Методическая статья

Выделение липопротеидов высокой плотности для Некодирующих малых РНК квантификации

DOI:

10.3791/54488

⸱

28 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает выделение и количественное определение малых РНК липопротеинов высокой плотности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разнообразие малых некодирующих РНК (рРНК) быстро расширяется и их роли в биологических процессах, в том числе регуляции генов, появляются. Самое интересное, что sRNAs также находятся вне клеток и стабильно присутствуют во всех биологических жидкостях. Таким образом, внеклеточные sRNAs представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний, и они, вероятно, участвуют в клеточной сигнализации и межклеточных сетей связи. Для того, чтобы оценить их потенциал в качестве биомаркеров, sRNAs может быть определена количественно в плазме крови, мочи и других жидкостей. Тем не менее, чтобы полностью понять влияние внеклеточных sRNAs как эндокринные сигналов, важно , чтобы определить , какие носители транспортировки и защиты их в биологических жидкостях (например, в плазме), что клетки и ткани , способствуют внеклеточные пулы Срна, и клетки и ткани , способные принятия и использования внеклеточный Срна. Для достижения этих целей, важно, чтобы изолировать высокочистых популяции внеклеточного носителейдля профилирования Срна и количественной оценки. Ранее мы показали, что липопротеиды, в частности, липопротеины высокой плотности (HDL), транспорт (функциональные микроРНК микроРНК) между клетками и ЛВП-микроРНК существенно изменяются при болезни. Здесь мы подробно новый протокол, который использует тандемный HDL изоляции с градиенте плотности ультрацентрифугирования (DGUC) и быстрого белка-жидкостной хроматографии (FPLC) для получения высокочистого HDL для нисходящего профилирования и количественной оценки всех sRNAs, в том числе микроРНК, используя как высокий -throughput секвенирования и ПЦР в реальном времени подходы. Этот протокол будет ценным ресурсом для исследования sRNAs на HDL.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточного-некодирующие малые РНК (sRNAs) представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний и потенциальных терапевтических мишеней и , вероятно , облегчит клетки к клетке связи 1. Наиболее широко изученным типом рРНК являются микроРНК (миРНК) , которые приблизительно 22 NTS в длину и обрабатываются из более длинных форм - предшественников и первичных транскриптов 2. микроРНК были продемонстрированы посттранскрипционно регулируют экспрессию генов путем подавления белка трансляции и индукции деградацию мРНК 2. Тем не менее, микроРНК являются лишь одним из многих типов sRNAs; в качестве sRNAs могут быть расщеплены от родительских тРНК (тРНК производные sRNAs, TDR), малые ядерные РНК (рРНК-производных sRNAs, sndRNA), небольшие ядрышковых РНК (snoRNA-производных sRNAs, мяРНК), рибосомных РНК (рРНК происхождения sRNAs РДР ), Y РНК (yDR) и различных других РНК 1. Несколько примеров таких новых sRNAs Сообщалось, что функцию, аналогичную функции микроРНК; Однако биологические фуnctions многих из этих sRNAs еще предстоит определить, хотя роли в регуляции генов, вероятно , 3-6. Самое интересное, что микроРНК и другие sRNAs стабильно присутствуют в внеклеточной жидкости, в том числе слюны, плазмы, мочи и желчи. Внеклеточные sRNAs, вероятно, защищены от РНКазы через их ассоциации с внеклеточным везикул (EV), липопротеинов и / или внеклеточных рибонуклеопротеидных комплексов.

