Методическая статья

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54259

⸱

29 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1R&D Reagents, Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology, Oncotest GmbH

В этой статье

Краткое содержание

Человеческие ксенотрансплантаты опухоли и развитую сосудистую сеть инфильтрирована клетками мыши происхождения во время фазы роста в естественных условиях. Чтобы обойти смещение, вызванное этими загрязняющими клетками во время ниже по течению анализа, мы разработали метод, позволяющий для полной истощению всех клеток мыши с помощью магнитной сортировки клеток.

Аннотация

Использование в пробирке моделей клеточных линий для исследований рака является полезным инструментом. Тем не менее, было показано , что эти модели не могут надежно имитировать опухоли пациента в различных анализах 1. Человеческие ксенотрансплантаты опухоли представляют собой золотой стандарт в отношении биологии опухоли, открытия новых лекарств, а также исследования метастаза 2-4. Ксенотрансплантатов может быть получена из различных типов материалов , таких как линии опухолевых клеток, опухолевых тканей от первичных опухолей пациента 4 или последовательно перевиваемых опухолей. Когда размножают в естественных условиях, ксенотрансплантированной ткань пропитывается и васкуляризации клетками мыши происхождения. Несколько факторов, таких как лица, опухоли, происхождение ксенотрансплантированной материала, скорости роста и области трансплантации влияет на состав и количество клеток мыши, присутствующих в опухолевых ксенотрансплантатов. Тем не менее, даже когда эти факторы остаются постоянными, степень загрязнения клеток мыши сильно варьирует.

Колорадоntaminating клетки мыши значительно снижают вниз по течению анализа ксенотрансплантатов опухолей человека. Как фибробласты мыши показывают высокий металлизации эффективностями и скорость пролиферации, они имеют тенденцию разрастаться культуры опухолевых клеток человека, особенно медленно пролиферирующих субпопуляции. Клеток мыши получена ДНК, мРНК и белковые компоненты могут предвзятость анализ экспрессии генов вниз по течению, следующего поколения секвенирования, а также анализ протеома 5. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали быстрый и легкий метод, чтобы изолировать нетронутые опухолевых клеток человека из ксенотрансплантированной ткани опухоли. Эта процедура основана на комплексном истощению клеток мышиной происхождения путем объединения автоматизированной диссоциацию ткани с диссоциатора Benchtop ткани и магнитной сортировки клеток. Здесь показано, что клетки-мишени человека может быть может быть получена с чистотами выше 96% в течение менее чем 20 мин независимо от типа опухоли.

Введение

Солидные опухоли человека состоят из нескольких физиологических, а также опухолевые типов клеток. Они образуют разнородные ткани со сложными биологическими структурами. Биологические процессы , такие как опухоли формирования, прогрессии и ответы по отношению к терапии еще до конца не изучены. В пробирке модели культивирования клеток представляют собой полезный инструмент для изучения и понимания биологии опухоли. Тем не менее, они могут лишь частично отражают структуры и процессы, обнаруженные в опухолевых тканях. Надежные и стабильные доклинические модели опухолей человека являются предпосылкой для развития противоопухолевых препаратов и методов лечения 4,6, а также для понимания биологии опухоли и взаимодействие опухолевых клеток и их окружением.

Модели опухолей человека ксенотрансплантата , полученные из первичных опухолей пациентов показывают высокие отношения к ткани происхождения относительно гистологического архитектуры, взаимодействия с микро-экологических структур, метастатический потенциал и ответы к лекарственным средствам 7 . Даже тогда , когда опухолевые ксенотрансплантаты получают из культивируемых клеток или клеточных линий , они более близко имитируют опухоли пациента, поэтому свидетельствуют об улучшении показателей надежности в большинстве анализов по сравнению с в пробирке моделей клеточных культур. Эти особенности делают их золотым стандартом доклинических моделей 4. Кроме того , его применение в исследовании рака, ксенотрансплантации человеческих клеток в организм мышей также часто используется в исследованиях стволовых клеток для определения стволовости и дифференциации потенциала целевой группы населения 8.

Было показано , что человеческий микроциркуляторного русла и иммунные клетки человека заменяются при распространении в естественных условиях опухолей человека 2,9. Такие факторы, как подтипа опухоли, скорости роста и области трансплантации оказывает значительное воздействие на глобальном уровне инфильтрации, а также состав типов клеток мыши нашли. Тем не менее, даже когда эти факторы остаются постоянными, количество и состав клеток мыши сильно варьируют,

Downstream анализ ксенотрансплантированной тканей часто оспаривается клетками мышиной происхождения. Первичные культуры опухолевых клеток человека из ксенографтов часто зарастают фибробластами. Кроме того , затрудняя поколение опухолевых клеточных линий в пробирке, вниз по течению анализы , такие как тестирование на цитотоксичность лекарственного средства или фармакокинетики смещаются , так как в коррекции силикомарганца для эффектов , происходящих от загрязнять клеток мыши в большинстве случаев невозможно. Помимо этого, лишь частично выяснены наводок между мышиных фибробластов и опухолевых клеток человека оказывает непосредственное влияние на экспериментальных результатов исследований 10. Кроме того, наиболее широко непредсказуемый вариант инфильтрации клеток мыши обостряет анализы точные молекулярные вниз по течению. В NGS или протеомом анализирует каждый мыши полученный сигнал, измеренный вместо сигнала опухоли человека непосредственно снижает чувствительность секвенирования. Также анализ экспрессии микрочипов на основе бросает вызов мышиного писLEIC кислоты, возможно, крест гибридизации с зондами человека.

