на магнитной подставке. Более конкретно, РНК протокол спускающее описано ниже использовать фрагмент РНК из AR 3' - UTR в качестве приманки , чтобы получить Hur протеин, универсально выраженный ОПБ , связанный с 3' - UTR мРНК 6,7, от theadipocytelysate первичной культуры. Для проверки специфичности связывания этого анализа, а нерелевантных RNAas также пустые стрептавидином шарики включен в качестве контроля. Этот протокол совместим с вестерн - блоттинга или масс - спектрометрии (MS) , чтобы подтвердить захват конкретного ОПБ или определить полный репертуар захваченных ОДП соответственно 8.

Некоторые методы доступны для изучения взаимодействия РНК-белокs. Для выявления РНК, связанные с данной РСП, RIP (РНК иммунопреципитации) и CLIP (УФ-сшивка и иммунопреципитация) могут быть применены. В противоположность этому, для выявления белковых партнеров данной РНК, РНК выпадающий, Chirp (хроматина изоляция путем очистки РНК), ДИАГРАММА (захват анализ гибридизации РНК-мишеней) и RAP (очистка антисмысловой РНК) могут быть применены. По сравнению с более поздними, РНК выпадающий метод требует меньших усилий, чтобы создать. Он может быть использован для захвата белков в пробирке и в естественных условиях. В естественных условиях подход РНК спуском, который является технически более сложной , чем его аналог в пробирке, сохраняет РНК-белковых взаимодействий путем сшивания в клетках, захватывает аптамеров меченные РНК , представляющие интерес из клеток, а затем обнаруживает связанные ОДП. РНК спускающее может быть использован для обогащения низких обильные ОДП, и для выделения и идентификации РНК-белковых комплексов , которые имеют различные функциональные роли в управлении клеточной регуляции 9,10 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: РНК представляет интерес в контексте данного исследования является фрагментом AR 3'UTR.

1. Приготовление биотин-меченой РНК

  1. Для получения РНК, усиливать Т7-AR-олиго методом ПЦР с последующей транскрипцией в пробирке с использованием коммерческого набора и в соответствии с инструкциями изготовителя 11.
    Примечание: праймеры для ПЦР, приведены в таблице 4: T7-AR-F и Т7-AR-R.
  2. Для неспецифического связывания контроля, усиливать частичную последовательность люциферазы светлячка (ФЛ) ДНК с помощью ПЦР из psiCHECK-2 плазмиды, а затем в пробирке транскрипции.
    Примечание: праймеры для ПЦР, приведены в таблице 4: hluc (+) - Т7-зонд-F и hluc (+) - зонд-R Таблица 4 Последовательности матрицы и праймеров для ПЦР - амплификации...
  3. Для 50 мкл ПЦР-реакции, смесь 50 нг ДНК (олиго или плазмиды), 4 мкл дНТФ (2,5 мМ каждого отдельного дНТФ), 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 2,5 U / & #181; л ДНК-полимеразы, 2 мкл 10 мкМ прямого праймера, 2 мкл 10 мкМ обратного праймера, и нуклеазы без воды.
    1. Запуск ПЦР-амплификации в амплификатор с использованием следующей программы. ЭТАП 1: один цикл 95 ° С в течение 2 мин; STEP2: 35 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 30 секунд (AR) или 60 секунд (FL); ШАГ3: один цикл при 72 ° С в течение 10 мин.
  4. Обобщить биотинилированных РНК с использованием транскрипции набора в пробирке в соответствии с инструкциями изготовителя 11. В этом эксперименте используют продукты ПЦР в качестве матриц для синтеза РНК. Для 20 мкл в пробирке реакции транскрипции, смешайте 200 нг ПЦР - амплификации ДНК, 2 мкл каждого отдельного NTP, 1 мкл 10 мМ биотин-CTP, 2 мкл 10х реакционного буфера и 2 мкл РНК - полимеразы Т7. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 4 часов.
  5. После транскрипции в пробирке, Трит реакционной смеси с 1 мкл 2 ед / мкл ДНКазы при 37 & #176 ° С в течение 15 мин для разрушения шаблона ДНК. И, наконец, разбавленным биотинилированного РНК в общем объеме 60 мкл для последующей очистки.
  6. Очищают биотинилированных РНК для удаления солей и некорпоративные нуклеотидов с помощью колонок для очистки в соответствии с инструкциями изготовителя 12. Измерение концентрации РНК и хранят при -80 ° С в течение последующих раскрывающихся анализов.
  7. Для обеспечения правильной вторичной структуры для РНК интереса к РНК-белкового взаимодействия, тепла 50 мкл биотинилированным РНК (50 мкМ) при 90 ° С в течение 2 мин, холод на льду в течение 2 мин, затем поставить с 50 мкл 2x структуры РНК - буфера (табл 3), а также позволяют РНК складном при комнатной температуре в течение 30 мин 13,14.

