Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение рН-зависимой активности

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54527

⸱

23 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование описывает биофизические, биохимические и молекулярные методы характеризуют шаперонную активность кишечной палочки HdeB в кислых условиях рН. Эти методы были успешно применены для других кислотно-защитных наставниками, таких как HdeA и может быть изменен, чтобы работать для других шаперонов и стрессовых условиях.

Аннотация

Бактерии часто подвергаются к изменениям окружающей среды, такие как изменения рН, температуры, окислительно-восстановительного состояния, освещенности или механической силы. Многие из этих условий вызывают разворачивания белка в клетке и оказывают вредное воздействие на выживание организма. Группа не связаны, стресс специфических молекулярных шаперонов было показано, играют существенную роль в выживании этих условиях стресса. В то время как полностью сложена и компаньонка-неактивным до того стресса, эти белки быстро разворачиваются и становятся шаперонная-активными при определенных условиях стресса. После активации эти условно неупорядоченные хапероны связываются с большим числом различных агрегатных склонными белков, предотвращают их агрегацию и прямо или косвенно способствовать белок рефолдинга после возвращения в условиях без стресса. Основной подход для получения более детального понимания о механизме их активации и распознавания клиента включает в себя очистку и subsequenт характеристика этих белков с использованием в пробирке шаперонов анализов. Последующие действия в естественных условиях стресс - анализов абсолютно необходимы , чтобы подтвердить , независимо друг от друга полученный в пробирке результатов.

Этот протокол описывает в пробирке и в естественных условиях методы , чтобы охарактеризовать шаперонную активность Е. HdeB палочка, кислотно-активированный компаньонка. Измерения рассеяние света были использованы в качестве удобного чтения-аута для емкости HdeB для предотвращения кислотно-индуцированной агрегации установленного белка модель клиента, МДГ, в пробирке. Аналитические эксперименты ультрацентрифугирования были применены для выявления образования комплекса между HdeB и его белка клиент СДГ, чтобы пролить свет на судьбу клиента белков после их возвращения в условиях без стресса. Были проведены ферментные анализы активности клиента белков контролировать эффекты HdeB на рН-индуцированной инактивации и реактивации клиента. И, наконец, исследования выживаемости были использованы для Monitoг влияние функции шаперонного HdeB в естественных условиях.

Введение

Распространенной природная среда , в которой микробные патогены опыт кислотно-индуцированного протеина условия разворачивание желудка млекопитающих (диапазон рН 1-4), чей кислый рН служит эффективным барьером против пищевых патогенов 1. Разворачивания белка и агрегации, которая вызывается боковой цепи аминокислоты протонирования, влияет на биологические процессы, повреждения оборудования клеточные структуры , и в конечном итоге приводит к гибели клеток в 1,2 раза . Поскольку рН бактериальной периплазмы уравновешивает практически мгновенно при рН среды за счет свободной диффузии протонов через пористую внешнюю мембрану, периплазматические и внутренние мембранные белки грамотрицательных бактерий являются наиболее уязвимые клеточные компоненты в условиях кислотно-стресс - 3. Для того, чтобы защитить их периплазматической протеом от быстрого повреждения кислотой опосредовано, грамотрицательные бактерии используют кислотно-активированный периплазмической шаперонов HdeA и HdeB. HdeA является условно неупорядоченных шаперонная 4,5: при нейтральном рН, HdeA присутствует в виде сложенной, шаперонного-неактивный димер. При сдвиге рН ниже рН 3, функция шаперонная HdeA в быстро активируется 6,7. Активация HdeA требует глубоких структурных изменений, в том числе его диссоциации на мономеры, а также частичное разворачивание мономеров 6-8. После активации HdeA связывается с белками, которые разворачиваются в кислых условиях. Это эффективно предотвращает их агрегацию и во время инкубации при низком рН, а также при рН нейтрализации. При возврате до рН 7,0, HdeA облегчает рефолдинга своих клиентов белков в АТФ-независимым образом , и преобразует его обратно в димерной, шаперон-неактивной конформации 9. Точно так же, гомологичные шаперонная HdeB также шаперон-неактивными при рН 7,0. В отличие от HdeA, однако, шаперонная активность HdeB достигает своего максимума при кажущейся рН 4,0, условия , при которых HdeB до сих пор в значительной степени сложена и димерных 10. Кроме того, дальнейшее понижение рН CAUSэс инактивация HdeB. Эти результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на обширные гомологии, HdeA и HdeB различаются по способу их функциональной активации позволяет им охватывать широкий диапазон рН с их защитной функции шаперона. Еще один шаперонная , который вовлечен в кислотной резистентности E. палочка является цитоплазматическим Hsp31, который , как представляется , стабилизировать развернутые клиентские белки , пока нейтральные условия не будут восстановлены. Точный механизм действия Hsp31, однако, остается загадочным 12. Учитывая , что другие Энтеропатогенная бактерии , такие как Salmonella , отсутствие оперон hdeAB, весьма вероятно , что другие еще неизвестные периплазматические шапероны могут существовать, которые участвуют в кислотной резистентности этих бактерий 11.

