Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

6.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54372

⸱

16 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

В описанном здесь протоколе подробно описывается индукция гемогенной программы в эмбриональных фибробластах мышей посредством сверхэкспрессии минимального набора транскрипционных факторов. Эта технология может быть применена в организме человека, чтобы обеспечить платформы для будущего изучения кроветворения, гематологических заболеваний и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Аннотация

В этом протоколе подробно описывается индукция гемогенной программы в эмбриональных фибробластах мышей (MEF) посредством сверхэкспрессии транскрипционных факторов (TFs). Сначала мы разработали репортерный экран с использованием MEF от человеческих CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) двойных трансгенных мышей. CD34+ клетки этих мышей маркируют H2B гистоны с помощью GFP и прекращают мечение при добавлении доксициклина (DOX). MEFS трансдуцировали кандидатами TF, а затем наблюдали за появлением GFP+ клеток, что указывало бы на приобретение судьбы гемопоэтических или эндотелиальных клеток. Начав с 18 кандидатов в ТФ и проведя процесс комбинаторного исключения, мы получили минимальный набор факторов, которые индуцировали бы наибольший процент клеток GFP+. Мы обнаружили, что Gata2, Gfi1b и cFos необходимы, и добавление Etv6 обеспечивает оптимальную индукцию. Серия анализов экспрессии генов, проведенных в разные моменты времени в процессе перепрограммирования, показала, что эти клетки, по-видимому, проходят через клетку-предшественник, которая претерпела эндотелиально-гемопоэтический переход (EHT). Таким образом, этот процесс перепрограммирования имитирует развитие кроветворения «в чашке», позволяя изучать кроветворение in vitro и создавать платформу для идентификации механизмов, лежащих в основе этой спецификации. Эта методология также обеспечивает основу для переноса этой работы на организм человека в надежде на создание альтернативного источника специфических для пациента гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для ряда применений в лечении и изучении гематологических заболеваний.

Введение

Гемопоэз представляет собой сложный процесс развития , при котором гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) бутона от гемогенного эндотелий присутствовать в различных эмбриональных сайтах гемопоэтических такие как аорта-гонад-мезонефрос и плацента 1,2. Неспособность культуры ГСК в пробирке предотвращает глубокий анализ этого процесса, а также клиническое применение этих исследований. Чтобы обойти это ограничение, предыдущие исследования попытались вывести ГСК заново либо с помощью дифференциации плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) 3, или индуцированной пластичности в соматических клетках и направленной дифференцировки с помощью перепрограммирования СМИ 4,5. Эти исследования, однако, не приводят к клинически безопасных engraftable клеток или позволяют изучение окончательного кроветворения развития "в чашке".

Роман работа устанавливается Яманака и его коллеги, чтобы генерировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из соматической фибробласты рrovides рамки для фактора транскрипции (TF) стратегий избыточной экспрессии на основе клеток в судьбе перепрограммирования 6,7. Эта работа побудила исследователей в различных областях, чтобы генерировать типы клеток выбора через TF перепрограммирования легкодоступных соматических клеток. Цель стратегии перепрограммирования , описанного здесь , чтобы вызвать гемогенного процесс от мыши соматических клеток с использованием TF на основе перепрограммирования подхода с целью воплощения этих результатов в человеческой системе перепрограммировать фибробласты конкретного пациента для того , чтобы изучить человека кроветворение в пробирке и генерировать пациента конкретных продуктов крови для моделирования заболевания, тестирования на наркотики и трансплантации стволовых клеток.