2. Получение РНК-гранулами, конъюгированными

Примечание: Используйте магнитную подставку для разделения магнитных шариков и супернатанта.

  1. Ресуспендируют покрытые стрептавидином магнитные гранулы в оригинальном флаконе с кратким vorteсин в соответствии с инструкциями изготовителя. Перенести 150 мкл ресуспендировали бусин в 1,5 мл трубки. Поместите пробирку на магнит в течение 1 мин. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
    Примечание: В РНК раскрывающихся анализах, когда аликвоты ресуспендировали бусы из оригинального флакона, используйте 50 мкл бус Для анализа с последующим вестерн-блоттинга, и 200 мкл бусинки для анализа с последующим МС.
  2. Вымойте бусин один раз ресуспендирования бусинка гранул с 1 мл рекомендованной заводом - изготовителем 1x W & B (связывание и промывки) буфера (таблица 3), а затем, вращая трубку в течение 5 мин при комнатной температуре в ротатор. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
  3. Для того, чтобы инактивировать РНКазы на шариках, мыть бусин в два раза, каждый раз с помощью ресуспендирования осадком из гранул с 400 мкл буфера А. буфера А представляет собой щелочной раствор , содержащий 0,1 М NaOH и 0,05 М NaCl (таблица 3). Поворот через трубку в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
    4. <литий> Чтобы удалить NaOH из бисера, бусин мыть дважды, каждый раз при диспергировании осадком из гранул с 400 мкл буфера В (таблица 3), с последующим поворотом трубочки в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
  4. Ресуспендируют осадок шарик 300 мкл 2x W & B буфера, разделить поровну шарики и переносят на три 1,5 мл пробирки (100 мкл шариков на пробирку). Поставка бортовых содержащих пробирки с 100 мкл РНКазы свободной воды, 100 мкл биотинилированным РНК FL и 100 мкл биотинилированного А.Р. 3'UTR РНК, соответственно.
  5. Инкубируют каждый шарик смеси в течение 1 ч при комнатной температуре с вращением. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Выбросьте все супернатант. Держите шарик гранул.
  6. Промыть бусин в два раза, каждый раз с помощью ресуспендирования каждый осадком из гранул с 400 мкл 1x W & B буфера, а затем вращая пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре в ротатора.
  7. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Выбросьте все супернатант. Ресуспендируют каждый шарик Pelleт с 50 мкл буфера для ядерной изоляции (таблица 3).

3. преадипоцитов Изоляция и адипогенеза Индукционная

  1. Как было описано в предыдущих публикациях 5, рассекают преадипоциты из межлопаточной бурой жировой ткани (мышей дикого типа C57BL6, 3 недель).
  2. Вырастить и в пробирке дифференцировать преадипоциты 5. Клетки готовы к применению вниз по течению через 4-5 дней после начала дифференцировки.

4. Получение клеточного лизата из первичных адипоцитов

Примечание: Убедитесь, что все процедуры подготовки клеточного лизата сделаны на льду, и все буферы охлажденным на льду. Предварительно охлажденные Даунса стеклянные гомогенизаторы на льду.