Протоколы , представленные здесь , позволяют контролировать рН-зависимой шаперонную активности HdeB в пробирке и в естественных условиях 10 и могут быть применены для исследования других шапероновтакие как Hsp31. С другой стороны , сложная сеть факторов транскрипции , которые контролируют экспрессию hdeAB потенциально могут быть исследованы с помощью естественных условиях стресс - теста в. Для того, чтобы охарактеризовать функцию шаперона белков в естественных условиях, различные экспериментальные установки могут быть применены. Один путь состоит в применении разворачивания белка стрессовые состояния и фенотипически характеризуют мутантные штаммы, которые либо сверхэкспрессии представляющего интерес гена или нести делеция гена. Протеомные исследования могут быть проведены, чтобы определить , какие белки больше не агрегированный в стрессовых условиях , когда шаперонная присутствует, или влияние компаньонкой на конкретного фермента может быть определена во время стрессовых условиях с использованием ферментативных анализов 14-16. В данном исследовании мы выбрали гиперэкспрессией HdeB в штамм rpoH удаления, в которой отсутствует фактор сигмы теплового шока 32. RpoH контролирует экспрессию всех основных Е. палочки наставники и его исключение как известно, увеличивает Сенсitivity к условиям окружающей среды , которые вызывают стресс разворачивания белка 15. В естественных условиях шаперонная активность HdeB определяли путем мониторинга его способностью подавлять чувствительность рН штамма Δ rpoH. В целом, протоколы , представленные здесь , обеспечивают быстрый и простой подход к характеризации активности кислой активированного шаперона в пробирке, а также в контексте в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Экспрессия и очистка периплазмической HdeB

Примечание: HdeB было выражено в Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 и очищают от периплазме при полимиксина лизиса.

