Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54598

⸱

28 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы создаем индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из клеток амниотической жидкости мыши, используя систему транспозонов, не основанную на вирусе.

Аннотация

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) генерируются из соматических клеток мыши и человека путем принудительной экспрессии определенных факторов транскрипции с использованием различных методов. Здесь мы получили iPS-клетки из клеток амниотической жидкости мыши, используя систему транспозонов, не основанную на вирусе. Все полученные iPS-клеточные линии проявляли характеристики плюрипотентных клеток, в том числе способность к дифференцировке в сторону производных всех трех зародышевых слоев in vitro и in vivo. Эта стратегия открывает возможность использования клеток больных плодов для разработки новых методов лечения врожденных дефектов.

Введение

Пренатальная диагностика является важным клиническим инструментом для оценки генетических заболеваний (т.е. хромосомных аберраций, моногенные или полигенных / многофакторный заболевания) и врожденные пороки развития (то есть врожденная диафрагмальная грыжа, кистозные поражения легких, пупочная грыжа, Гастрошизис). Амниотической жидкости (AF) клетки легко получить из регулярно запланированных процедур во втором триместре беременности (т.е. амниоцентеза и амниоредукцией) или кесарева сечения 1, 2. Наличие клеток AF от пренатальной или неонатальных пациентов дает возможность использовать этот источник для регенеративной медицины, и некоторые исследователи исследовали возможность лечения различных повреждений тканей или болезни , используя популяцию стволовых клеток , выделенной из AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Возможность легко получать клетки AF от больных пациентов, в окне времени, в котором заболевание часто неподвижен, открывает путь к идее использования этого источника клеток для целей перепрограммирования. Действительно, индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетки , полученные из клеток AF может быть дифференцирован в клетках , представляющих интерес для экстракорпорального тестирования на наркотики или для тканевой инженерии подходов, с тем чтобы подготовить адекватный пациент-специфической терапии до родов. Многие исследования уже продемонстрировали способность клеток AF перепрограммировать и дифференцировались в широком диапазоне типов клеток 13, 14, 15, 16, 17 </ SUP>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

С момента открытия Такахаши и Яманака 28 перепрограммирован соматических клеток через форсированной экспрессии четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, CMYC и Klf4), прогресс был достигнут в области перепрограммирования. Рассматривая различные методы, мы можем различать вирусные и невирусных подходы. Первый предполагает использование вирусных векторов (ретровирусы и лентивирусов), которые имеют высокую эффективность, но, как правило, неполное глушение ретровирусного трансгена, причем как следствие частично перепрограммирован клеточной линии и рискинсерционного мутагенеза 29, 30, 31. Невирусная метод использует различные стратегии: т.е. плазмиды, векторы, мРНК, белки, транспозонов. Вывод плюрипотентных клеток свободных трансгенных последовательностей стремится обойти потенциально вредные последствия вытекающей трансгенной экспрессии и инсерционного мутагенеза. Среди всех вышеперечисленных невирусных стратегий, то PiggyBac (PB) система транспозонов / транспозаза требует только перевернутые концевые повторы фланговые трансген и переходную экспрессию транспозазы фермента катализировать вставки или иссечения события 32. Преимущество в использовании транспозонов по сравнению с другими методами для генерации иПК клеток является возможность получения вектора свободных плюрипотентных клеток с не вирусным вектором подход, который показывает ту же самую эффективность ретровирусных векторов. Это возможно с помощью трассировки менее иссечения интегрированной кодировки транспозонов для reprogramming факторы после новой временной экспрессии транспозаза в клетках плюрипотентных 33. Учитывая , что ПБ является эффективным в различных типах клеток , 34, 35, 36, 37, больше подходит для клинического подхода в отношении вирусных векторов, а также позволяет для производства Xeno свободных плюрипотентных клеток в отличие от текущих вирусных производства протоколы , которые используют ксенобиотика условия, эта система используется для получения плюрипотентных клеток из мышиного AF.

Здесь мы предлагаем подробный протокол следующую уже опубликованную работу , чтобы показать производство плюрипотентных плюрипотентных клонов из клеток AF мыши (плюрипотентных клеток-AF) 38.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры проводились в соответствии с итальянским законодательством. Образцы Мышиные AF собирали из беременных мышей на 13,5 дней после коитуса (DPC) из C57BL / 6-Tg мышей (UBC-GFP) 30Scha / J называется GFP.