  1. Растут и дифференцировать преадипоциты в 15 см чашки 5 (смотри раздел 3.2). Каждое блюдо обеспечивает адекватные клетки для одной РНК выпадающим анализа. На 4-й день или 5-й день дифференциации, сброшенных среды для культивирования клеток, и мыть CELLS один раз с 1x PBS.
  2. Для сбора клеток, добавляют 10-15 мл 1X PBS к клеткам, царапать, чтобы собрать клетки в 50 мл пробирку и Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант с помощью пипетки 1 мл.
  3. Осадок Ресуспендируют клеток в 2 мл гипотонического буфера (таблица 3), и инкубировать клетки на льду в течение 15 мин. Передача клеток в стеклянном гомогенизаторе 15 мл Даунса и касательные клетки механически на льду с 20 ударов.
  4. Гранул ядра клеток центрифугированием при 3300 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Держите ядер гранул на льду для дальнейшего использования (см раздел 4.6). Перенести супернатант в 1,5 мл пробирки, добавляют 3М KCl к супернатанту, чтобы получить конечную концентрацию 150 мМ, и спина при 20000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  5. После центрифугирования, тщательно удалить lipidlayeron верхней с помощью 1 мл пипетку, и собирают супернатант в качестве цитоплазматического клеточного лизата.
  6. Ресуспендируют ядер гранул (смотри раздел 4.4) в 1 мл ядерной изоляции буфера. Tядер ransfer в стеклянном гомогенизаторе 15 мл Даунса с использованием 1 мл пипетку и сдвига ядер механически на льду с 100 ударов. Гранул ядерного дебриса путем центрифугирования при 20000 х г в течение 15 мин при 4 ° С, и собирают супернатант в качестве ядерного клеточного лизата.
  7. Либо объединить ядерные и цитоплазматические клеточные лизаты, или использовать каждую фракцию отдельно, ниже по течению выпадающим применения. В этом демонстрационном эксперименте, эти две фракции клеточных лизатов были объединены при объемном соотношении 1: 1.
  8. Добавить ингибитор РНКазы в этой нефракционированного клеточного лизата с получением конечной концентрации 0,5 ед / мкл. Отложите 100 мкл клеточного лизата в качестве входного контроля для вестерн - блоттинга 15.

5. Binding и элюирования ОПБ

  1. Разделение лизат клеток на три равные аликвоты (1 мл лизата клеток в 1,5 мл трубки), и инкубировать с пустым, FL РНК-конъюгированные и А.Р. 3'UTR РНК-гранулами, конъюгированными (смотри раздел 2.8), соответственно, в течение 3 ч при 4 ° Сс вращением.
  2. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Собирают супернатант с использованием 1 мл пипетки, с последующим выделением РНК из надосадочной жидкости для подтверждения РНК целочисленность. Изолировать РНК с использованием кислоты гуанидина раствора тиоцианата-фенол В соответствии с инструкциями производителя (таблица 2). Оценка РНК целость путем анализа 28S и 18S субъединиц рибосомальной РНК. Держите шарик гранул на льду.
  3. Промыть магнитные гранулы шесть раз, каждый раз с помощью ресуспендирования каждый осадком из гранул с 1 мл ядерной изоляции буфера, содержащего 40 ЕД РНКазы ингибитора и 0,25% Igepal, а затем вращая пробирки в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Используйте магнитную подставку для разделения магнитных шариков и супернатанта. Выбросьте все супернатант. Держите шарик гранул на льду.
  4. Используйте следующие шаги для элюирования РНК-белковые комплексы из бисера для вестерн-блоттинга. Во-первых, ресуспендируют каждый шарик осадок в 75 мкл буфера для ядерной изоляции; Затем добавьте 25 мкл 4x Вестерн-блот загрузки БУФFER (содержащий SDS), чтобы получить общий объем 100 мкл. И, наконец, кипеть бусин в этом 100 мкл раствора при 95 ° С в течение 5 мин.
    Примечание: Используйте следующие шаги для элюирования РНК-белковые комплексы из бисера для MS. STEP1: ресуспендирования каждый шарик осадок в 100 мкл буфера для элюции (таблица 3); STEP2: инкубировать пробы шарик в течение 2-3 ч при комнатной температуре с вращением; STEP3: центрифуга и собирать белок, содержащий супернатант; STEP4: концентрат белковых растворов до 20-30 мкл до подачи на MS.
  5. Центрифуга каждые 100 мкл бисерной образца при 12000 х г в течение 30 с при температуре 4 ° С, и собирать надосадочную жидкость. Алиготе 15 мкл супернатанта для Вестерн-блоттинга (смотри раздел 6.1 и 6.2). Зонд полученной мембраны с разбавленной HuR мышиных моноклональных антител (1: 1000 разбавления), в течение ночи.