Для того, чтобы обойти препятствия загрязняя клетки мыши в нижнем течении анализа опухолевых клеток человека из ксенотрансплантатных моделей были предложены различные подходы. Во многих исследованиях желательные клетки-мишени для анализа вниз по течению выделяют путем использования маркеров или комбинаций маркеров экспрессируется исключительно на опухолевых клетках человека. Тем не менее, отсутствие надежных маркеров для положительной идентификации опухолевых клеток человека часто представляет собой большое препятствие. Даже широко выраженные маркеры, такие как EpCAM на карциномах человека, часто показывают опухоли внутренней экспрессии различия 11. Это увеличивает риск того, что низкий , выражающие субпопуляции, например, опухолевые клетки эпителиального подвергшийся к мезенхимальных перехода, теряются в процессе выделения. Кроме того, прямое связывание селективного агента к клетке-мишени могут повлиять на последующие результаты анализа. Попытки истощению клеток мыши с помощьюс использованием комбинации антител , специфичных к мышиным CD45 и I эпитопов ГКГ класса также были сделаны 12. Тем не менее, эта комбинация маркер обнаруживает только подмножество клеток мыши. Другой подход заключается в расширении процессов анализирующие программным обеспечением. Тем не менее, все эти подходы либо не подходят для любого вида экспериментальной установки или для любого субъекта опухоли и метода трансплантации.

В данном исследовании мы представляем новый и быстрый способ всесторонне разрушающих клетки мышей из ксенотрансплантированной тканей вне зависимости от штамма и ткани происхождения мыши. В скринингов на нескольких целевых органов и тканей для трансплантации ксенотрансплантатов (в том числе кожи, легких, головного мозга, почек и скелетных мышц), мы смогли определить комбинацию антител, позволяющих всесторонне обнаруживать клетки мыши. Эти антитела были связаны с суперпарамагнитных частиц, титрование и оптимизированы для разрушения с помощью магнитной сортировки клеток. Как только конкретная мышьантитела используют клетки-мишени человека остаются "нетронутыми" и метод не ограничивается ксенотрансплантированы опухолевой ткани. Показано, что всестороннее удаление клеток мыши из ксенотрансплантированной образцов опухолей стандартизирует и способствует культур опухолевых клеток человека. Кроме того, мы показываем, что анализ ксенотрансплантатов опухолей человека с помощью следующего поколения секвенирования значительно улучшается. Как этот эффект наблюдался, хотя конкретный выбор последовательность человека была проведена во время обогащения ExoME, влияние на весь геном и весь транскриптома последовательности, как ожидается, будет еще более заметным. Взятые вместе, удаление клеток мыши, используя этот новый способ облегчает культивирование опухолевых клеток человека и значительно улучшает вниз по течению анализа ксенотрансплантатов опухолей человека.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с местными этическими и правовыми директивами Regierungspräsidium Freiburg Referat 35.

1. Подготовка реагентов

Примечание: Перед началом эксперимента, подготовить следующие реагенты из набора диссоциации:

  1. Чтобы приготовить фермент Н растворить каждую ампулу лиофилизированного порошка в 3 мл RPMI 1640. института Roswell Park Memorial 1640 (RPMI 1640), или модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM). Во избежание повторного замораживания и оттаивания подготовить подходящие аликвоты (например, 200 мкл) и хранить их при температуре - 20 ° С в течение до 6 месяцев.
  2. Для приготовления фермента R растворить флакон лиофилизированного порошка в 2,7 мл RPMI или DMEM среды. Во избежание повторного замораживания и оттаивания подготовить подходящие аликвоты (например, 100 мкл) и хранить их при температуре - 20 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Для приготовления фермента А растворить VМВЛ лиофилизированного порошка в 1 мл Буфера А поставляется с комплектом без встряхивания. Для того , чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания подготовить подходящие аликвоты и хранить их при температуре (например, 25 мкл.) - 20 ° С в течение до 6 месяцев. Убедитесь в том, чтобы тщательно перемешать эту суспензию непосредственно перед снятия требуемого объема реакционной смеси.
  4. Приготовьте 250 мл буфера (1x PBS с 0,5% BSA) для процедуры разделения клеток и с использованием меченых антител.
    Примечание: При культивировании клеток после удаления клеток мыши фильтровать все буферы и растворы ферментов через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

2. Опухоль диссоциация Протокол

Примечание: В данном исследовании пациентов, полученных ксенотрансплантаты немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), использовались рак почек и мочевого пузыря. Опухоли были получены имплантацией ксенотрансплантаты немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) рак почек и мочевого пузыря в 4 - 6 недель самок NMRI ню / ню мышей , как описано выше 13 .
Примечание: Поскольку этот протокол является полностью независимым от типа опухоли, он может быть использован для любого вида пациента или клеточной линии, полученные из опухолей, а также другие виды ксенотрансплантированы ткани человека без модификации протокола.