Ранее мы сообщали , что липопротеины, а именно липопротеины высокой плотности (ЛПВП), транспорт микроРНК в плазме 7. В этом исследовании, ЛВП были выделены с использованием последовательного метода градиента плотности ультрацентрифугирования (DGUC), быстро-жидкостной хроматографии протеинов (гель-хроматография на силикагеле, фильтрование, FPLC) и аффинной хроматографии (анти-аполипопротеина (апо-I) иммунопреципитация ) 7. Используя оба в режиме реального времени массивов на основе ПЦР с низкой плотностью и индивидуальных анализов микроРНК, уровни микроРНК были определены количественно на HDL изолированы от заживаюттвой и гиперхолестеринемией предметы 7. Используя этот подход, мы смогли в профиль микроРНК и количественно определенные микроРНК в высокочистых HDL препаратов. Начиная с 2011 года, мы определили, что, хотя аффинная хроматография повышает чистоту HDL, насыщенность антител значительно ограничивает выход, и может быть экономически запретительными. В настоящее время наш протокол рекомендует двухэтапный метод последовательного тандема DGUC с последующим FPLC, который также производит высококачественные образцы HDL для вниз потока выделения РНК и Срна количественной оценки. В связи с последними достижениями в области высокой пропускной последовательности sRNAs (sRNAseq), например, микроРНК, а также повышение уровня информированности других классов , не микроРНК Срна, sRNAseq текущее состояние-оф-искусства в микроРНК и Срна профилирования. Таким образом, наш протокол рекомендует количественное микроРНК и другие sRNAs на образцах HDL с использованием sRNAseq. Тем не менее, общая РНК, выделенной из HDL также могут быть использованы для определения индивидуальных микроРНК и других sRNAs или проверки достоверности результатов sRNAseq с помощью ПЦР в реальном времени Approaches. Здесь мы опишем подробно протокол для сбора, очистки, количественной оценки, анализа данных и проверки высокочистого HDL-sRNAs.

Основная цель данной работы заключается в демонстрации осуществимости и процесс Срна количественной оценки с высокой степенью чистоты HDL, выделенной из плазмы крови человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка HDL (~ 5,5 дней)