1. Производство транспозонов

Примечание: векторы экспрессии транспозону были получены с использованием стандартных методик. Плазмидную ДНК для мыши AF клеток трансфекции получали с использованием коммерческих наборов.

  1. Смешайте 10 нг плазмидной ДНК с 50 DH5 & alpha мкл бактерий в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Выдержите в микроцентрифужных пробирку на льду в течение 20 мин.
  2. Тепловой удар при 42 ° С в течение 40 сек.
  3. Поместите микроцентрифужную пробирку на льду в течение 2 мин.
  4. Добавьте 250 мкл подогретого (37 ° C) лизогении бульона (LB) бульона. Взболтать (300 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 30 мин.
  5. Спред 30 мкл каждой трансформации на LB пластинах с помощью 0,1 мг / мл ампициллина. Разрешить пластин сушить и инкубировать в перевернутом при 37 ° C OVernight.
  6. На следующий день, во второй половине дня, забрать 3 колонии, с использованием стерильных 200 мкл советов, от каждого преобразования и передачи на 0,1 мг / мл LB усилителя.
  7. Взболтать (300 оборотов в минуту) бактерии в течение ночи при температуре 37 ° С.
  8. Для очистки плазмиды используют коммерческие наборы. Сток плазмид при -20 ° C.

2. мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) Культура

  1. Окраска 6-луночные планшеты с 0,1% желатином
    1. Coat пластины под капотом добавлением 1 мл стерильного 0,1% желатина в каждой из шести лунок. Пусть желатин полимеризуется на инкубаторе (37 ° С) в течение 1 часа.
    2. Откажитесь от избытка, и высушить пластин в течение 1 часа.
    3. Используйте парафильмом, чтобы запечатать и хранить пластины при комнатной температуре.
  2. Инактивация MEF с Митомицин C
    1. Оттепель флакон 4 × 10 6 MEF клеток с использованием 37 ° C ванну.
    2. Семенной MEF в капюшоне на чашке Петри (+150 мм) с MEF среды.
    3. Выращивают клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
    4. (ОСТОРОЖНО!) Добавить митомицин С (5 мг / мл), когда клетки вырожденная.
    5. Место клетки в инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) в течение 3 часов.
    6. Удалить среду с клетками митомицином С. Wash три раза 1x фосфатного солевого буфера (PBS).
    7. Добавляют 2 мл коммерческих трипсина и поместить клетки в 37 ° C инкубаторе в течение 5 мин. После того, добавляют 18 мл блокирующего среды, чтобы остановить реакцию трипсина.
    8. Граф клеток с использованием Бюркера камеры в соответствии с протоколом производителя.
    9. Центрифуга клетки при 145 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант.
    10. Семенной 60000 клеток / см 2 инактивированной MEF на 0,1% желатина покрытием пластин.
    11. Выращивают клетки в течение 24 ч при температуре 37 ° С и 5% СО 2, перед посевом AF и / или плюрипотентных клеток-AF.

3. Мышь AF Выделение клеток

  1. Настройка таймерных вязки и проверить вагинальное PLUГ.С. через 24 ч совместного жилья.
  2. Наблюдайте до 13,5 DPC и принести в жертву беременной дамбу через цервикальной дислокации.
  3. Очистите брюшной стенки животного с использованием 70% этанола.
  4. С помощью ножниц, выполнить срединной лапаротомии надрезывать длину брюшной стенки, чтобы получить доступ в брюшную полость.
  5. Выставляют матку с помощью щипцов. Удалите матку с помощью ножниц и передачи в 100 мм чашке Петри заполнены стерильной 1x PBS помещают на лед.
  6. Используйте стереомикроскопа для сбора автофокусировки при 10-кратным увеличением.
  7. Держите матку с пинцетом и удалить маточную стенку с ножницами. Будьте осторожны, чтобы избежать каких-либо повреждений плода мембран и, как следствие утечки околоплодных жидкостей.
  8. Сбор плодов в 100 мм Петри, наполненную стерильным 1x PBS и место на льду.
  9. Захватите плаценту одного плода с тонкость щипцами и место в чистом 100 мм чашку Петри.
  10. Удалите желтка с использованием тонких щипцов точек.
    11. Разрушить амнион с использованием тонких щипцов точек и собрать 30 мкл AF для каждого плода, используя инсулиновый шприц в 15 мл коническую пробирку.
  11. После сбора AF, моют каждый зародыш стерильными 1x PBS с добавлением 1% бычьего эмбриональной сыворотки (FBS) и собирают в 15 мл коническую пробирку, содержащую AF.
  12. Центрифуга AF при 145 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант под капотом и семян осажденные клетки AF.

