В описанном здесь протоколе подробно описывается индукция гемогенной программы в эмбриональных фибробластах мышей посредством сверхэкспрессии минимального набора транскрипционных факторов. Эта технология может быть применена в организме человека, чтобы обеспечить платформы для будущего изучения кроветворения, гематологических заболеваний и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом протоколе подробно описывается индукция гемогенной программы в эмбриональных фибробластах мышей (MEF) посредством сверхэкспрессии транскрипционных факторов (TFs). Сначала мы разработали репортерный экран с использованием MEF от человеческих CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) двойных трансгенных мышей. CD34+ клетки этих мышей маркируют H2B гистоны с помощью GFP и прекращают мечение при добавлении доксициклина (DOX). MEFS трансдуцировали кандидатами TF, а затем наблюдали за появлением GFP+ клеток, что указывало бы на приобретение судьбы гемопоэтических или эндотелиальных клеток. Начав с 18 кандидатов в ТФ и проведя процесс комбинаторного исключения, мы получили минимальный набор факторов, которые индуцировали бы наибольший процент клеток GFP+. Мы обнаружили, что Gata2, Gfi1b и cFos необходимы, и добавление Etv6 обеспечивает оптимальную индукцию. Серия анализов экспрессии генов, проведенных в разные моменты времени в процессе перепрограммирования, показала, что эти клетки, по-видимому, проходят через клетку-предшественник, которая претерпела эндотелиально-гемопоэтический переход (EHT). Таким образом, этот процесс перепрограммирования имитирует развитие кроветворения «в чашке», позволяя изучать кроветворение in vitro и создавать платформу для идентификации механизмов, лежащих в основе этой спецификации. Эта методология также обеспечивает основу для переноса этой работы на организм человека в надежде на создание альтернативного источника специфических для пациента гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для ряда применений в лечении и изучении гематологических заболеваний.
Введение
Гемопоэз представляет собой сложный процесс развития , при котором гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) бутона от гемогенного эндотелий присутствовать в различных эмбриональных сайтах гемопоэтических такие как аорта-гонад-мезонефрос и плацента 1,2. Неспособность культуры ГСК в пробирке предотвращает глубокий анализ этого процесса, а также клиническое применение этих исследований. Чтобы обойти это ограничение, предыдущие исследования попытались вывести ГСК заново либо с помощью дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) 3, или индуцированной пластичности в соматических клетках и направленной дифференцировки с помощью....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Заявление по этике: клеточные линии мышей получены следуя инструкциям по уходу за животными в Икан школы медицины на горе Синай, и должно быть сделано в соответствии с любым принимающим учреждением.
1. мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) Выделение мышей C57BL / 6
- Настройка приурочен спаривание 13. После того, как вагинальная пробка визуализируется, рассмотреть этот день 0,5.
- Отделить засоряющихся самок на дату подключи и проверить их на День 10-11, чтобы подтвердить беременность.
- В день 13.5-14.5 эвтаназии беременных самок мышей с помощью CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Кровотворение представляет собой сложный процесс развития, который начинается в различных эмбриональных сайтах. Гемогенного эндотелиальные клетки находятся в этих местах и дают начало ГСК через ячейку почкованием 23. Этот процесс в настоящее время не могут быть воспроизведены путем размещения ГСК или гемопоэтических предшественников в культуре, что вызывает необходимость методологии каким - то образом получить эти клетки в пробирке, либо путем расширения HSPC ех е.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Создание HSPCs De Novo из легко достижимых соматических клеток предлагает уникальный метод для изучения кроветворения в пробирке, и возможность потенциально применять эту технологию для человеческой системы. Этот перевод будет генерировать новый инструмент для изучения болезни гематологического человека в блюдо, а также обеспечить по тестированию на наркотики платформы и ген возможности таргетинга для лечения многочисленных нарушений с новой терапии или трансплантации HSC. В этой области, недавние иссл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом NHLBI для K.M. и I.R.L. (1RO1HL119404). Карлос-Филипе Перейра был удостоен стипендии Revson Senior Biomedical Fellowship. Мы выражаем благодарность Маунт-Синай hESC/iPSC Shared Resource Facility и С. Д'Суза за помощь в подготовке материалов и протоколов. Мы также благодарим Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics и Mouse Facilities.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0,45 μ M фильтры | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra центробежные фильтры | Millipore | UFC900324 | |
| Пенициллин/Стрептомицин | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Иглы 18 г | BD | 305195 | |
| 20 г иглы | BD | 305175 | |
| 25 г иглы | BD | 305125 | |
| коллагеназа типа I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| СКФ | Р и D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| Ил-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| Ил-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Доксициклин | Sigma | D9891-1G | |
| Полибрен (гексадиметрина бромид) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μ Мембранные фильтры M | Millipore | DVPP14250 | |
| Метилцеллюлоза Фильтрующие материалы | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Гидрокортизон | Стволовые клетки Технологии | 07904 | |
| C57BL/6 мышей | Лаборатория Джексона | 000664 | |
| Желатин | Sigma | G-1890 100 г | |
| pFUW-tetO | Addgene | Плазмида #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene Plasmid #12260 | ||
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 мм x 10 мм культура посуда | Thermo Scientific | 171099 |
Ссылки
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