  1. Градиента плотности Ультрацентрифугирование (DGUC, ~ 5 дней)
    1. Добавьте 90 мкл 100x антиокислителей к 9 мл плазмы, выделенных из свежей венозной крови.
    2. Отрегулируйте плотность плазмы с КВг от 1,006 г / мл до 1,025 г / мл путем добавления 0,251 г KBr до 9 мл плазмы со стадии (1.1.1 0,0278 г / мл плазмы KBr). Rock плазму, пока вся соль не растворяется при комнатной температуре и передать Ультрацентрифуга трубы и гарантировать, что все пузырьки поднимаются к вершине.
    3. Согните кончик 18-G иглы до 90 ° 1 см от кончика, скос стороной вверх. С помощью шприца и 18 иглы калибра, осторожно поместите 3 мл наложения раствора N 1 по плазме (таблица 1).
      Примечание: Изогнутая игла обеспечивает все VLDL / IDL, LDL и HDL удаляются без смешивания с наложением.
    4. Удалить большинство пузырьков в верхней части, оставляя 2 - 3 мм пространство от мениска до верхней части трубки и сторожныLLY поместить пробирки в SW-40Ti ведра.
    5. Взвесить каждый ведро (с крышками) на баланс, а именно баланс с обратным ковшом (ведро + крышки): # 1 # 4, # 2 до # 5 и # 3 # 6.
      Примечание: Эти ведра должны быть сбалансированы и согласованы во все времена.
    6. Поместите ротор в ультрацентрифуге (Перечень материалов). Центрифуга на 274,400 мкг в течение 24 ч при 4 ° С с # 4 промежуточного тормоза.
    7. Осторожно удалите ведра из ротора и трубки из ведра.
    8. Тщательно удалите 2 мл из верхнего слоя наложения с помощью шприца и изогнутую иглу. Это будет доля VLDL / IDL, который можно хранить при температуре 4 ° С или -80 ° С.
    9. После удаления фракции ЛПОНП / IDL, собирают оставшиеся 7 мл образца (плазмы) и поместить его в 15 мл коническую трубку. Доведите объем образца до 9 мл с наложенной раствора N 2 (таблица 1).
    10. Отрегулируйте плотность образца от 1,025 г / мл до 1,080 г / мл с использованием KBrприблизительно 0,746 г KBr в образце 9 мл или 0.0828 г / мл KBr образца. Осторожно покачайте образец, пока весь KBr не растворится (примерно 20 мин) и передать Ультрацентрифуга трубку обеспечивая при этом пузырьки поднимаются к вершине.
    11. С помощью шприца и иглы, осторожно поместить 3 мл наложения раствора N 3 по образцу (таблица 1). Оставьте 2 - 3 мм Зазор от мениска до верхней части трубы.
    12. Смещать большинство оставшихся пузырьков в верхней части трубы и осторожно поместить заполненные ультрацентрифуге трубки в SW-40Ti ведра.
    13. Взвесить каждый ведро (с крышками) на баланс, а именно баланс с обратным ковшом + крышкой, как и в 1.1.5.
    14. Поместите ротор в ультрацентрифуге (см список материалов). Центрифуга на 274,400 мкг в течение 24 ч при 4 ° С с # 4 промежуточного тормоза.
    15. Осторожно удалите ведра из ротора и трубки из ведра.