  1. Подготовьте 5 мл сбраживания смеси на образец ткани (до 1 г) свеже добавлением 4,7 мл RPMI 1640 или DMEM, 200 мкл фермента Н, 100 мкл фермента R и 25 мкл фермента А в сотовой диссоциации трубки ( Труба С). Убедитесь в том, чтобы тщательно перемешать фермента R суспензии до снятия требуемого объема.
  2. Жертвоприношение животных путем смещения шейных позвонков под наркозом. Дезинфекцию мышь опрыскиванием небольшим количеством 80% об / об этанол.
  3. Урожай подкожной опухоли с фланга мыши с помощью щипцов и ножниц в капюшоне культуры ткани. Порезать кожу открытую в месте опухоли с помощью ножниц, а затем отделить опухоль от смежной здоровой ткани с помощью пинцета и ножниц.
    Примечание: В зависимости от целиэксперимент выполнить это, и следующие шаги в асептических условиях. В этом исследовании были проведены все этапы в культуре клеток капюшоном в асептических условиях для того, чтобы быть в состоянии культивировать клетки.
  4. Подготовка образца опухоли легкого у пищеварений путем удаления жира (как это будет сделать образец с плавающей точкой) и некротические участки (так как это приведет к снижению жизнеспособности) за счет сокращения его прочь с помощью щипцов и скальпелем. Фарш ткань на куски 2 - 4 мм с помощью скальпеля и пинцета.
  5. Перенесите куски ткани в C пробирку, содержащую переваривания смеси.
  6. Закройте C Tube и убедитесь, что она плотно закрыта. Прикрепите его с ног на голову на втулку диссоциатора ткани стендовых и убедитесь, что кусочки ткани расположены в области ротора / статора.
  7. Выберите режим "h_tumor_01", нажав кнопку "вверх" или кнопку "вниз", пока режим не появится на дисплее, а затем нажать на кнопку "Пуск".
    1. Если тыпеть функцию нагрева диссоциатора ткани стендовых, не забудьте также прикрепить обогреватель. Затем запустите режим 37C_h_TDK_1 (для мягких опухолей), 37C_h_TDK_2 (для средних опухолей) или 37C_h_TDK_3 (для твердых опухолей), нажав на значок папки на сенсорном экране, пока не появится папка "Miltenyi".
    2. Для того, чтобы выбрать режим, нажмите на стрелку вверх или вниз, пока режим диссоциации выделен 37C_h_TDK_2. Рукава диссоциатора Benchtop ткани изображены в виде позиции на дисплее устройства. Выберите позиции образцы работают на их, нажав на сенсорном экране. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы запустить режим и продолжите с шага 2.16.
      Примечание: В зависимости от типа опухоли, другая программа диссоциации может быть приемлемым (этап 2.7.1).
  8. Обратите внимание окно, показывающее "Прекращение программы" на экране. После окончания программы, отсоединить C трубки от диссоциатора ткани Benchtop.
  9. Инкубируйте образца в течение 30 мин при 37° C при непрерывном вращении, например, с помощью трубки ротатор.
  10. После инкубации прикрепить C Внутренний слой вниз головой на втулку диссоциатора ткани Benchtop. Опять же, убедитесь, что материал образца находится в зоне ротора / статора.
  11. Запустите программу диссоциации h_tumor_02 (для мягких и средних опухолей) или h_tumor_01 (для твердых опухолей), как описано в шаге 2.7.1.
  12. После окончания программы, отсоединить C трубки от диссоциатора ткани Benchtop.
  13. Инкубируйте образца в течение 30 мин при температуре 37 ° С при непрерывном вращении.
  14. Приложить C Tube перевернутом на втулку диссоциатора ткани после Benchtop инкубации. Опять же, убедитесь, что материал образца находится в зоне ротора / статора.
  15. Запустите программу диссоциации h_tumor_03 (для мягких опухолей), h_tumor_02 (для средних опухолей) или h_tumor_01 (для твердых опухолей), как описано в шаге 2.7.
  16. Для того, чтобы собрать материал образца в нижней части трубы выполнить шоRT центрифугирование (при 100 мкг в течение 10 сек).
  17. Ресуспендируют клеток и применить к клеточный фильтр с размером Nesh 70 мкм размещенную на 50 мл трубки. Промыть фильтр грубой очистки клеток с 20 мл RPMI 1640 или DMEM.
  18. Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 7 мин. Отберите супернатанту полностью.
  19. Ресуспендируют клеток в 5 мл буфера для подсчета. Продолжайте Mouse Cell Истощение путем магнитной сепарации клеток (раздел 3).

3. Mouse Cell Истощение от магнитной ячейки технологии разделения

Примечание: Объемы для магнитной маркировки , приведенные ниже , могут быть до 2 × 10 6 опухолевых клеток или 10 7 всех клеток , включая эритроциты. В зависимости от размера опухоли менее или более высокие количества клеток будут получены. В случае меньшего количества клеток, используют те же объемы, как указано. При использовании более высоких количеств клеток, расширить масштабы всех объемов реагентов и общие объемы соответственно (например, в течение 4 х 10 6 опухолевых клеток или 2 х 10 7 всего клеток, используют в два раза больше объема всех указанных объемов реагентов и общего объема).