  1. Подготовка ночной культуры Е. Клетки палочки , несущие плазмиду pTrc- hdeB 10 в 30 мл LB , содержащей 200 мкг / мл ампициллина (LB АМФ). Привить четыре 1 L культуры LB Amp и вырастить их при температуре 37 ° C и 200 оборотов в минуту до OD 600нм 0,7 не будет достигнута. Затем добавляют 300 мкМ IPTG, чтобы индуцировать экспрессию HdeB и уменьшить температуру роста до 30 ° С.
  2. Через 5 часов экспрессии белка при 30 ° С, собирают клетки центрифугированием при 8000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  3. Промывают осадок клеток с помощью 100 мл буфера А (50 мМ Трис / HCl, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и центрифугируют клетки снова при 8000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  4. Впоследствии, ресуспендируютосадок клеток в 80 мл буфера А, содержащего 1 мг / мл сульфата полимиксина. Для эффективного разрушения внешней мембраны, осторожно перемешать суспензии в течение 1 ч при температуре 4 ° С.
  5. Для удаления цитоплазматической фракции и остатков клеток, центрифугирование суспензии в течение 20 мин при 15000 х г при 4 ° С. Это приводит к ~ 60 мл надосадочной жидкости, содержащей растворимый HdeB.
  6. Диализировать супернатант, содержащий периплазматическому экстракт в течение ночи против 150x объема буфера В (20 мМ Трис / HCl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0) с использованием диализной мембраны с 6 кДа MW среза. Концентрат белков до 15 мл с помощью центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 3 кДа. Фильтр белкового раствора с использованием 0,2 мкм пор фильтра.
  7. Нанесите белок на колонку анионообменной хроматографии (объем колонки 5 мл), который был уравновешен с 5 объемами колонки буфера В при скорости потока 2,5 мл / мин. После того, как белок наносили на колонку, колонку промывают буфером Б в течение 10 мин прискорость потока 2,5 мл / мин. Элюировать HdeB с линейным градиентом от 0 до 0,5 М NaCl в буфере В течение периода времени 50 мин со скоростью потока 2,5 мл / мин 6.
  8. Определение фракций, содержащих HdeB с использованием 15% SDS-PAGE. Смешайте 20 мкл образца с 5 мкл 5х восстановленного SDS буфера для загрузки. Нагрузка 10 мкл на гель и запустить в Трис-глицин-буфере (14,4 г / л глицина, 2,9 г / л Трис, 1 г / л додецилсульфата натрия, рН 8,3). Выполнить геля при 150 В до тех пор, пока бромфеноловый группа мигрировала близко к нижней части геля (~ 45 мин).
  9. Бассейн всех HdeB-содержащие фракции, диализ при 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера хранения HdeB (50 мМ Трис / HCl, 200 мМ NaCl, рН 8,0), и концентрат белка приблизительно до 300 мкМ, с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 3 кДа. Определить концентрацию HdeB при 280 нм , используя коэффициент экстинкции е = 280 нм 15,595 М -1 см -1. Подготовьте 100 мкл аликвоты и флеш-бесплатноZe аликвоты в жидком азоте.
    Примечание: HdeB можно хранить при -70 ° С в течение не менее 6 месяцев.

2. Сопровождающий Анализ активности Использование Термически Разворачивание малатдегидрогеназу (МДГ)

Примечание: Влияние очищенного HdeB на агрегацию термически разворачивания свиную митохондриальную малатдегидрогеназу (MDH) при различных значениях рН контролировали, как описано ниже. Все перечисленные концентрации белка относятся к концентрации мономера.

  1. Для подготовки МДГ, диализировать МДГ при температуре 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера С (50 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и концентрат белка приблизительно до 100 мкМ с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 30 кД.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное диализ МДГ требуется в качестве МДГ поставляется в виде раствора сульфата аммония.
  2. Чтобы удалить агрегаты, центрифугировать белка в течение 20 мин при 20000 х г при 4 ° С. Определить концентрацию MDH по оптической плотности при длине волны 280 нм (ε <к югу от > 280 нм = 7950 М -1 см -1). Готовят 50 мкл аликвоты МДГ и флэш-замораживания аликвот для хранения.
  3. Поместите 1 мл кварцевую кювету в флуоресцентном спектрофотометре, оборудованного с контролируемой температурой держатели для образцов и мешалкой. Установите λ ех / эм до 350 нм.
  4. Добавьте соответствующие объемы подогретого (43 ° C) буфера D (150 мМ фосфат калия, 150 мМ NaCl) при требуемых значениях рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0, рН 4,0 и рН 5,0) в кювету и множества температура в держатель кювет до 43 ° C. Общий объем составляет 1000 мкл.
  5. Добавить 12,5 мкМ HdeB (или альтернативно один и тот же объем буфера для хранения HdeB для управления буфером) в буфер, а затем добавлением 0,5 мкМ МДГ. Начать мониторинг рассеяния света. Инкубируйте реакции в течение 360 сек, чтобы обеспечить достаточное раскрытие МДГ.
  6. Повышения рН до 7 путем добавления 0.16-0.34 объема 2 М небуферизованном K 2 HPO 4 и продолжают повторнось рассеяния света на другой 440 сек.
  7. Установить степень агрегации MDH, который записывается при отсутствии шаперона в определенной точке времени после нейтрализации (здесь после 500 сек, когда наблюдалось максимальное светорассеяние MDH) до 100%. Нормализовать активность HdeB по к сигналу рассеяния света от MDH в отсутствие HdeB при каждом указанном значении рН.