Первым шагом для обеспечения надлежащего перепрограммирование в этой системе мыши было разработать линию репортер, который служил в качестве чтения-аута для экспрессии CD34, известным маркером в эндотелиальных клетках-предшественниках и ГСК. Для этого, трансгенные линии мыши huCD34-TTA и Teto-H2BGFP были использованы для гenerate двойной трансгенной мыши эмбриональные фибробласты (МЭФ), теперь обозначается 34 / H2BGFP, что флуоресцировать зеленым при активации промотора CD34 8. Это позволило скрининг различных ТФ, как известно, требуется в различных точках во время кроветворной спецификации и развития. Начиная с 18-ТФ в PMX retrovial векторов (определяется путем добычи и профилирования GFP этикетки удерживающих ГСК из ранее литературы описаны 34 мышей / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs были трансдуцированных со всеми факторами и культивируют на AFT024 HSC поддерживающих стромальных клеток. После обнаружения 34 активации / H2BGFP, ТФ были впоследствии удалены из перепрограммирования коктейля, пока не был идентифицирован оптимальный набор ТФ для активации репортера. После этого начального экрана, факторы, были переведены в DOX индуцибельной векторной системы pFUW, чтобы позволить управляемое экспрессию ТФ. Так как эти две управляемые системы DOX несовместимы (34 / H2BGFP клетки и индуцируемые векторы pFUW), MEFs изтребовалось 6 мышей дикого типа C57BL /. Кроме того, необходимо обеспечить соответствующую микросреду, чтобы позволить гемопоэз, чтобы продолжить и создать мультилинейной клоногенные клетки-предшественники.

Современные исследования пытаются перепрограммировать соматические клетки в гемопоэтических стволовых клеток и клеток - предшественников (HSPCs) встречались различные уровни успеха 9-11. На сегодняшний день, поколение как мыши и перевиваемых HSPCs человека с длительным сроком и самообновлению заселив способность не была достигнута с использованием того же набора ТФ. В этом протоколе, мы приводим подробное описание ранее установленной стратегии воспроизводимо индуцируют гемопоэз в MEFs. Показано , что введение минимального набора ТФ (Gata2, Gfi1b, CFO , и Etv6) способен подстрекательстве комплексную программу развития в пробирке , которая обеспечивает платформу , с помощью которого кроветворения развития и клиническое применение гемопоэтических перепрограммирования может быть дополнительно изучена 12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике: клеточные линии мышей получены следуя инструкциям по уходу за животными в Икан школы медицины на горе Синай, и должно быть сделано в соответствии с любым принимающим учреждением.

1. мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) Выделение мышей C57BL / 6

  1. Настройка приурочен спаривание 13. После того, как вагинальная пробка визуализируется, рассмотреть этот день 0,5.
  2. Отделить засоряющихся самок на дату подключи и проверить их на День 10-11, чтобы подтвердить беременность.
  3. В день 13.5-14.5 эвтаназии беременных самок мышей с помощью CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
  4. Замочите беременных женщин живота с 70% этанола, рассекают в брюшную полость с стерильными ножницами и щипцами вниз по средней линии, и хирургическим путем удалить маточные рога , содержащие эмбрионов 14. Выньте эмбрионы осторожно, пока отрезав оставшиеся брюшной ткани.
    Примечание: Восстановление около 8 эмбрионов с 4 на каждой стороне.
  5. Поместите матки часorns, содержащие эмбрионы в 10 см чашку с 5-10 мл стерильной охлажденным фосфатным буферным раствором (PBS).
  6. Стерильными ножницами и щипцами, делают надрез вдоль рогов матки, чтобы изолировать мешочки, несущие эмбрионов. Передача мешочки на новую 10 см чашку с 5-10 мл стерильной охлажденной PBS и место на льду.
  7. Поместите несколько из мешочков в новую 10 см чашку с 5-10 мл стерильной охлажденной PBS. Используя стерильные ножницы и пинцет аккуратно разрезать мешочки (без резки слишком глубоко), чтобы избежать прокалывания эмбрионов.
  8. Отдельные эмбрионы из плаценты путем перерезания пуповины.
  9. Перенос эмбрионов на новую 10 см чашку, содержащую 5-10 мл охлажденного PBS и оставить на льду во время завершения оставшихся вскрытий.
  10. Обезглавьте эмбрионов с использованием стерильного пинцета. Тщательно вырубить средней линии эмбриона, используя стерильные ножницы и пинцет, начиная с обезглавленной области, чтобы открыть живот. Позиция щипцов под тон висцеральные органы (включая сердце, печень, и легкие) и скрести их 15.
  11. Обрежьте оставшиеся ткани на мелкие кусочки с помощью ножниц и щипцов и передачи в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл трипсина.
  12. Пипеткой вверх и вниз с 10 мл пипеткой 20-30 раз перемешать и диссоциируют ткани.
  13. Выдержите ткани и трипсин смесь в ванну воды С 37 ° С в течение 45 мин, закрученной время от времени.
  14. Пипеткой вверх и вниз с 10 мл пипеткой в ​​течение приблизительно 5 минут, чтобы перемешать содержимое.
  15. Добавить трипсином клетки в 3 раза объем стандартной Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 10 мкг / мл пенициллина / стрептомицина (P / S), и 1 мМ L-глутамина (L-GLUT) в 10 см чашках (~ 10 мл) и культуры при 37 ° С до сливающихся (около 2-4 дней). Культура около 1-2 эмбрионов на 10 см чашку.
    Примечание: Замораживание клетки один раз пластин вырожденная. Замороженные клетки могут быть разморожены и пассировать еще 2 раза. Клетки могут быть альтернативноразделить 2 раза до замораживания, а затем еще раз после того, как оттаивают.