4. Мышь АФ Культура клеток

  1. Посев мышь AF Cells
    1. За один день до посева, подготовить 0,1% желатин покрытием 6-луночного планшета с митомицин С обработанной MEF.
    2. После сбора AF, семена клетки , полученные из амниоцентеза (около 1 × 10 7 клеток , полученных из 6 плодов) на митотически инактивированных МЭФ с использованием АФ культуральной среды.
    3. Выращивают клетки при 37 ° С и 5% CO 2, заменяя среду через день.
    4. После 7 дней культивирования, трансКлетки фект AF следуя процедуре, описанной ниже.

5. Трансфекция, ИПС-AF Cell Генерация и культура

Примечание: мышиные клетки AF трансфицировали транспозонов плазмиды РВ-tetO2-IRES-OKMS, в сочетании с выражением транспозазу плазмиды (mPBase) и с обратной тетрациклинового трансактиватора транспозонов плазмиды (PB-CAG-rtTA). Все плазмиды были предоставлены профессором Андраш Надь 33.

  1. Смешайте 1 мкг PB-tetO2-IRES-OKMS с 0,5 мкг mPBase и 0,5 мкг PB-КАГ-rtTA (Общая ДНК: 2 мкг) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  2. Развести ДНК до 100 мкл бессывороточной среды (среда Игла, модифицированная Дульбекко - DMEM).
  3. Добавить 8 мкл реагента для трансфекции (напр, Fugene) (при соотношении плазмидной ДНК: трансфекция агент 2 мкг (ДНК) , до 8 мкл агентом трансфекции) в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку , содержащую ДНК.
  4. Выдержите трансфекции смесь реагентов / ДНК в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Добавьте по каплям добавляют 100 мкл смеси реагента для трансфекции / ДНК на лунку на 6-луночный планшет с клетками AF мыши и распространять нежным закрученного, с получением конечного объема 2 мл / лунку. Оставьте в течение 24 часов.
  6. На следующий день после, индуцируют экспрессию факторов в Яманаки (Oct4, Klf4, CMYC, Sox2) путем подачи клетки со средой свежей ИПС-AF, дополненной 1,5 мкг / мл (2 доксициклина мл среды для каждой лунки).
  7. Поток клеток каждый день, без прохода, со свежим DOX-среде, содержащей (поддержания клеток в средах не дополненной доксициклина до точки 5.13).
  8. Соблюдайте клетки в течение 24 часов для экспрессии mCherry и ежедневно для образования колоний (колонии обычно появляются от 20 до 30 дней после трансфекции).
  9. За один день до сбора колонии, подготовить 96-луночного планшета для культуры ткани с митомицин С обработанных MEF.
  10. Выберите единичных колоний в 50 мкл объема USINGA 200 мкл пипеткой, и передавать их последовательно в 96-луночный планшет в отдельных скважинах.
  11. На следующий день после того, как, диссоциируют каждую колонию на отдельные клетки путем добавления 50 мкл коммерческого трипсина и инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С.
  12. Пипетировать вверх и вниз, чтобы детализировать колонию.
  13. Передача 50 мкл трипсина, содержащего Диссоцииро- колонию в новую лунку с инактивированной MEF на 0,1% желатином покрытием 96 луночного планшета заполняли 100 мкл свежей среды ИПС-AF, дополненной доксициклина.
  14. Когда клетки достигают 60-70% сплошности, расщепляется на лунку 24-луночного планшета.
  15. Когда клетки достигают 60-70% слияния, разделения 1: 2 до двух скважин, одна с доксициклин, а другой без доксициклина, чтобы проверить, если колонии появляются также в состоянии без доксициклина.
  16. Продолжайте поддерживать плюрипотентных-AF клонов, доксициклин независимая, на инактивированной MEF в среде ИПС-AF.
  17. Выращивают клетки при 37 ° С и 5% CO 2, CHanging среды ежедневно.