  1. Определение количества клеток аликвоты из клеточной суспензии на стадии 2,21 с помощью микроскопа и подходящую камеру для подсчета.
    Примечание: В этот момент суспензию клеток состоит из гетерогенной смеси опухолевых клеток человека, а также стромальных мыши и клетки крови, в том числе эритроциты. Состав клеток сильно зависит от типа опухоли и области для трансплантации.
  2. При проведении анализа методом проточной цитометрии после удаления клеток мыши вывести 100 мкл аликвоты в подходящих труб для неокрашенной и два для анализа потока цитометрии одиночного контроля цвета окрашивания в. Храните их в холодильнике при температуре 2 - 8 ° C до дальнейших шагов окрашивания (раздел 4).
  3. Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 10 мин. Удалите супернатант.
  4. Осадок Ресуспендируют клеток в 80 мкл буфера на 2 х 10 6 опухолевых клеток или 10 7всего клетки Добавьте 20 мкл реагента магнитной маркировки для клеток мыши.
  5. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут в холодильнике (2 - 8 ° C). Во время магнитной маркировки, подготовить крупномасштабные столбцы (LS столбцы) для магнитной сепарации, поместив его в магнитном поле соответствующего магнита (см таблицу материалов и оборудования) в соответствии с протоколом производителя. Промыть колонку с 3 мл буфера.
  6. Отрегулируйте объем образца до 500 мкл с помощью буфера до 2 × 10 6 опухолевых клеток или до 10 7 всех клеток. (До 1 × 10 7 опухолевых клеток или до 5 × 10 7 клеток всего могут быть обработаны на одном LS колонке. При работе с большим количеством ячеек разделить образец на несколько LS столбцов).
    1. При проведении анализа методом проточной цитометрии, молекулярный анализ или сравнение фракций в культурах, изымать 50 мкл аликвоты в качестве несортированных образца. Храните его в холодильнике при температуре 2 - 8 ° С до дальнейшей обработки.
  7. Применить 500 мкл клеточной суспензии на предварительно подготовленную колонку. Сбор проточные, содержащий немаркированные клетки-мишени, представляющие обогащенные опухолевые клетки человека.
    Примечание: При работе с более высокими количествами клеток до 2,5 мл клеточной суспензии, который был приготовлен согласно пункту 3.5 может быть применена к одному столбцу.
  8. Промыть колонку с 2 х 1 мл буфера. Собирают клетки, которые проходят через и в сочетании с проточных с шага 3.6. Выполнение стадии промывки путем добавления буфера аликвоты по 1 мл, как только колонна резервуар пуст.
    Примечание: проточный содержит очищенный опухолевых клеток человека.
  9. Для того, чтобы также собирать клетки мыши, сохраняемых в столбце, удалить столбец из сепаратора и поместите его на подходящую трубу. Пипетка 3 мл буфера на колонку и немедленно использовать поршень, чтобы избавиться от клеток мыши, крепко толкая его в колонну.
  10. Спином вниз фракций и контрольных образцов при 300 мкг в течение 10 мин. Отберите Супеrnatant полностью и ресуспендирования клеток в буфере, культуральной среде, или замораживать гранул в жидком азоте, в зависимости от желаемого применения вниз по течению.