2. Вирусный Производство

  1. Expand 293Т в 10 см пластинах с 10 мл DMEM с 10% FBS, 1% P / S, и 1% L-GLUT для трансфекции.
    1. Trypsinize 293T клетки с 2 мл трипсина, инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, собирают клетки в 15 мл пробирки, спиновые при 300 мкг, и пластины соответствующим образом (10 мл на 10 см чашку).
  2. 24 ч до трансфекции, разделить сливающийся 10 см Столешница из клеток 293Т, 1: 6 и семян в 10 см покрытые желатином (0,1% желатина в PBS) пластин.
    Примечание: 4 пластины на вирус будет требоваться.
    1. Для покрытия пластин в желатин, добавить по меньшей мере, 2 мл 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть дно 10 см пластинах. Инкубируют при 37 ° С в течение по меньшей мере 20 мин. Аспирируйте от желатина перед добавлением клеток к пластинам.
  3. В 15 мл пробирку, добавляют 84 мкг плазмиды (например, Gata2, Gfi1b, финансовые директора, или Etv6 (субклонировали в Vect pFUW-Tetoили 16) или FUW-M2rtTA 17), 84 мкг psPAX2, и 42 мкг pMD2.G. Добавляют воду (H 2 O) , чтобы компенсировать объем до 2 мл. Подготовьте трубку для каждого фактора (например. Gata2, Gfi1b, финансовые директора, Etv6 и FUW-M2rtTA).
  4. Добавить 250 мкл 2 М CaCl 2 в каждую пробирку , содержащую смесь в 2 мл , состоящую из 84 мкг выбранного гена (Gata2, Gfi1b, финансовые директора, Etv6 или FUW-M2rtTA) + 84 мкг psPAX2 + 42 мкг pMD2.G + Н 2 O ,
  5. С помощью пипетки Пастера , вставленный в пипетки помощи, выпуск пузырьков в 2,25 мл ДНК + H 2 O + 2 смеси М CaCl 2. Как производятся пузырьки, поместите кончик P1000 против стеклянной пипеткой и медленно выталкивать 2 мл 100 мМ N, N-бис (2-гидроксиэтил) -2-аминоэтан сульфокислоты (BES) физиологического раствора вниз Пастера пипеткой 1 мл за один раз.
  6. Инкубируйте все пробирки в культуре шкафу при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
    Примечание: Смесь 4,25 мл ( в настоящее время ДНК + Н 2 О + 2M CaCl 2 + BES физиологический раствор) будет выглядеть слегка мутным.
  7. По мере того как смесь высиживает, аспирация СМИ выключения 293T пластин и добавьте 10 мл DMEM + 10% FBS + 1 мМ L-глутамина + 25 нм хлорохин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данный носитель не содержит P / S.
  8. После того, как по меньшей мере 15 мин инкубации (или до смены носителей на клетках 293Т), добавляйте 4,25 мл ДНК + H 2 O + 2 М CaCl 2 + BES солевой смеси по каплям к 293Т, распределяя равномерно по 4 клеточных пластин в трубке (т.е. немногим более 1 мл смеси на чашку).
  9. Инкубируйте пластин в течение ночи (O / N) при 37 ° С.
  10. 24 часов после инкубации, заменить средства массовой информации на всех пластинах с 4 мл стандартной DMEM (см шаг 1.15).
  11. Держите клетки в инкубаторе C 32 ° с этого момента.
  12. 24 ч после шага 2.10, сбор средств массовой информации в отдельные 50 мл пробирки. Заменить собранные средства массовой информации из каждой пластины с 4 мл стандартной DMEM.
    Примечание: 4 пластины на первоначальные результаты трубки смеси в 16 мл собранных средств массовой информации.
    1. осле 12 ч инкубации, собирают средства массовой информации снова в те же 50 мл пробирки и заменить еще 4 мл стандартной DMEM.
    2. После 12 ч инкубации, собирают средства массовой информации и добавить в те же 50 мл пробирки.
      Примечание: каждая труба должна теперь содержать около 48 мл среды, содержащей вирус.
  13. Для того, чтобы сосредоточить собранный вирус, первый фильтр собранных средств массовой информации через 0,45 мкм с низким уровнем связывания с белками фильтров.
  14. Налейте отфильтрованные носители, содержащие вирус в концентрации вируса центрифужные пробирки (около 16 мл за один раз).
  15. Спин при 4000 х г при температуре 4 ° С в течение 25 мин и удалить проточные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем концентрированных сред и вирус будет виден в фильтре.
  16. Добавить еще 16 мл фильтрованной вируса средах, содержащих в концентрированном объеме медиа + вируса, оставшегося в фильтре и взболтайте трубку.
  17. Спин трубка снова при 4000 х г при 4 ° С в течение 25 мин и Выбросить проскок.
  18. Добавить остальные фильтруютсбор концентрированного медиа + объема вируса остается в фильтре и взболтайте трубку.
  19. Спин еще раз при 4000 х г при температуре 4 ° С в течение 10-20 мин (в зависимости от объема в фильтре) и гарантировать, что остаточный объем концентрированного медиа + вируса, оставшегося в фильтре составляет около 1 мл. Если больше 1 мл концентрированной медиа + вирус остается в фильтре, спина снова при 4000 мкг в течение 1 мин и повторяют до 1 мл не остается в фильтре.
  20. Аликвоты по 200 мкл концентрированного вируса в 1,5 мл пробирки и замораживают при температуре -80 ° С или использовать немедленно.