3. Обнаружение HdeB-СДГ комплексообразования Аналитической ультрацентрифугирования (ППК)

Примечание: Седиментационные эксперименты по скоростям по отдельности или в комплексе с термически разворачивания лактатдегидрогеназы (ЛДГ) HdeB были выполнены с использованием аналитической ультрацентрифуге.

  1. Для подготовки ЛДГ, диализировать ЛДГ при температуре 4 ° С в течение ночи против 4 л буфера С (50 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,5) и концентрат белка приблизительно до 200 мкМ, с использованием центробежных фильтра с молекулярной массой отсечке 30 кД.
    Примечание: Тщательное диализного ЛДГ требуется, как LDН поставляется в виде раствора сульфата аммония.
  2. Чтобы удалить агрегаты, центрифуга ЛДГ в течение 20 мин при 20000 х г при температуре 4 ° С. Определить концентрацию ЛДГ по оптической плотности при 280 нм (ε 280 нм = 43680 М -1 см -1). Готовят 50 мкл аликвоты ЛДГ и флэш-замораживания аликвот для хранения.
  3. Выдержите 3 мкМ ЛДГ в присутствии и в отсутствие 30 мкМ HdeB в буфере D (рН 4 и 7, соответственно) в течение 15 мин при 41 ° C.
    Примечание: инкубация СДГ при более высоких температурах приводит к ее полной агрегации, и не шаперонная эффект HdeB можно наблюдать.
  4. Пусть образцы охлаждают до комнатной температуры. Затем образцы загрузить в клетки, содержащие стандартную форму сектора 2-канальные с 1,2 центральные см длины пути. Загрузить клетки в ультрацентрифуге и уравновешивания до 22 ° С в течение не менее 1 ч до осаждения.
  5. Образцы отжима при 22 ° С и 167000 XG в соответствующем роторе в течение 12 ч, а также следить за СЭДimentation из непрерывно при 280 нм белка. Как было показано ранее, соотношение сигнал-шум улучшается, когда передаваемая интенсивность света каждого канала измеряемое, а не оптической плотности. Это также улучшает качество последующей подгонки данных.
  6. Провести анализ данных с SEDFIT (версия 15.01b, декабрь 2015), используя модель 17 распределения непрерывной C (S). Учебник , описывающий , как использовать SEDFIT можно найти в ссылке 18.
    1. Установите уровень доверия для ME (Maximum Entropy) регуляризация до 0,7.
  7. Вычислить плотность буфера, а также вязкость , используя SEDNTERP 19. Для того, чтобы оценить количество агрегированного протеина клиента, сравнить интегралы осажденных ЛДГ в рН 4 до рН 7 в качестве эталона.
    Примечание: Интеграция графиков распределения оседания может быть сделано непосредственно в SEDFIT. Альтернативное программное обеспечение для анализа данных по скорости седиментации можно найти в недавнем обзоре 20.

4. Мониторинг МДГ Инактивация и реактивации в присутствии HdeB

Примечание: Влияние очищенного HdeB на рефолдинга рН-разложенном МДГ определяли путем мониторинга активности MDH при нейтрализации.