4. Downstream Анализы

  1. Окрашивание для анализа проточной цитометрии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением анализов далее вниз по течению, часть клеток , полученных из процедуры истощения клеток мыши можно анализировать (например, оценить чистоту и выход) в проточной цитометрии.
    1. Для потока цитометрии анализа, спина по меньшей мере, 10% отрицательной и положительной фракции, полученной из процедуры магнитной сепарации клеток (раздел 3), а также контрольные образцы с шагом 3,2 и 3,5 при 300 мкг в течение 10 мин.
    2. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток из контрольных образцов окрашивание с шагом 3.2 в 90 мкл буфера. Ресуспендируют фракции, полученные из процедуры магнитной сепарации клеток в 80 мкл буфера.
    3. Добавьте 10 мкл мыши FcR блокирующего реагента для всехобразцы. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин при 2 - 8 ° C в холодильнике.
    4. Добавьте 10 мкл анти-человеческий EpCAM-PE (равно разведение антител 1:10) и 25 мкл анти-мыши-APC коктейль (равно разведение антител 1: 4) к образцам из раздела 3. Добавьте 10 мкл анти -человеческий EpCAM-РЕ к одному контрольному образцу цвета (равно разбавление антител 1:10) и 10 мкл анти-человеческий EpCAM-APC к другому (равнозначными разбавление антитело 1:10). Смешайте все образцы и инкубировать в течение 10 мин при 2 - 8 ° C в холодильнике.
      Примечание: EpCAM, не подходит в качестве опухолевых клеток маркером любого типа опухоли. Для опухолей, используемых в этом выражении исследование EpCAM было известно.
    5. Для того, чтобы мыть образцы, добавьте 1 мл буфера каждого и спина при 300 мкг в течение 5 мин.
    6. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток до концентрации для анализа методом проточной цитометрии. Чтобы исключить мертвые клетки добавляют пропидий йодида (1 мкг / мл).
    7. Выполнить анализ проточной цитометрии с использованием подходящего пнизкий цитометр в соответствии с протоколами производителя.
  2. Культивирование клеток опухоли человека
    Примечание: В дополнение к проточной цитометрии, клетки , полученные из процедуры разделения могут культивироваться и использоваться для дальнейших анализов в лабораторных условиях .
    1. Ресуспендируют отсортированный фракции из раздела 3 в культуральной среде до концентрации 5 × 10 5 клеток / мл.
      Примечание: В зависимости от типа опухоли покрытия, подходящей плотности посева, а также условия культивирования могут отличаться.
    2. Добавьте 500 мкл суспензии клеток в лунки 24-луночного планшета, покрытого 0,1% желатина.
    3. Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С и 5%.
      Примечание: Оптимальные условия культивирования зависит от типа опухоли, используемой. Таким образом, применяются условия культивирования, подходящие для типа опухоли, используемой.
  3. Иммунофлуоресценции Окрашивание культивируемых клеток
    1. Подготовка блокирующего раствора путем добавления 10% FCS и 0,1%Тритон Х-100 до 1X PBS.
    2. Отбросить культуральной среды. Добавить 500 мкл 1x PBS на лунку, чтобы промыть клетки. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре (RT), а затем выбросить 1X PBS полностью.
    3. Закрепить клетки путем добавления 300 мкл 4% раствора PFA. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Откажитесь решение PFA. Вымойте Фиксированные клетки 3 раза, как указано в пункте 4.3.2.
    5. Выполните пермеабилизации и блокирование путем добавления 300 мкл блокирующего на лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
    6. Откажитесь блокирующего раствора. Вымойте клеток, как указано в пункте 4.3.2.
    7. Добавьте 300 мкл первичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе к клеткам. Против человеческого антитела EpCAM, разводили 1:40, Виментин антитело разводили 1: 200. Выдержите в течение ночи при температуре 2 - 8 ° C.
      Примечание: Антитела, используемые не подходят для любого типа опухоли, как EpCAM, не могут быть выражены на опухолевых клетках и / или виментину также экспрессируется опухолевыми клетками. Убедитесь в том, что антитела, используемые подходят для ксенотрансплантата модель.
    8. Выбросьте раствор первичного антитела. Вымойте клетки 3 раза, как указано в пункте 4.3.2.
    9. Добавьте 300 мкл вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе к клеткам. Оба антитела, анти-кроличий IgG-Alexe594 и анти-мышиного IgG-Alexa488 разводят 1: 400. Инкубировать в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре.
    10. Выбросьте раствор вторичного антитела. Вымойте клеток в 2 раза, как указано в пункте 4.3.2.
    11. Добавьте 300 мкл раствора DAPI (0,1 мкг / мл) в каждую лунку. Инкубировать в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре.
    12. Откажитесь решение DAPI. Вымойте клетки 3 раза, как указано в пункте 4.3.2.
    13. Добавить 500 мкл 1x PBS в каждую лунку. Выполните флуоресцентной микроскопии с использованием подходящего микроскопа.
  4. Всего секвенирование экзома
    1. Для получения полного состава секвенирование экзома (WES) замораживания гранул из стадии 3,9 в жидком азоте. Хранить и собирать образцы при -80 ° С.
    2. После сбора клеток, выполняют ExoME захватывая и весь ExoME SEQuencing в соответствии с инструкциями изготовителя соответствующего комплекта (см таблицу материалов и оборудования).

Результаты

Различные подходы были предложены, чтобы идентифицировать или истощать клетки мышей из ксенотрансплантированной опухолей человека, например, сочетание мыши-специфических антител против CD45 и МНС класса I. Однако, только субпопуляции клеток мыши были обнаружены с помощью этих комбинаций в то время как предлагаемая комбинация обнаружена CD45 и МНС класса I клеток , экспрессирующих мыши, а также остальных клеток мыши , обнаруженных в тканях для трансплантации (рисунок 1). Используя эту новую комбинацию антител для магнитной сортировки клеток, опухолевые клетки человека могут быть выделены независимо от типа опухоли (рисунок 2).

Клетки , полученные из клеток разделения процедуры на основе удаления магнитного мыши клеток может быть культурным, что приводит к чистых культур опухолевых клеток человека (рис 4). Кроме того, жизнеспособные клетки мыши могут быть получены и культивируют изтот же образец. Кроме удаления клеток мыши, а также мусор удаляли на клетки мыши истощение (MCD) (рисунок 3).