3. MEF Перепрограммирование

  1. Предварительное покрытие 6 а-планшеты с 0,5 мл 0,1% желатина в PBS на лунку, гарантируя, что желатин покрывает всю площадь колодца. Место в инкубаторе при 37 ° C и инкубировать в течение по крайней мере 20 мин. После инкубации удалить пластины и аспирация желатин.
  2. Пластинчатые MEFs со стандартной DMEM при плотности 25000 клеток на лунку (150000 клетокна 6-луночный планшет) на желатинизированный 6-луночного планшета (ов) со стадии 3.1, и дают отстояться O / N в 37 ° С инкубатор.
  3. Приготовьте коктейль вируса 100 мкл путем смешивания 50 мкл M2rtTA, а остальные 50 мкл смесь Gata2, Gfi1b, CFOs и Etv6 (12,5 мкл каждый).
  4. Аспирируйте средств массовой информации из MEFs и добавляют 2 мл стандартного DMEM с 8 мкг / мл бромистого hexadimethrine.
  5. Преобразовывают каждую лунку MEF пластин с 15 мкл вируса коктейле и инкубировать O / N при 37 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это день 0 процесса перепрограммирования.
  6. На 1-й день, после 16-20 ч инкубации, заменить носитель с 2 мл свежей стандартной DMEM, дополненной 1 мкг / мл DOX на лунку.
  7. Подготовьте гемопоэтических культуральной среды , дополненной гидрокортизона (10 -6 М), 100 нг / мл фактора стволовых клеток (SCF), 100 нг / мл FMS-связанных тирозинкиназы 3 лиганда (Flt3L), 20 нг / мл интерлейкина-3 (IL - 3), 20 нг / мл интерлейкина-6 (ИЛ-6), и 1 мкг / мл DOX.
  8. На 4 день aspiratе средства массовой информации из каждой лунки и мыть клетки с 1 мл PBS на лунку.
  9. Отберите PBS, диссоциируют клеток с использованием 1 мл 0,05% трипсина на лунку и собирают клетки.
  10. Граф клеток с помощью гемоцитометра, вращаются со скоростью 300 мкг в течение 5 мин, вновь суспендируют в 12 мл гемопоэтических сред, описанных в пункте 3.7 и пластины 60000 клеток на 6-луночный планшет на 0,1% желатином покрытием пластин (2 мл на лунку, 10000 клеток на лунку ).
  11. Заменить СМИ со свежими, дополненной кроветворной культуральной среды через каждые 6 дней в течение всего срока культуры (от 35 до 36 дней).
  12. Анализировать либо промежуточные клетки или возникающие кроветворные клетки, как с помощью иммуно-окрашивания 12, анализа FACS 8,12, QRT-PCR 12 и мРНК последовательности 12 , чтобы подтвердить приобретение гемогенного эндотелиальной или HSC-подобных маркеров и экспрессии генов.