6. щелочной фосфатазы Окрашивание

  1. Выполните щелочной фосфатазы окрашивания в соответствии с протоколом производителя всякий раз, когда есть появление доксициклин независимых плюрипотентных клеток-AF.

7. иммунофлуоресценции

  1. Когда есть появление доксициклин клеток независимых ИПС-AF, семена 150000 клеток / см 2 на лунку 24-луночного планшета с инактивированной MEF и роста клеток в течение 48 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
  2. (ОСТОРОЖНО!) Зафиксировать клетки путем добавления 300 мкл на лунку в 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Добавить 300 мкл 0,1% NP-40 до проницаемыми клеток.
  4. Промыть клетки с 300 мкл 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Добавьте 300 мкл блокирующего буфера (10% лошадиной сыворотки в 1x PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Используйте следующие первичные антитела: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (в соотношении 1:100) и SSEA1 (1:80). Развести SSEA1 с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 10% нормальной козьей сыворотки, 0,3 М глицина в 0,1% PBS-Tween-20. Развести все другие антитела с добавлением 10% лошадиной сыворотки в 1X PBS.
  7. Инкубируйте антител в течение ночи при температуре 4 ° С.
  8. Промыть 300 мкл 0,1% PBS-Tween-20.
  9. С помощью вторичных антител, разведенного в 10% лошадиной сыворотки в 1X PBS: Alexa594-конъюгированный козий анти-мышиного IgG (1: 200), Alexa594-конъюгированные куриный анти-козел IgG (1: 200), Alexa594-конъюгированные курица против кроличьего IgG (1: 200), Alexa568-конъюгированный козий анти-мышиных IgM (1: 200). Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
  10. Полоскание с 1x PBS.
  11. Ядра окрашиваются раствором Hoechst (1: 10000) в 1x PBS.

8. In Vitro дифференцировка клеток

  1. Для формирования висячей капли эмбриональных телец (ЭТ), культивировать одиночные капли (2000 клеток / 20 мкл) на крышку чашки Петри, с помощью дифференциации среды.
  2. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° Си 5% СО 2 в течение 4 -х дней.
  3. Передача ЭТ в 100 мм чашках бактериальный класса в суспензионной культуре в течение 3-х дней в дифференцировке среде.
  4. Пластинчатые ЭТ в 24-луночных пластин, покрытых базальной мембраны матрицы (разбавленного в соотношении 1:10 в DMEM) в течение еще 14 дней.
  5. Для иммунофлюоресценции анализа, используют первичные антитела: T (1: 100), αfp (1: 200) и Tubb3 (1: 500) 37.

9. В Vivo тератомы Формирование

  1. Вводят 100 мкл 1x PBS , содержащий от 1 × 10 6 клеток ИПС-AF в мышцу задней конечности из RAG2 - / - Гс - / - мышей.
  2. Жертвоприношение мышей через цервикальной дислокации через 6 недель после инъекции клеток.
  3. Удалите массы опухоли, отличающиеся по размеру от задних конечностей мышей для следующих анализов.
  4. Вырезать 7-10 мкм поперечные срезы изопентана замораживают опухоли использованием криостата.
  5. Для гематоксилином А.Н.d эозином (HE) Пятно:
    1. Пятно с HE оценить состав опухолевой ткани, в соответствии с протоколом производителя.
  6. Для иммунопероксидазной Stain:
    1. Закрепить секции тератома с 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
    2. Проницаемыми с 0,1% тритона Х-100.
  7. Инкубируйте со следующими антителами: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) и αSMA (1: 100), разведенного в 1% BSA в PBS 1x. Инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С (для Tubb3) или в течение ночи при 4 ° С (для других антител).
  8. Блок-пероксидаза с использованием 100% метанола в течение 20 мин.
  9. Инкубировать в течение 45 мин при температуре 37 ° С с вторичным антителом против мышиного конъюгированным с пероксидазой хрена (1: 150).
  10. Полоскание с 1x PBS.
  11. Инкубируйте с пероксидазой (HRP) субстрата (См Материалы таблицу) в течение 5 мин.
  12. Промыть проточной водой в течение 5 мин.
  13. Пятно гематоксилином QS в течение 9 сек.
  14. Полоскание с водопроводной водой.