Обширный истощение клеток мыши, а также удаление мусора приводит к улучшению анализа молекулярных вниз по течению. Это было продемонстрировано путем сравнения результатов , полученных в целом секвенирование экзома (WES) , выполненные на объемных частей опухолевых клеток и обедненного образцов мышей из трех различных моделях опухолей ксенотрансплантата пациентов происхождения (рис 5 - 9). Наши данные свидетельствуют о том, что удаление клеток мыши перед выполнением WES на ксенотрансплантатных образцах опухолей не только значительно увеличивает общее количество операций чтения (рисунок 5) , но и значительно снижает количество хост полученный чтениями к человеческому референсного генома (рис 6В). Поскольку эти ошибочно сопоставляется мышь читает часто мешают SNP призванию, мы наблюдали сильное уменьшение ложно предсказалОНП после МКД (рис 7 - 8). Наконец, мы показали, что удаление в силикомарганца мыши, полученных читает методами биоинформатики не может полностью заменить экспериментальную процедуру, так как однозначная последовательность на основе присваивание вида происхождения не было возможности для всех операций чтения. Кроме того, в процедуре силикомарганца не мог правильно для повышения качества и сопутствующей более высокой базы считывания в пробирке с обедненным образцов (рисунок 9).

figure-results-1
Рисунок 1. Создание Cocktail антитела , распознающего Все клетки мышиной через несколько органов 14. Отсев в различных органах, в том числе кожи, легких, головного мозга, почек и скелетных мышц, были выполнены. Эти органы представляют собой основные ткани-мишени для ксенотрансплантации. Комбинации, такие как те, распознающих МОВсе CD45 и I эпитопы МНС класса уже использовались для того, чтобы истощить клетки мышей после ксенотрансплантации. Тем не менее, эти комбинации маркеров признаны только подмножество клеток мыши во всех анализируемых тканях. В предыдущих скринингов комбинация из пяти антител было идентифицировано что позволяет комплексного обнаружения всех клеток из мыши происхождения. Эта панель содержит эритроциты и не зависит от ткани происхождения (A, B, и данные не показаны). Измененный 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Надежная и быстрая Истощение мышиных клеток 15. Конъюгаты комбинации антител с суперпарамагнитном пanoparticles были использованы для разработки оптимизированного протокола для истощению клеток мыши из ксенотрансплантатов опухолей человека с помощью магнитной сортировки клеток (магнитной сепарации клеток) (A). Этот новый протокол позволил для устранения> 99% загрязняющих клетки мышей менее чем за 20 минут, независимо от типа опухоли. Клеточные фракции , полученные из процедуры магнитной сепарации клеток метили коктейлю пан-мышиного антитела и человеческого специфического антитела против CD326 (EpCAM) (B). Измененный 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Выделение человеческих клеток глиобластомы. Мышь Cell Истощение Kit был использован для выделения клеток глиобластомы человека от взрослых MOUsе мозга. Во время диссоциации нервной ткани больших количеств мусора обычно генерируется. MCDK эффективно истощает мертвые клетки и мусор, как видно на графике, показывая размер клеток по сравнению с клеточной зернистости. С этим сопряженного коктейль, можно было устранить> 99% загрязняющих клеток мыши и> 60% мусора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Истощение мышиных клеток Облегчает Downstream культур опухолевых клеток человека 14. Фибробласты мышей часто тормозят культивирование опухолевых клеток человека после диссоциации пересаженных тканей или привести к гетерогенным культур. Фибробласты прикрепиться и расширить более эффективно, таким образом, зарастание целевой C гезов. Это возмущает в пробирке анализов на клеточных культурах (например, тестирование цитотоксичность лекарственного средства), так как математической коррекции для эффектов , возникающих от загрязнять клеток мыши в большинстве случаев невозможно. Отрицательное (В) и положительные фракции (C) после того, как истощение клеток мышей культивировали в течение трех дней, фиксировали и окрашивали для мыши конкретного фибробластами маркера (Виментин) и маркером опухоли человека специфических CD326 (EpCAM). В качестве контроля, исходная фракция , содержащая неразделенные клеток (A), культивировали и окрашивали , как хорошо. Даже через три дня культивирования, наблюдалось почти чистой популяции опухолевых клеток человека в отрицательной фракции (В), в то время как несортированная фракция (А) была почти зарастает фибробластами. Лишь небольшая часть клеток - мишеней была утрачена к положительной фракции (С). Модифицированный из 14.ge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Всего секвенирование экзома (WES) опухолевых образцов До и после того, как Mouse Cell Истощение (MCD) 15. Мы провели WES на трех различных моделях ксенотрансплантатов , полученных из человеческой почки, легких и рака мочевого пузыря с целью оценки влияния на MCD качество секвенирования данных следующего поколения. ДНК из объемной опухоли и от изолированных клеток опухоли после истощения клеток мышей использовали для получения ExoME захваченное библиотек секвенирования, применяющим набора для захвата ExoME. Для секвенирования на настольном секвенсор инструмента, набора реагентов настольного секвенсор 150 циклов, был использован для создания 75-ВР парноконцевое чтение. Значительное увеличение (р <0,05) в плотности кластера (A) а также прувеличение ярости для чтения эпизодам 33% (В) наблюдалось для образцов истощенных клеток мыши, что указывает на улучшение качества образца. Соответственно, сильное уменьшение мусора и мертвых клеток на MCD также может быть продемонстрирована с помощью проточной цитометрии (смотри рисунок 3). Измененный 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6. Мышь Cell Истощение (MCD) Сильно уменьшает количество Ошибочно Mapped мыши Читает после полного секвенирование экзома (WES) 15. В качестве захвата олигонуклеотиды , используемые для целенаправленного обогащения белок-кодирующих последовательностей были разработаны на основе генома человека, первоначальное пред- обогащение фрагментов ДНК происхождения FR человеческогоом, как ожидается, смесь мышиных и человеческих клеток. Для того чтобы оценить количество захвата олигонуклеотидов, которые могут пересекать-гибридизации с мышиной геномной ДНК, мы провели BLAST поиски каждого отдельного быстрого захвата ExoME зонда против мышиного генома. Полученные параметры выравнивания были использованы для определения возможной перекрестной гибридизации. (.. Длина выравнивания, нет несоответствий, нет пробелов) В зависимости от порогов отбора, мы предсказали перекрестную реактивность 5 - 10% от захвата зондов с транскриптов мыши (данные не показаны). После того, как адаптер вырезку (trimmomatic v0.32 16), мы нанесем чтений всех образцов против геномов человека и мыши (BWA v0.7.12 17) и определили их ориентировочное происхождения на основании соответствующих параметров выравнивания (LINUX оболочки, командной строки Perl) (А). В среднем 12% от чтений происходит от объемных образцов опухолей было связано с мышиными клетками. Эта сумма может быть снижена до 0,3% по предварительной истощению клеток мыши (В ). В среднем 15% от мыши полученный чтениями ошибочно генома человека, что соответствует 1,9% от общего числа просмотров в образцах основная масса опухоли и 0,04% в изолированных опухолевых клеток, сильное положительное влияние истощения клеток мыши на последующих анализов можно ожидать. фиг.6В иллюстрирует назначение подробного чтения для объемной опухоли и изолированных клеток опухоли человека , полученных из ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря. Измененный 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7. MCD Сильно уменьшает количество Ложно Прогнозируемая ОНП 15. Для того чтобы определить влияние мыши чтениями в геноме человека, мы определили количество predicteD ОНП для образцов ксенотрансплантатных до и после MCD. Поскольку ни здоровой ткани не было доступно для сравнения, SNP была определена как разность между виртуализированного образцом и референсный геном (hg19). После удаления дубликатов читает, SNP и INDEL призвание было проведено 18 и была ограничена регионами мишенью комплектом захвата ExoME. 63 ± 10% от всех ОНП ​​прогнозируется объемные образцы опухоли были больше не обнаружены после истощения клеток мыши, 18 ± 1% были характерны для изолированных опухолевых клеток человека (A). В то время как первые были в основном вызваны ошибочно отображенной мыши читает последний, казалось, обнаруживается в связи с более высоким числом чтения и, соответственно, более высокий охват в пределах выделенных образцов опухолевых клеток человека. Этот эффект был также виден на предсказанных вставкам (В). Измененный 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогоцифра.