6. Вестерн-блоттинг по проверке ОПБ

  1. Отдельные ОДП по SDS-PAGE с использованием стандартных методик.
  2. Проведение мыСтерн-блоттинга с использованием стандартных методов, путем зондирования для ОДП, ассоциированных с РНК, представляющей интерес.
    Примечание: В этом демонстрационном эксперименте HuR мышиные моноклональные антитела использовали для иммунологического белка Hur.
  3. Выдержите полученную мембрану, разбавленным Hur антителом (1: 1000 разведение) в 5% вес / объем Обезжиренное сухое молоко, 1x TBS, 0,1% Твин - 20 на 4 ° C при осторожном встряхивании, в течение ночи. Вымойте мембраны три раза 1x TBST. Инкубируйте мембрану со вторичным антителом (козье антитело против мышиного IgG-HRP), при комнатной температуре в течение 1 часа. Вымойте мембраны. Разработка и запись сигнала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом демонстрационном эксперименте, фрагмент AR РНК использовали в качестве приманки, чтобы захватить его связывающий белок Hur. Оба РНК-приманка FL, которая не является отношение к белку Хур и аликвот неконъюгированных пустых стрептавидином бусин служили в качестве отрицательного контроля. РНК-белковых взаимодействий может происходить либо в ядре или цитоплазме, и этот протокол спускающее может быть применен к любой общей или фракционированной (ядерной или цитоплазматической) клеточны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

lncRNAs и ОДП играют жизненно важную роль в здоровье и болезни, однако молекулярные механизмы этих молекул изучены слабо. Идентификация белков, которые взаимодействуют с молекулами lncRNA является ключевым шагом на пути к выяснению механизмов регулирования. Обогащение ОДП по выпадающим системе анализа РНК на основе комплексного решения захвата взаимодействующих комплекса, так что белки из лизата клеток может быть селективно извлекали с помощью биотинилированных приманок РНК, связанные с стрептавидином магнитных шариков....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Сингапур NRF стипендий (NRF-2011NRF-NRFF001-025), а также CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
основные материалы, использованные в этом исследовании.
MEGAscript kit  Амбион
Биотин-14-КТП Спин-колонки Invitrogen
NucAway Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen
HuR (3A2) (sc-5261) Santa Cruz Biotechnology
Goat Anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) Santa Cruz Biotechnology
Hypure Молекулярная биология Вода класса (без нуклеаз) ГиКлон
Фосфат Буферный Солевой Раствор (1&раз; PBS)  Ингибитор
 Биолайн
ингибитор протеазы Сигма
Пфу Турбо ДНК полимераза Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
NameCompanyКаталожный номер>Комментарии
Основное оборудование, использованное в этом исследовании.
Sorvall Legend Micro 21R центрифуга Центрифуга Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R Thermo Scientific
Bio-Rad T100 Bio-Rad
Nanodrop 2000 Ротатор Thermo Scientific
BOECO Multi Bio RS-24 BOECO, Германия
Аппарат для электрофореза и блоттинга белкового геля Магнит Bio-Rad
DynaMag-2 Технологии
Мышиное моноклональное антитело РНКазы HyCloneТермоамплификатор Life

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973(2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203(2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Теги

In Vitro TranscriptionBiotinylated RNAStreptavidin BeadsCell Lysate PreparationWestern BlottingHuR ProteinAR 3 UTR

Похожие статьи