    15. 10. Экстракция РНК из клеток

    1. Использование комплекта для коммерческой добычи РНК в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.

    11. Экстракция РНК из тератомы

    1. Гомогенизируйте тератомы с помощью ступки и пестика и жидкий азот, чтобы избежать оттаивание образца.
    2. Взвешивают 25 мг ткани.
    3. Добавить 1 мл коммерческого реагента для экстракции РНК и 200 мкл хлороформа.
    4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    5. Центрифуга при 13000 х г и 4 ° С в течение 15 мин.
    6. Передача очищенную супернатант в новую пробирку.
    7. Для очистки РНК используют набор коммерческого выделения РНК в соответствии с протоколом производителя.

    12. с обратной транскрипцией-полимеразной цепной реакции Анализ

    1. Обобщить первой нити кДНК с использованием обратной транскриптазы для обратной транскрипцией (RT) -полимеразы цепной реакции (ПЦР) и олиго (дТ) Accorдинь с протоколом производителя, чтобы получить 50 нг / мкл кДНК. Развести кДНК с РНКазы водой при концентрации 10 нг / мкл.
    2. Выполнить ОТ-ПЦР с использованием ДНК-полимеразы в соответствии с протоколом производителя, используя 1 нг / мкл кДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того, чтобы оценить способность перепрограммирования клетки мыши AF были собраны из плодов GFP мышей. Клетки трансфицировали с круговым транспозонов плазмиды PB-tetO2-IRES-OKMS, выражающей факторы Яманака (Oct4, Sox2, CMYC и Klf4), связанных с флуоресцентным белком mCherry в доксициклина-индуцируемый образом, и обратный тетрациклина трансактиватор (PB- CAG-rtTA) плазмид вместе с выражением транспозазу плазмиды (mPBase). Клетки мышиной AF трансфицировали Oct4, Klf4, CMYC и Sox2 после ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, выбранный для получения индукции плюрипотентности имеет важное значение для клеток клинической безопасности в отношении долгосрочной трансплантации. В настоящее время существует несколько методов, подходящих для перепрограммирования. Среди не-интегративных методов, вирусный (SeV) вектор Сендай является РНК - вирусом , который может производить большое количество белка без интеграции в ядро инфицированных клеток 40 и может быть стратегия для получения плюрипотентных клеток. SEV векторов мож...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Фонда CARIPARO No 13/04 и грантом Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza No 10/02. Мартина Пикколи, Кьяра Францин и Микела Поццобон финансируются Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Энрика Бертен финансируется Фондом CARIPARO Грант No 13/04. Паоло Де Коппи финансируется детской благотворительной организацией Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 мм Чашки Петри бактериального качества BD Falcon351029Для дифференцировки in vitro дифференцировка
2-меркаптоэтанола SigmaM6250Для мышиной АФ, iPS-AF клеток и дифференцировочной среды
Alexa568-конъюгированная козья антимышиная IgM Thermo Fisher ScientificA21043Вторичное антитело (иммунофлуоресценция)
Alexa594-конъюгированное куриное антикозье антитело IgG Thermo Fisher ScientificA21468Вторичное антитело (иммунофлуоресценция)
Alexa594-конъюгированное куриное антикроличьи антитела IgG Thermo Fisher ScientificA21442Вторичное антитело (иммунофлуоресценция)
Alexa594-конъюгированное козье антимышиное антитело IgG Thermo Fisher ScientificA11005Вторичное антитело (иммунофлуоресценция)
Набор щелочной фосфатазы Sigma85L1Щелочная фосфатаза  окрашивание
ампициллинаSigmaA0166Для бактериальной селекции
Бычья сыворотка Альбумин SigmaA7906BSA, для решения блокировки. Разведенный в PBS 1x
ХлороформSigmaC2432Для экстракции РНК
DH5&альфа клетокThermo FisherScientific 18265-017Бактерии для процедуры
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Для MEF, мышиного AF, iPS-AF клеток и дифференцировочной среды
Доксициклин SigmaD9891Для экспрессии экзогенных факторов
микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)Сарстедт 72.706Для производства ПБ 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024для мышиных AF, iPS-AF клеток и среды для дифференцировки