figure-results-8
Рисунок 8. MCD улучшает предсказание Ударопрочный ОНП 15. (A) Влияние MCD на предсказания SNP в кодирующей белок экзона гена POLA1 19 иллюстрируется. В то время как ошибочно сопоставляется мыши чтений вызвало ряд ложно предсказанных ОНП в объеме ксенотрансплантата рака почки, эти SNPs пропали без вести после того, как MCD. Кроме того, MCD также улучшил прогноз ударопрочного ОНП. Например, мышь чтениями на референсный геном в массивном образце опухоли привело к ошибочно предсказанного разрушению старт - кодоном гена GRIA3 (B). Измененный 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

s = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-странице = "1"> figure-results-9
Рисунок 9. В Silico Истощение мыши полученные Читает не может полностью заменить I п Vitro MCD 15. Чтений по прогнозам, будет мышиного происхождения были вычислительно удалены из последовательности данных, и повторяли SNP призвание. При таком подходе количество ОНП предсказаны для объемных образцов опухоли была значительно снижена с 63% до 8,5% от общего количества полиморфизмов (сравните с рис 8). Тем не менее, это в силикомарганца подход не может полностью заменить в пробирке MCD, особенно если повышение качества образца и сопутствующее увеличение отсчетов для чтения и охват считаются. Модифицированный от 15."_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Мы разработали быстрый и легкий метод, чтобы изолировать нетронутые опухолевых клеток человека из ксенотрансплантированной опухолевой ткани. Эта процедура основана на комплексном истощению клеток мышиной происхождения путем объединения автоматизированной диссоциации ткани и магнитной сортировки клеток. Помимо истощения всех клеток мыши также количество мертвых клеток и мусора значительно снижается во фракции клеток-мишеней. В совокупности этот метод значительно улучшает молекулярного анализа вниз по течению и культивирование опухолевых клеток человека.

В отличие от альтернативных методов, нет необходимости в знании опухолевых клеток специфических маркеров, корректировка различных композиций клеток мыши или создании алгоритмов. Представленный метод не зависит от мышиного штамма и типа опухоли. Таким образом, смещение путем изоляции опухолевых субпопуляций человека на основе отдельных специфических маркеров человека , которые могут изменяться в выражении, как показано на EpCAM 11, является избегатьредактор Кроме того, оно не ограничивается опухолевого материала, но может быть использован для любого вида ксенотрансплантированы ткани, как клетки мыши целевой вместо конкретных субпопуляций опухолей человека (данные не показаны).