    16. Тщательно удалите 2 мл из верхнего слоя наложения с помощью шприца и бытьнт игла. Это будет ЛНП фракцию, которую можно хранить при температуре 4 ° С или -80 ° С.
    17. После удаления фракции LDL, собирают оставшиеся приблизительные 7 мл образца (плазмы) и поместите его в новый 15 мл коническую трубку. Доведите объем образца (плазмы) до 9 мл с 1,080 г / мл раствора N 4 (таблица 1).
    18. Отрегулируйте плотность образца от 1,080 г / мл до 1,30 г / мл с KBr с использованием 3,33 г KBr в 9 мл образца (плазмы) или 0,37 г KBr для каждого мл образца. Рок или слегка перемешивать образец, пока весь KBr (соль) не растворяется и передать Ультрацентрифуга трубку.
    19. С помощью шприца и иглы, осторожно поместить 3 мл наложения раствора N 5 по образцу (таблица 1).
    20. Смещать большинство оставшихся пузырьков в верхней части трубы, в результате чего 2- 3 мм Зазор от мениска до верхней части трубки и осторожно поместить заполненные ультрацентрифуге трубки в SW-40Ti ведра.
    21. Взвешивать каждое ведро (с колпачками), находящихся на балансе, а именно баланс с противоположным ковшом + крышкой, как и в 1.1.5.
    22. Поместите ротор в ультрацентрифуге (см список материалов). Центрифуга на 274,400 мкг в течение 48 ч при 4 ° С с # 4 тормозом.
    23. Осторожно удалите ведра из ротора и трубки из ведра.
    24. Осторожно удалите приблизительно 2 мл из верхнего слоя наложения с помощью шприца и изогнутую иглу. Это ЛВП фракция, которая может храниться при температуре 4 ° С или -80 ° С.
      Примечание: После DGUC HDL может быть диализовали для удаления высокой солевых растворов.
    25. Диализировать, поместите собранную HDL фракцию в запечатанном диализной рукава (10000 Мвт светотеневой) и диализ в течение ночи в 1 л 1x PBS. Изменение диализного буфера (1x PBS) 3 раза в течение 24 часов. Нежная возмущение PBS с магнитной мешалкой-бар улучшит диализ.
    26. Определить концентрацию белка в DGUC-HDL , используя метод BCA 8.
  2. Фаст-протеин Жидкий CHROmatography (FPLC) или вытеснительной хроматографии (~ 6 ч)
    1. Фильтр 1,2 мг DGUC-HDL (всего белка) в 500 мкл через мкм микро-центробежный фильтр 0,22 (см Перечень материалов), непосредственно перед инъекцией.
      Примечание: дополнительная фильтрация образца DGUC-ЛПВП через мкм микро-центробежный фильтр 0,45 перед фильтром 0,22 мкм может потребоваться для некоторых образцов.
    2. Соберите отфильтрованный образец DGUC-HDL, загрузите FPLC (наполнитель) шприцем, и гарантировать, что нет никаких пузырей в шприц перед инъекцией в FPLC.
    3. Установить расход FPLC до 0,3 мл / мин с пределом давления при 2,6 МПа. Равновесие столбцы с 0,2 объемами колонки (приблизительно 15 мл) буфера до начала пробы инъекции. Вводят образца с 3 мл буфера в (впрыск топлива) инструмента FPLC и начать бег. Сбор 1,5 мл фракции в общей сложности 72 фракций.