4. Блок формирования (CFU) Анализы плацентарной агрегация и колонии в метилцеллюлозы

  1. Рассеките плацент от беременных C57BL / 6 мышей , как описано выше 18 на E12.5 и держать ткани на льду.
  2. Для того, чтобы начать плацента диссоциации 19, моют плацентарной ткани в 2-5 мл 0,2% коллагеназы типа I в PBS с 20% FBS и механически диссоциируют с 18G иглой устанавливают в 5 мл шприца путем пересева плаценту и PBS через иглу , по крайней мере 3 раза.
  3. После механической диссоциации, держать клетками плаценты 2-5 мл раствора коллагеназы при 37 ° С в течение 1,5 ч.
  4. Прохождение клетки через 20-25 г хвои монтировали на 5 мл шприцев несколько раз, чтобы дополнительно механически диссоциируют плацентарных клеток.
  5. Фильтр одноклеточных суспензий через клеточные сита 70 мкм.
  6. Граф клеток с гемоцитометра и облучают при 2000 сГр для митотического инактивация 20.
  7. Добавьте 10 мл кроветворной культуральной среды, дополненной 100 нг / мл SCF, 100 нг / мл Flt3L, 20 нг / мл IL-3, 20 нг / мл IL-6, и 10 нг / мл тромбопоэтина (ТПО) до 10 см блюдо.
    Примечание: DOX не требуется на данном этапе.
  8. Поместите фильтр на 0,65 мкм непосредственно на гемопоэтических культуральной среды в чашке, что позволяет ему плавать, чтобы создать поверхности раздела жидкость-газ и установить чашку в сторону.
  9. Диссоциируют день 25 трансдуцированных MEFs (полученного на стадии 3.11), как описано в пунктах 3.8-3.10 и смешать 33,000 из преобразованных MEFs с 167,000 клетками плацентарных агрегатов из шага 4.6 (соотношение 1: 6).
  10. Чтобы создать агрегат 18,21, первый спин вниз MEF и плацентарный смесь клеток со стадии 4.9 , в течение 5 мин при 300 х г. Аспирата СМИ и ресуспендирования осажденные клетки в 30-50 мкл стандартной среды DMEM с использованием P200 пипетка, рисование одноклеточной суспензии клеток в 200 мкл nonbevelled кончика пипетки.
  11. Закупоривать кончик пипетки с парафиновой пленки. Поместите заблокированного наконечник в центрифужную пробирку объемом 15 мл и спином вниз в течение 5 мин при 300 х г Таким образом, гранулы формы на охватываемый конец наконечника.
  12. Удалите наконечник из 15 мл трубки тщательно и местонаконечник на конце P200 пипеткой. Выбросьте парафиновую пленку и выдавливать осадок клеток на плавающий фильтр с шага 4.8.
    Примечание: Тарелка не более 3 агрегатов на фильтре.
  13. Культура агрегаты на плавающих фильтров 0,65 мкм в течение 4-5 дней в 37 ° C с 5% CO 2.
  14. Сбор агрегатов (не более 3 на один фильтр) с клеточным скребком, объединить их и переваривают с 0,2% коллагеназы, следуя тому же протоколу, как это сделано с целыми плацентами диссоциировать клетки (шаги 4.2-4.5).
  15. После диссоциации, мыть агрегаты с 2-5 мл PBS с добавлением 5% FBS и спином вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
  16. Ресуспендируют агрегатов в 500 мкл DMEM без FBS, P / S или L-GLUT. Возьмите этот 500 мкл ресуспендирования и добавить его к 3 мл 1% метилцеллюлозы среде с добавлением 10 нг / мл TPO, тщательно избегая образования пузырьков. Пластинчатые равные объемы этой смеси в 3 35 х 10 мм необработанной блюда культуры дляКОЕ анализах 12.
  17. В качестве контроля культуры облучали плацентарные агрегаты без перемешивания в перепрограммирован MEFs 4-5 дней и место в КОЕ анализах, как описано выше в пунктах 4.7-4.16.