FBS Thermo Fisher Scientific10270106для МЭФ средние
тонконаправленные щипцыF.S.TDumont #5 Изоляция ФП
ЖелатинJ.T.Baker131Используется 0,1%, разведенный в PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Для блокировки раствора. Разведенный в PBS 1x
Гематоксилин QSVector LaboratoriesH3404Nuclei Detection
HE Bio-Optica04-061010Гистологический анализ тератомы
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Обнаружение ядер
лошадиной сыворотки Thermo Fisher Scientific16050-122Для блокирующего раствора
HRP-конъюгированный козий антимышиный IgGSantaCruzsc2005Вторичное антитело (иммунопероксидаза)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Пероксидазный субстрат
Инсулиновый шприц с иглой (25 г)TerumoSS+01H25161Процедура амниоцентеза
Klf4 SantaCruzsc-20691Кролик поликлональный IgG
L-глютамин Thermo Fisher Scientific25030Для мышиной AF, iPS-AF клеток и среды для дифференцировки
LB бульон (Lennox)SigmaL3022Для роста бактерий
LIF SigmaL5158Для мышиной АФ и iPS-AF клеток среды
Matrigel BD354234Для дифференциации in vitro. Разведенный 1:10 в DMEM
метанолSigma32213Пероксидаза, блокирующий
MULTIWELL 24 луночный планшетBD Falcon353047Для дифференцировки in vitro
MULTIWELL 6 луночный планшетBD Falcon353046Для MEF, мышиной AF и iPS-AF клеток
культуры Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit поликлональные
заменимые аминокислоты IgG SigmaM7145Для мышиной АФ, iPS-AF клеток и дифференцировочной среды
Нормальная козья сывороткаVector LaboratoriesS2000Для блокирующего раствора. Разведен в PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Для проникновения клеток. Разведенный в PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Мышиный моноклональный IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012для ОТ-ПЦР
Параформальдегид (раствор)Sigma441244PFA, фиксатор, разведенный в PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, без Ca2+/Mg2+. Разведенный стерильной водой для получения PBS 1x
Пенициллин - Стрептомицин Thermo Fisher Scientific15070063Для MEF, мышиной AF, iPS-AF клеток и среды для дифференцировки
Чашка Петри (150 мм)BD Falcon353025Для культуры MEF, культуры тканей
PiggyBac экспрессия транспозазы плазмиды Предоставлено профессором Андрашем Надемlab-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS транспозонная плазмидаПредоставлено профессором Андрашем Надемlab-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Для очистки плазмид
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Для очистки
плазмидТранспозон плазмиды обратного тетрациклина Предоставлено профессором Андрашем Надемlaboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134Для экстракции РНК
Sox2 SantaCruzsc-17320Поликлональный IgG козий
SSEA1 Abcamab16285Мышиная моноклональная IgM
SuperScript II Обратная транскриптаза Thermo Fisher Scientific18064-014для ОТ-ПЦР
T Abcamab20680Кролик поликлональный IgG
Taq ДНК-полимеразаThermo Fisher Scientific10342020ПЦР
Трипсин Thermo Fisher Scientific25300-054Пассирование клеточной культуры
Triton X-100Bio-Rad161-047Для проникновения клеток, разведенный в PBS 1x
TRIzol реагентThermo Fisher Scientific15596-026Для экстракции
Tubb3   Promega G712AМышиный моноклональный IgG1
TWEEN-20SigmaP1379Для пермеабилизации клеток, разведенный в PBS 1x
α ФП&НБСП;    НИР D SystemsMAB1368мышиной моноклональной IgG1
αSMA Abcamab7817Мышиный моноклональный
(FuGENE HD)Promega E2311Для трансфекции клеток АФ
стереомикроскопNikonSM2645Для проведения амниоцентеза 
200 μ l советыSarstedt 70.760012Для сбора колоний бактерий
НожницыF.S.T14094-11 нержавеющая сталь 25UДля проведения амниоцентеза 
ЭтанолSigma2860Для чистки брюшной стенки беременной матери
Культура тканей чашкой Петри (150 мм) BD Falcon353025Для расширения MEF
Mitomycin CSigmaM4287-2MGДля инактивации MEF
MULTIWELL 96 луночный планшетBD Falcon353071Для культивирования iPS-AF
клонирования РНК реагент для трансфекции IgG2a

Ссылки

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.