Методическая статья

Обнаружение рН-зависимой активности

DOI:

10.3791/54527

⸱

23 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование описывает биофизические, биохимические и молекулярные методы характеризуют шаперонную активность кишечной палочки HdeB в кислых условиях рН. Эти методы были успешно применены для других кислотно-защитных наставниками, таких как HdeA и может быть изменен, чтобы работать для других шаперонов и стрессовых условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии часто подвергаются к изменениям окружающей среды, такие как изменения рН, температуры, окислительно-восстановительного состояния, освещенности или механической силы. Многие из этих условий вызывают разворачивания белка в клетке и оказывают вредное воздействие на выживание организма. Группа не связаны, стресс специфических молекулярных шаперонов было показано, играют существенную роль в выживании этих условиях стресса. В то время как полностью сложена и компаньонка-неактивным до того стресса, эти белки быстро разворачиваются и становятся шаперонная-активными при определенных условиях стресса. После активации эти условно неупорядоченные хапероны связываются с большим числом различных агрегатных склонными белков, предотвращают их агрегацию и прямо или косвенно способствовать белок рефолдинга после возвращения в условиях без стресса. Основной подход для получения более детального понимания о механизме их активации и распознавания клиента включает в себя очистку и subsequenт характеристика этих белков с использованием в пробирке шаперонов анализов. Последующие действия в естественных условиях стресс - анализов абсолютно необходимы , чтобы подтвердить , независимо друг от друга полученный в пробирке результатов.

Этот протокол описывает в пробирке и в естественных условиях методы , чтобы охарактеризовать шаперонную активность Е. HdeB палочка, кислотно-активированный компаньонка. Измерения рассеяние света были использованы в качестве удобного чтения-аута для емкости HdeB для предотвращения кислотно-индуцированной агрегации установленного белка модель клиента, МДГ, в пробирке. Аналитические эксперименты ультрацентрифугирования были применены для выявления образования комплекса между HdeB и его белка клиент СДГ, чтобы пролить свет на судьбу клиента белков после их возвращения в условиях без стресса. Были проведены ферментные анализы активности клиента белков контролировать эффекты HdeB на рН-индуцированной инактивации и реактивации клиента. И, наконец, исследования выживаемости были использованы для Monitoг влияние функции шаперонного HdeB в естественных условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Распространенной природная среда , в которой микробные патогены опыт кислотно-индуцированного протеина условия разворачивание желудка млекопитающих (диапазон рН 1-4), чей кислый рН служит эффективным барьером против пищевых патогенов 1. Разворачивания белка и агрегации, которая вызывается боковой цепи аминокислоты протонирования, влияет на биологические процессы, повреждения оборудования клеточные структуры , и в конечном итоге приводит к гибели клеток в 1,2 раза . Поскольку рН бактериальной периплазмы уравновешивает практически мгновенно при рН среды за счет свободной диффузии протонов через пористую внешнюю мембрану, периплазматические и внутр....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Экспрессия и очистка периплазмической HdeB

Примечание: HdeB было выражено в Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 и очищают от периплазме при полимиксина лизиса.

  1. Подготовка ночной культуры Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 в 30 мл LB , содержащей 200 мкг / мл ампициллина (LB АМФ). Привить четыре 1 L культуры LB Amp и вырастить их при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту до OD 600нм 0,7 не будет достигнута. Затем добавляют 300 мкМ IPTG, чтобы индуцировать экспрессию HdeB и уменьшить температуру роста до ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HdeA и HdeB гомологичны E. палочки белки, известные защитить периплазмической белки от кислых условиях стресса 10. Наша работа показала, что похоже на HdeA, HdeB также функционирует как кислотный активированными молекул компаньонку. Тем не менее, в отличие от функций HdeA, HdeB при рН , который до сих пор потенциально бактерицидным, но значительно выше , чем рН оптимум HdeA 6,9,10,22. Для исследования Оптимум рН шаперонной активности HdeB в пробирке,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения механизма активации и шаперонного функции HdeB, большие количества HdeB должны быть экспрессирован и очищен. Ряд векторных систем экспрессии доступны для получения высоких уровней белка-мишени, в том числе PTRC или pBAD векторы, оба из которых были использованы в этом исследовании. Промоутеры легко доступны для E. палочка РНК - полимеразы и , таким образом , позволяют сильно повышающей регуляции экспрессии HdeB в любом Е. штамм E.coli. Этот аспект особенно актуален для сверх.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Клаудии Cremers за ее полезные советы по шаперонов анализов. Кен Ван признан за его технической помощи в очистке HdeB. Эта работа была поддержана Медицинского института Говарда Хьюза (к JCAB) и Национальных институтов здравоохранения грант RO1 GM102829 к JCAB и Ujj-UD поддерживается постдокторской исследовательской стипендии, предоставленной исследовательским фондом немецкой (DFG).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NEB10-бета E. coli клеткиNew England BiolabsC3019I
AmpicillinGold BiotechnologyA-301-3
LB Смесь бульона, LennoxLAB Express3003
IPTGGold BiotechnologyI2481C50
хлорид натрияFisher ScientificS271-10
TrisAmresco0826-5kg
EDTAFisher ScientificBP120-500
Полимиксин B сульфат ICN Biomedicals Inc.
0,2 & микро; m поры стерильный шприцевой фильтрCorning431218
HiTrap Q HP (CV 5 мл)GE Healthcare Life Sciences17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%Bio-Rad4561046
малатдегидрогеназа (MDH)Roche10127914001
фосфат калия (одноосновный)Fisher ScientificBP362-500
калий фосфат (Дибазический)Fisher ScientificBP363-1
F-4500HitachiFL25
ОксалоацетатSigmaO4126-5G
NADHSigma N8129-100MG
Одноосновной фосфатнатрия Sigma S9390-2,5KG
Двухосновной фосфатнатрия Sigma S397-500
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)Roche10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I аналитическая ультрацентрифугаBeckman Coulter392764
Центр, 12 мм, Epon Coal-наполненныйBeckman Coulter306493
AN-50 Ti Rotor, аналитический, 8-местныйBeckman Coulter363782
Wizard Plus Miniprep KitPromegaA1470используется для очистки плазмид (протокол 5.1)
L-арабинозаGold BiotechnologyA-300-500
GlycineDOT Scientific IncDSG36050-1000
Флуоресцентная клетка кюветаHellma Analytics119004F-10-40
ОлигонуклеотидыInvitrogen
Phusion Высокоточная ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0530S
набор dNTPInvitrogen10297018
соляной кислотойFisher ScientificA144-212
Гидроксид натрияFisher ScientificBP359-500
Amicon Ultra 15 мл 3K NMWLмиллипорUFC900324
Avanti J-26XPIBeckman Coulter393127
спектрофотометр Varian Cary 50Agilent Tech
Spectra/Por 1 Диализная мембрана MWCO: 6 кДаSpectrum Laboratories132650
Amicon Ultra Центробежные фильтрующие блоки 30KMilliporeUFC803024
SDSFisher Scientificbp166-500
Veriti 96-луночный термоамплификаторThermo Fisher4375786
100565Флуоресцентный спектрофотометр Центрифуга для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HdeBin vitroin vivo

Похожие статьи