    Примечание: Эти агрегаты сами по себе не образуют колоний.
  18. Граф гемопоэтические колонии вручную под микроскопом через 10-14 дней культивирования при 37 ° С с 5% CO 2.
  19. Cytospin 22 отобранных колоний , чтобы показать морфологический фенотипа отдельных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Кровотворение представляет собой сложный процесс развития, который начинается в различных эмбриональных сайтах. Гемогенного эндотелиальные клетки находятся в этих местах и дают начало ГСК через ячейку почкованием 23. Этот процесс в настоящее время не могут быть воспроизведены путем размещения ГСК или гемопоэтических предшественников в культуре, что вызывает необходимость методологии каким - то образом получить эти клетки в пробирке, либо путем расширения HSPC ех е...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Создание HSPCs De Novo из легко достижимых соматических клеток предлагает уникальный метод для изучения кроветворения в пробирке, и возможность потенциально применять эту технологию для человеческой системы. Этот перевод будет генерировать новый инструмент для изучения болезни гематологического человека в блюдо, а также обеспечить по тестированию на наркотики платформы и ген возможности таргетинга для лечения многочисленных нарушений с новой терапии или трансплантации HSC. В этой области, недавние иссл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NHLBI для K.M. и I.R.L. (1RO1HL119404). Карлос-Филипе Перейра был удостоен стипендии Revson Senior Biomedical Fellowship. Мы выражаем благодарность Маунт-Синай hESC/iPSC Shared Resource Facility и С. Д'Суза за помощь в подготовке материалов и протоколов. Мы также благодарим Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics и Mouse Facilities.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMInvitrogen11965-092
0,45 μ M фильтрыCorning430625
Amicon Ultra центробежные фильтрыMilliporeUFC900324
Пенициллин/СтрептомицинInvitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
FBSGemini's Benchmark100-106
PBSLife Technologies14190-144
Иглы 18 гBD305195
20 г иглыBD305175
25 г иглыBD305125
коллагеназа типа ISigmaC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
Myelocult mediaStem Cell TechnologiesM5300
СКФР и D Systems455-MC
Flt3LR & D Systems427-FL
Ил-3R & D Systems403-ML
Ил-6R & D Systems406-ML
TPOR & D Systems488-TO
ДоксициклинSigmaD9891-1G
Полибрен (гексадиметрина бромид)SigmaAL-118
Durapore 0.65 μ Мембранные фильтры MMilliporeDVPP14250
Метилцеллюлоза Фильтрующие материалыStem Cell TechnologiesMethocult M3434
ГидрокортизонСтволовые клетки Технологии07904
C57BL/6 мышейЛаборатория Джексона000664
ЖелатинSigmaG-1890 100 г
pFUW-tetOAddgeneПлазмида #20321
Gata2OrigeneMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos AddgenePlasmid #19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2Addgene Plasmid #12260
pMD2.GAddgenePlasmid #12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAAddgenePlasmid #20342
35 мм x 10 мм культура посудаThermo Scientific171099

Ссылки

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Gata2 Gfi1b cFos Etv6CD34 tTA TetO H2BGFPCFU
Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.