Всестороннее удаление клеток мыши способствует ориентации поверхностных эпитопов экспрессируется исключительно на клетках мышиной происхождения. Помимо хорошо налаженной метод опухолевой диссоциации, как представлено в данном исследовании, существует множество процедур с использованием различных видов ферментов. Сохранение клеточной поверхности эпитопов является предпосылкой для этого нового метода, но и для точного анализа популяций опухолевых клеток человека. Поэтому крайне важно, чтобы пологие ферменты используются для переваривания ткани опухоли. Таким образом, истощение клеток мыши может использоваться только в сочетании с ферментными процедурами с пищеварением, которые, очевидно, не влияют на антигенные детерминанты, ориентированные во время процедуры обеднения мыши клеток. В случае возникновения сомнений это можно проверить только с помощью соответствующего производителя.

Этот метод также работает для человека циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Тем не менее, поскольку частоты клеток-мишеней, как правило, <0,1% удаление клеток мыши дополнительно требует красной лизис клеток крови и чистотой более чем на 50%, нельзя ожидать. В этом случае, истощение мыши клетка может быть использован в качестве предварительного обогащения ЦОК с последующим обогащением с использованием позитивных маркеров (данные не показаны).

Удаление клеток мыши значительно улучшает культуру опухолевых клеток человека, избегая культуры зарастают фибробластов мыши. Кроме того, анализ ксенотрансплантатов опухолей человека с помощью следующего поколения последовательности значительно улучшены и стандартизированы. Как этот эффект наблюдался, хотя выбор целевой человек последовательность конкретных была проведена во время обогащения ExoME, влияние на весь геном и весь транскриптома последовательности, как ожидается, будет еще более заметным.

Кроме того, данный способ облегчает ACCURAТе молекулярные исследования опухолевых субпопуляций в пределах ксенотрансплантированных опухолей человека. Удаление клеток мыши из соответствующего образца на первой стадии , а затем сортировки опухолевых клеток человека в двух различных субпопуляций позволяет осуществлять прямое молекулярное сравнение опухоли субпопуляции интерес к человеческому насыпных опухолевых клеток 20. Дифференциальная экспрессия генов между опухолевых клеток подтипов может быть более надежно оценена, как она не зависит от перекрестной гибридизации мышиных полученных молекул.

Раскрытие информации

Давид Агорку, Стефан Томюк, Штефан Вильд, Сильвия Рюберг, Лиза Затриб, Андреас Бозио и Олаф Хардт являются или были сотрудниками компании Miltenyi Biotec GmbH, Германия. Керстин Клингнер и Юлия Шюлер являются сотрудниками компании Oncotest GmbH, Германия.

Благодарности

Мы благодарны Янине Кул, Надин Челиус, Петре Куссманн, Лене Виллноу и Дороти Ленхард за отличную техническую помощь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для диссоциации опухолей человекаMiltenyi Biotec130-095-929содержит ферменты H, R и A; инструкции по восстановлению см. в техническом описании
RPMI 1640BiowestL0501-500
gentleMACS C-TubesMiltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Ситечко MACS SmartStrainer (70 & микро; m)Miltenyi Biotec130-098-462
Чашка Петри 100 ммРазличный
скальпельРазличные
наборы для истощения клеток мышиMiltenyi Biotec130-104-694
PBSРазличноеиспользование 1x PBS для буфера
PEB EDTASigma-Aldrich3610используйте конечную концентрацию 2 мМ в буфере PEB
BSAMiltenyi Biotec130-091-376или использовать 5 мг/л BSA в буфере PEB
MACS LSколонки Miltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Фильтры PreSep (70 & микро; m)Miltenyi Biotec130-095-823
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753
CD326-FITC, человекMiltenyi Biotec130-080-301использование 1:40 для иммунофлуоресцентного окрашивания 
антитела против виментинаabcamab92547
коза - против мыши IgG-Alexa488Life TechnologiesA11029
козы - против кролика IgG-Alexa594Life TechnologiesA11012
DAPISigma-AldrichD9542разбавляют до конечной концентрации 0,1 &микро; г/мл в 0,1 М гидрокарбоната натрия 
Набор для окрашивания Inside Stain KitMiltenyi Biotec130-090-477InsideFix из этого набора может быть использован для этапа фиксации при иммунофлуоресцентном окрашивании.
FBSРазличные Triton
X-100 Sigma-Aldrich93418
FcR Блокирующий реагент, мышьMiltenyi Biotec130-092-575
ЖелатинSigma-AldrichG2500-100G
Nextera Rapid Capture Enrichment KitIlluminaFC-140-1000
MiSeq Reagent Kit v3IlluminaMS-102-3001

Ссылки

  1. Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
  2. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  5. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494(2013).
  6. Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
  8. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  9. Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
  10. Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
  11. Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
  12. Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
  13. Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
  14. Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
  15. Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146(2015).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Клетки опухоли человекаделеция клеток мышимагнитная сортировка клетокдиссоциация тканейизоляция клетокпроточная цитометриянастольный диссоциатор тканейбуфер PB
Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.