  1. Инкубируют 1 мкМ МДГ в буфере D в требуемых значениях рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0, рН 4,0 и рН 5,0) в течение 1 ч при 37 ° С в отсутствие или в присутствии 25 мкМ HdeB. Затем, сдвиг температуры до 20 ° С в течение 10 мин.
    Примечание: Ни один МДГ рефолдинга не наблюдалось даже в присутствии HdeB когда МДГ инкубировали при температуре выше 37 ° С.
  2. Инициировать рефолдинга кислоты денатурированного МДГ, нейтрализуют пробы до рН 7 добавлением 0.13-0.42 объема 0,5 М фосфат натрия, рН 8,0.
  3. После инкубации в течение 2 ч при температуре 20 ° С, определяют активность MDH путем мониторинга уменьшение НАДН при 340 нм 9.
    Примечание: MDH катализирует NADH-зависимого снижения оксалоацетата в L-малат.
  4. Смешайте 50 мкл реакционной смеси инкубации с 950 мкл буфера для анализа (50 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 1 мМ оксалоацетата и 150 мкМ NADH).
    Примечание: Конечная концентрация МДГ в буфере для анализа должен быть 44 нМ.
  5. Контролировать изменение оптической плотности, используя спектрофотометр, оснащенный блоком контроля температуры Пельтье установлен на 20 ° C.
  6. Отчет о MDH активность по сравнению с 44 нМ родной МДГ, которая была сохранена при рН 7,0.

5. Влияние HdeB сверхэкспрессии на Е. Выживание палочка под кислотному стрессу

Примечание: E. палочка 1655 геномную ДНК выделяли с использованием опубликованного протокола 21.

  1. Amplify hdeB из Е. палочки 1655 с помощью ПЦР с использованием праймеров hdeB - BamHI - I-Rev GGT GGT CTG GGA ТСС ТТА ATT CGG CAA GTC ATT и hdeB - EcoR I-ФВ GGT GAA TTC НКУ AGG AGG CGC ATG ААТ ATT TCA TCT CTC C.
  2. Настройка реакции ПЦР в 50 мкл следующим образом : 10 мкл 5х полимеразы буфера, 200 мкМ дНТФ, 0,5 мкМ праймера JUD2, 0,5 мкМ праймера JUD5, 150 нг геномной 1655 ДНК, 0,5 мкл ДНК - полимеразы, добавляют DDH 2 O до 50 мкл.
  3. Выполните амплификацию hdeB следующим образом : Шаг 1: 5 мин при 95 & deg ; С, 1 цикл; шаг 2: 30 сек при 95 ° С, 30 сек при 55 ° С, 30 сек при 72 ° С, 40 циклов; Шаг 3: 10 мин при 72 ° С.
  4. Клонирование в результате ПЦР - фрагмента в сайты EcoR I и BamH I плазмиды pBAD18 с использованием стандартных методов клонирования сайтов рестрикции. Очищают плазмиды с использованием набора для очистки плазмидной в соответствии с инструкциями изготовителя. Проверьте полученную плазмиду с помощью секвенирования 10.
  5. Transform плазмиды , выражающую HdeB или пустые pBAD18 борьбы с переносчиками в штамм BB7224 (Δ rpoH) (генотип: F -, λ -, e14 -, [araD139] B / г [6; (ФГДД-ЛАК) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 ARAD + rpoH :: кан +; 16) с использованием химически компетентных клеток.
    Примечание: Этот штамм чувствительным к температуре.
  6. После того, как 45 сек теплового шока при 42 ° С и до посева, инкубировать клетки при 30 ° С и 200 оборотах в минуту. Выполнение одной колонии Штриховатост-аутов из положительных клонов и инкубировать в течение ночи при 30 ° C. Подготовка ночной культуры в 50 мл LB Amp и культивирования клеток , при 200 оборотах в минуту и 30 ° C.
  7. Развести в течение ночи культуры в 40 раз в 25 мл LB - Amp и расти бактерии , в присутствии 0,5% арабинозы (ARA) при температуре 30 ° C и 200 оборотов в минуту до OD 600 нм = 1,0 , чтобы индуцировать экспрессию белка HdeB.
  8. Для экспериментов с рН сдвига, используют LBAmp + Ара разбавить клетки OD 600 нм 0,5 и приспосабливаться к соответствующим значениям рН (здесь: рН 2,0, рН 3,0 и рН 4,0) путем добавления соответствующих объемов 5 М HCl.
  9. После того, как указанные моменты времени (рН 2, 1 мин; рН 3, 2,5 мин; рН 4, 30 мин), нейтрализуют культур путем добавления соответствующих объемов 5М NaOH.
  10. Следить за ростом нейтрализованных культур в жидкой культуре в течение 12 ч при 30 ° С с использованием измерений оптической плотности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