2. Высокая пропускная способность малых РНКСеквенирование (sRNAseq, ~ 9 дней)

  1. Выделение РНК (~ 1 день)
    1. Определение FPLC фракции, соответствующие DGUC-HDL путем определения общего уровня холестерина с помощью колориметрического набора в соответствии с инструкциями изготовителя. С помощью этого FPLC установка, ожидать, чтобы найти 6 - 7 FPLC фракции, содержащие DGUC-HDL.
    2. Собрать весь объем (примерно 8 -1 0 мл пула 1,45 мл фракции томов) из DGUC-HDL FPLC фракции и концентрата с использованием 10 кДа Мвт отрезные центробежные блоки фильтров при 4000 мкг в течение 1 ч при 4 ° С или до HDL концентрата составляет примерно 100 мкл.
    3. Собирают HDL концентрата и количественно HDL концентрацией белка с использованием метода BCA 8.
    4. Определить самую высокую концентрацию ЛПВП общего белка до 1 мг, которые могут быть аликвоты от каждой пробы в наборе. Например, выделения РНК из того же количества HDL общего белка для каждого образца.
    5. Выполните Выделение РНК с использованиеммодифицированный протокол (см перечень материалов).
      1. Добавить 10x объем фенола лизирующего реагента (см перечень материалов) образца и вихря в течение 1 мин.
      2. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
      3. Добавить хлороформ (20% объема фенольного реагента для лизиса, используемого на стадии 2.1.5.1) и энергично встряхивают в течение 15 с.
      4. Выдержите при комнатной температуре в течение 2 - 3 мин.
      5. Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г при 4 ° С в охлаждаемой центрифуге.
      6. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку, избегая интерфазе.
      7. Добавить объем 1.5x 100% этанола к водной фазе и вихря в течение 1 мин.
      8. хранить образцы в течение по крайней мере 1 ч или в течение ночи при -80 ° С.
      9. Продолжить с протоколом выделения РНК, используя предоставленный мини-колонки.
      10. Элюировать 30 мкл РНКазы H 2 O. Сначала добавьте 15 мкл H 2 O непосредственно к фритты, спина при низкой скорости (2000 XG) в течение 2 мин, изатем вращаться на высокой скорости (макс) в течение 1 мин. Повторите этот шаг с дополнительными 15 мкл H 2 O.
    6. Сразу приступить к Срна библиотеки поколения или хранить при температуре -80 ° C.
  2. Библиотека поколения (~ 6 ч)
    1. Подготовить библиотеки рРНК кДНК с использованием протокола набора рРНК библиотеки поколения, в соответствии с инструкциями изготовителя с одной модификацией для ПЦР-амплификации, как описано ниже.
      1. Подготовьте Mastermix ПЦР на льду , содержащем 0,5 мкл ДНКазы / РНКазы H 2 O, 15 мкл ПЦР Mix (PML) и 1 мкл РНК - праймера ПЦР (RP1) на образец ( в том числе дополнительные 10% для пипетирования ошибка).
      2. Добавить 16,5 мкл ПЦР смесь к каждому (кДНК) образца.
      3. Назначают номер индекса / штрих-кодов для каждого образца для мультиплексирования и добавляют 1 мкл ПЦР-праймер Index (к соответствующему номеру) к образцу.
      4. Произвести быстрое вращение с помощью микроцентрифуге.
        Примечание: Общий объем долженТеперь будет 30 мкл каждой пробы.
      5. Выполните Циклическую для ПЦР - амплификации , как указано в таблицах 2 и 3.
  3. Размер Выберите рРНК Библиотека удалить адаптер: Адаптеры (~ 1,5 ч)
    1. Выполните размер библиотеки отбор с использованием автоматического выбора размера ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя со следующими параметрами размера: Target: 156 пар оснований, Start: 135 пар оснований, Конец: 177 пар оснований, диапазон Флаг: Широкий.
  4. ДНК Clean Up (~ 0,5 ч)
    1. Очистка размер выбранных рРНК кДНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Элюции чистый и концентрировали Срна кДНК с 2 х 7 мкл ДНКазы / РНКазы H 2 O.
  5. Количественная и оценки рРНК кДНК - библиотеки Урожай и качество (~ 1 час)
    1. Оценка рРНК библиотеки кДНК качество и размер с помощью ДНК-чипа высокой чувствительности на Bioanalyzer (Перечень материалов) в соответствии с изготовлинструкции urer в.
    2. Количественно индивидуальные концентрации библиотеки рРНК кДНК с использованием анализа ДНК высокой чувствительности (список материалов), в соответствии с инструкциями изготовителя.
      Примечание: Рекомендуется, чтобы все образцы с различными индексами будут работать на той же полосе проточной ячейки, если это возможно. Если требуется более одной полосы движения, смешать тематические и контрольные образцы соответствующим образом.
  6. Высокая пропускная способность рРНК Секвенирование (~ 7 дней)
    1. Бассейн индивидуальный индексируется библиотеки Срна на основе эквимолярных концентрациях.
    2. Экран объединяют библиотеки Срна качества с использованием высокой чувствительности ДНК-чипа на Bioanalyzer и определяют концентрацию библиотеки ДНК, как и в 2.5.1 - 2.5.2.
    3. Выполните количественный ПЦР (КПЦР) содержания адаптера для обеспечения надлежащей глубины секвенирования с использованием библиотеки секвенирования набора КПЦР квантификации в соответствии с инструкциями изготовителя (перечень материалов).
    4. Выполнение последовательности с использованием одного чтения, 50 бр протокол достичь глубины примерно 20 - 25 м / считывает образец, в соответствии с инструкциями изготовителя.