HdeA и HdeB гомологичны E. палочки белки, известные защитить периплазмической белки от кислых условиях стресса 10. Наша работа показала, что похоже на HdeA, HdeB также функционирует как кислотный активированными молекул компаньонку. Тем не менее, в отличие от функций HdeA, HdeB при рН , который до сих пор потенциально бактерицидным, но значительно выше , чем рН оптимум HdeA 6,9,10,22. Для исследования Оптимум рН шаперонной активности HdeB в пробирке,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для изучения механизма активации и шаперонного функции HdeB, большие количества HdeB должны быть экспрессирован и очищен. Ряд векторных систем экспрессии доступны для получения высоких уровней белка-мишени, в том числе PTRC или pBAD векторы, оба из которых были использованы в этом исследовании. Промоутеры легко доступны для E. палочка РНК - полимеразы и , таким образом , позволяют сильно повышающей регуляции экспрессии HdeB в любом Е. штамм E.coli. Этот аспект особенно актуален для сверх...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Мы благодарим доктора Клаудии Cremers за ее полезные советы по шаперонов анализов. Кен Ван признан за его технической помощи в очистке HdeB. Эта работа была поддержана Медицинского института Говарда Хьюза (к JCAB) и Национальных институтов здравоохранения грант RO1 GM102829 к JCAB и Ujj-UD поддерживается постдокторской исследовательской стипендии, предоставленной исследовательским фондом немецкой (DFG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NEB10-бета E. coli клеткиNew England BiolabsC3019I
AmpicillinGold BiotechnologyA-301-3
LB Смесь бульона, LennoxLAB Express3003
IPTGGold BiotechnologyI2481C50
хлорид натрияFisher ScientificS271-10
TrisAmresco0826-5kg
EDTAFisher ScientificBP120-500
Полимиксин B сульфат ICN Biomedicals Inc.
0,2 & микро; m поры стерильный шприцевой фильтрCorning431218
HiTrap Q HP (CV 5 мл)GE Healthcare Life Sciences17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%Bio-Rad4561046
малатдегидрогеназа (MDH)Roche10127914001
фосфат калия (одноосновный)Fisher ScientificBP362-500
калий фосфат (Дибазический)Fisher ScientificBP363-1
F-4500HitachiFL25
ОксалоацетатSigmaO4126-5G
NADHSigma N8129-100MG
Одноосновной фосфатнатрия Sigma S9390-2,5KG
Двухосновной фосфатнатрия Sigma S397-500
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)Roche10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I аналитическая ультрацентрифугаBeckman Coulter392764
Центр, 12 мм, Epon Coal-наполненныйBeckman Coulter306493
AN-50 Ti Rotor, аналитический, 8-местныйBeckman Coulter363782
Wizard Plus Miniprep KitPromegaA1470используется для очистки плазмид (протокол 5.1)
L-арабинозаGold BiotechnologyA-300-500
GlycineDOT Scientific IncDSG36050-1000
Флуоресцентная клетка кюветаHellma Analytics119004F-10-40
ОлигонуклеотидыInvitrogen
Phusion Высокоточная ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0530S
набор dNTPInvitrogen10297018
соляной кислотойFisher ScientificA144-212
Гидроксид натрияFisher ScientificBP359-500
Amicon Ultra 15 мл 3K NMWLмиллипорUFC900324
Avanti J-26XPIBeckman Coulter393127
спектрофотометр Varian Cary 50Agilent Tech
Spectra/Por 1 Диализная мембрана MWCO: 6 кДаSpectrum Laboratories132650
Amicon Ultra Центробежные фильтрующие блоки 30KMilliporeUFC803024
SDSFisher Scientificbp166-500
Veriti 96-луночный термоамплификаторThermo Fisher4375786
100565Флуоресцентный спектрофотометр Центрифуга для

Ссылки

  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Шаперон HdeBанализ светорассеянияшаперон in vitroвыживаемость in vivoкислотоактивируемый шаперонагрегация белковмалатдегидрогеназаанализы на выживаемость
Обнаружение рН-зависимой активности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.