3. Анализ данных (~ 1 день)

  1. Используйте bcl2fastq2, в соответствии с инструкциями руководство пользователя, к предварительной обработки сырого fastq файлов демультиплексированных образцов (список материалов).
  2. Используйте Cutadapt подрезать адаптеры 9 и удалить читает <16 нуклеотидов (NTS) в длину, как в руководство пользователя инструкции (список материалов).
  3. Удалить последовательности загрязнения, присутствующие в библиотеках Срна, включая последовательность стоп-раствора (STP: CCACGTTCCCGTGG) и адаптера переноситься на следующий период (CTACAGTCCGACGATC), используя функцию removeSequenceInFastq в рамках NGSPERL, согласно инструкции руководство пользователя (список материалов).
  4. Выполнение показателей контроля качества путем FastQC с помощью Центра количественных наук (CQS) инструменты, в соответствии с инструкциями руководство пользователя (список материалов).
  5. Создавать нерезервированный список "идентичный" читает (коллапс redundaнт читает) и номера записи копии с использованием CQSTools, согласно инструкции руководство пользователя (список материалов).
  6. Align читает генома человека с использованием Bowtie1.1.2 позволяя 1 рассогласования (опции: -a -m 100 --best --strata -v 1), согласно инструкции руководство пользователя (список материалов).
  7. Выполните выравнивание чтения, счета, и результат задачи реферирования с использованием NGSPERL, в соответствии с инструкциями руководства пользователя.
  8. Преобразование экспортированной счета таблицу в файл электронной таблицы.
  9. Нормализация читает определенного класса (например, микроРНК) , к общему числу операций чтения для данного класса (например, общее количество микроРНК читает) и сигналы отчета , как Per Считывает Mapped микроРНК (RPMM). (Например, RPMM = (MIR-X / Общее кол микроРНК читает) * 1000000).
  10. Входной нормализованы граф таблицы в качестве общей единой технологии цвета в программное обеспечение для низкого уровня и дифференциала высокого уровня анализа в соответствии с инструкциями руководство пользователя (список материалов).
    Примечание: В настоящее время не существует четко охарактеризованные генов домашнего хозяйства / СРНЧто касается HDL-рРНК. Шип-в управления может быть использован, но может быть проблематичным. Нормализация на ЛВП общий вход белка или объем рекомендуется. Самое главное, что рекомендуется для проверки результатов секвенирования одним из различных стратегий для количественного определения микроРНК и sRNAs с помощью ПЦР в реальном времени или количественный ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой ряд установленных методов , связанных между собой , чтобы позволить квантификации sRNAs на высокочистого HDL по высокой пропускной способностью для секвенирования или ПЦР в реальном времени (рисунок 1). Для демонстрации возможности и влияние этого протокола, HDL был очищен из плазмы крови человека с помощью тандема DGUC и FPLC метода. Собирают фракции, соответствующие FPLC HDL (путем распределения холестерина) концентрировались и тотальну...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предназначен для количественного определения микроРНК и других sRNAs высокой пропускной последовательности или ПЦР в реальном времени на высокочистого HDL. Как и при любом подходе, особые соображения следует уделять каждому шагу в процессе очистки HDL и РНК, а затем количественной оценки sRNAs. Этот протокол предназначен для проектов, начиная с ≥ 2 мл плазмы. Тем не менее, анализ РНК высокого качества может быть успешно завершена с HDL очищенной от всего лишь 80 мкл человека или мыши плазмы с помощью аффин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана наградами от Национального института здоровья, Национального института сердца, легких и крови для K.C.V. HL128996, HL113039 и HL116263. Эта работа также была поддержана наградами от Американской кардиологической ассоциации для K.C.V. CSA2066001, D.L.M. POST26630003 и R.M.A. POST25710170.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ультрацентрифуги Beckman CoulterA99839Optima XPN-80
РоторBeckman Coulter331362SW-41Ti
AKTA Pure FPLC SystemGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 Увеличение колонок In-lineGE Healthcare2899094410/300 gl
SynergyMxBioTek Instruments7191000
Настольная центрифугаThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
Центрифуга охлаждаемаяEppendorf226298675417R (приобретена через США Scientific)
Microfuge США Scientific2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 Биоанализатор AgilentG2938B
Высокочувствительный анализ ДНКAgilent5067-4626
Библиотека секвенирования Набор для количественного определения qPCRIlluminaSY-930-1010
Термоамплификатор ProFlexApplied Biosystems4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RobotEppendorf9600001115070
Ультрапрозрачные центрифужные пробиркиBeckman Coulter344059
бромид калияFisher ChemicalsP205-500
15 мл коническая пробиркаThermo Scientific339650
Микроцентробежные фильтры 0,45 &; mМиллипоровыеUFC30HV00
Микроцентробежные фильтры 0,22 &; mМиллипорыUFC30GV00
микроРНКасы Наборы для выделения общей РНКQiagen217004
Колорметрический набор для общего холестеринаCliniqa (Raichem)R80035
10 000 м.в. отсечной фильтр центрифугированияAmiconUFC801024приобретен через Millipore
ПЦР полосковые пробиркиAxygenPCR-0208-Cприобретен через Fisher
Набор для микроРНКRT LifeTechnologies 4366597Для 1000 реакций
ПЦР мастер-миксLife Technologies444004150 мл флакон
Pierce BCA ThermoScientific23225
Набор для очистки и концентратораZymoD4014
Диализная трубкаSpectrum Labs132118приобретен через Fisher
bcl2fastq2Illuminan/aSoftware
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aSoftware
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aSoftware
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aSoftware
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netн/дпрограммное обеспечение
GeneSpringGX13.1.1Agilentн/дпрограммное обеспечение
Ультрацентрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8(2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164(2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145(2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360(2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи