Методическая статья

Долгосрочный высокого разрешения Прижизненные микроскопии в легких с помощью вакуумного стабилизированный визуализации окна

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54603

⸱

6 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование многофотонной микроскопии для выполнения долгосрочной визуализации интактного легкого с высоким разрешением одной клетки в режиме реального времени с использованием окна визуализации, стабилизированной под вакуумом.

Аннотация

Метастазы вторичных сайтов , таких как легкие, печень и кости является травмирующим событием со смертностью около 90% 1. Из этих сайтов, легких является наиболее трудно оценить с помощью прижизненной оптических изображений из-за его закрытого положения внутри тела, деликатности и жизненно важную роль в поддержании надлежащей физиологии. В то время как клинические методы (позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) и компьютерная томография (КТ)) способны обеспечить неинвазивные изображения этой ткани, у них нет разрешения, необходимые для визуализации самые ранние посевные события, с одного пикселя состоящий из почти тысячи клеток. Современные модели метастатического легких высева постулата, что события только после прибытия опухолевой клетки являются детерминированными для выживания и последующего роста. Это означает , что в режиме реального времени инструменты прижизненной визуализации с одной разрешением ячейки 2 необходимы для того , чтобы определить фенотипы высевающего CELLs и тестировать эти модели. В то время как высокая разрешающая способность оптических изображений легких было проведено с использованием различных препаратов исключая виво, эти эксперименты , как правило , одиночный отсчете анализы и восприимчивы к артефактам и возможных ошибочных выводов из - за резко изменял окружающей среды (температура, обильность, цитокины и т.д. ) в результате удаления из полости грудной клетки и сердечно - сосудистой системы 3. Недавние исследования показали , что в заданный промежуток времени прижизненной оптических изображений интактного легкого можно с помощью вакуума стабилизирован окна визуализации 2,4,5 однако, типичное время обработки изображений было ограничено приблизительно 6 ч. Здесь мы опишем протокол для выполнения долгосрочного визуализации прижизненной замедленную легкого с использованием такого окна в течение 12 часов. В последовательности изображений время покадровой, полученные с помощью этого метода позволяют визуализации и количественного определения межклеточных взаимодействий, динамика мембран и сосудистой перфузии в легких. Мы также dописывать круг методику обработки изображения, которое дает беспрецедентно четкое представление о микрососудов легких.

Введение

Высокое разрешение прижизненной оптических изображений, оказалось иметь решающее значение для понимания многих биологических процессов, что позволяет одноклеточных и субклеточные измеряемые параметры и количественно. В исследованиях рака, прижизненной визуализации опухолей и стромальных клеток привело к открытию многих микроокружения взаимодействий 6-11, которые присутствуют только в интактных животных.

Открытия о микросреды , связанных с intravasation и распространения опухолевых клеток при раке молочной железы с использованием оптических изображений одного элемента разрешения в естественных условиях даже привело к новым маркеров для прогноза и ответа на лечение у больных раком молочной железы 12-16. Лучшие технологии обработки изображений, доступных для просмотра глубоко внутри неповрежденных внутренних жизненно важных органов являются клинические методы (МРТ, ПЭТ, КТ), которые предлагают отличный вид на весь орган и может выявить патологию еще до того, они производят клинические симптомы. Они не в состоянии, чowever, чтобы выявить самые ранние стадии метастазирования и клеточные механизмы вождения прогрессии опухоли из-за их отсутствия одной резолюции клетки. К тому времени, метастазы в легких видны в этих условиях, они хорошо известны, и пролиферирующих. С учетом подсчитали , что 90% диссеминированных опухолевых клеток , которые поступают в легкие либо не выживают 17 или первоначально оставаться в состоянии покоя 18 и наблюдения , что они прибывают намного раньше , чем ожидалось ранее 19 обработки изображений самые ранние этапы прибытия и выживание становится решающим для понимание процесса метастазирования высева и рецидивов роста опухоли в отдаленных местах.

Выполнение этих наблюдений в легких оказалось чрезвычайно трудно, однако; подавляющее большинство исследований визуализации использовали препараты или исключая виво эксплантов 20-23, которые только дают представление в легких в отдельных временных точках. В то время как эти препараты действительно обеспечивают полезную информациюия, они не дают полного понимания взаимодействий, причинно-следственных связей и динамики, которые происходят между различными компонентами микросреды. Отсутствие надлежащей системы кровообращения (и сопутствующего дисбаланса гомеостаза) и отключения от остальной части иммунной системы организма делает его желая подтвердить выводы , что эти препараты производят в неповрежденной ткани в естественных условиях.

Многие группы проводили прижизненной визуализации неповрежденного легкого 2,4,5,24-33 с Wearn и немецком языках является первым хирургическим путем подвергать плевральной слой 24 и Терри первым использовать имплантируемый окно визуализации 25.

Высокое разрешение изображения в легких значительно затрудняется постоянном движении лёгкого и несколько методов, которые были разработаны, чтобы преодолеть это ограничение. Вагнер и Filley 27 изучал естественное движение собачьей легкогои разработали свой хирургический протокол , чтобы определить местонахождение их имплантированный окно над относительно стационарной области в то время как Вагнер используется вакуум в его окне хирургической подготовки к иммобилизации ткани 28. С тех пор различные методы были использованы для получения изображения легких , включая: бронха зажима, последовательного и одышки закрытого типа визуализации, передискретизация приобретение, склейки доли легкого и вакуума 34. Каждая из них имеет свои преимущества и недостатки , и ни одна техника не стала еще выше 34. Например, бронх зажимное и последовательное апное изменять нормальный обмен газов в легких и может вызвать ателектаз. Воротами изображений и передискретизация приобретение не страдают от этих недостатков, но требуют высокой скорости или специализированного оборудования визуализации не широкого доступа. В конце концов обе склеивание легкого и техника вакуума во избежание обоих указанных выше недостатков, но могут проявлять усилие сдвига индуцированное повреждение, если не будут Takэн. В последние годы, окно устанавливается вакуум миниатюризации и адаптирован для использования в мышах с помощью конфокальной микроскопии и многофотонной 4,5,33 и превосходное ни высокая разрешающая способность была достигнута 2. В таблице 1 обобщены эту богатую историю и выдвигает на первый план те бумаги , которые описывают роман достижения в области использования прижизненной окон визуализации легких.

Этот протокол описывает использование расширенного покадровой многофотонная прижизненной микроскопии для метастазирования изображения в живом, неповрежденного легкого с самым высоким разрешением субклеточном возможно. Изображения приобретены до 12 часов с использованием многофотонного микроскопа, оборудованного с высокой числовой апертурой объектива и многократный ФЭУ (ФЭУ) детекторов. Трансгенные мышиные модели используются для флуоресцентно этикетке нативных макрофагов наряду с флуоресцентным высокой молекулярной массы и декстрана флуоресцентный белок, трансфицированных опухолевых клеток (маркировать сосудистую систему и опухолевые клетки respectivelу). В то время как этот выбор флуоресцентно меченых клеток позволяет визуализировать клеток-эндотелиальных клеток-макрофагов взаимодействия опухолевых и динамики, этот протокол будет работать для любого штамма флуоресцентной или нефлуоресцентной мыши. После приобретения, движение остаточного дрейфа (если таковой имеется ) устраняется с помощью Фиджи плагин 35,36 и пользовательские макросы Среднее время сосудистого русла , чтобы устранить мигание , вызванное немеченых циркулирующих клеток крови.

В то время как этот протокол фокусируется на метастазирование визуализации, методы применимы ко многим другим биологическим процессам, наблюдаемых с высокой разрешающей способностью изображений одноклеточного в легком.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные в данном протоколе, были выполнены в соответствии с действующими нормами и правилами для использования позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения колледжа Альберта Эйнштейна медицины Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Создание флуоресцентно меченных модели мышей и опухолевых клеток

  1. Приготовьте 100 мл 0,1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином / фосфатный буферный раствор (БСА / PBS) буфере путем смешивания 0,1 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл PBS.
  2. Готовят флуоресцентно меченных опухолевых клеток путем стабильной трансфекции.
    Примечание: Здесь мы используем E0771-LG клетки, обладающая высокой способностью метастазировать производная E0771 клеток мышей аденокарциномы молочной железы 37 , которые были выделены из метастатических опухолей , разработанных в легких мышей C57BL / 6 мыши внутривенно вводили E0771 клетки родительских 38.
    1. 24 ч до трансфекции, пластина 1 х 10 5 EO771-LG клетки на 60 мм блюдо культуры ткани в по 2 мл antibioкрестики бесплатно 10% ЭБС (эмбриональной бычьей сыворотки) DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
    2. В то время трансфекции инкубировать 2 мкг флуоресцентного вектора белка с 10 мкл реагента для трансфекции в течение 30 мин перед добавлением 190 мкл восстановленного сывороточных средах.
    3. Мытье EO771-LG клетки с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко (D-PBS) один раз и добавьте трансфекции смесь осторожно.
    4. Инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 6 часов.
    5. Промыть трансфектированных клеток и культуры в 2 мл полной среды DMEM (10% FBS, 1 мМ пирувата, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) в течение 2-х дней.
    6. Промыть клетки с 2 мл стерильной PBS, добавляют 500 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубировать в течение 2 мин при 37 ° С.
    7. Сбор клеточной суспензии и смешать с, по меньшей мере 1 объем полной DMEM и спином вниз при 280 х г.
    8. Ресуспендируют клеток в 1 мл полной среды DMEM и расширить культуру клеток в10 см блюдо культуры ткани.
    9. Начать отбор трансфецированных клеток путем добавления 700 мкг / мл G418 селективного антибиотика к 8 мл полной среды DMEM и культуры в течение недели, меняя среду один раз в три дня.
  3. Пополните флуоресцентную популяцию из трансфецированных клеток , которые были под отбора в G418 с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) 39,40.
    1. Промыть клетки с 5 мл PBS и добавляют 1,5 мл 0,25% трипсина.
    2. Инкубировать в течение 2 мин при 37 ° С и смешивают с по меньшей мере одним объемом полной среды DMEM.
    3. Собирают суспензию клеток и спином вниз на 280 XG и вновь приостановить клеток в 1 мл стерильного 0,1% (вес / объем) буфера БСА / PBS.
    4. Фильтр клеточной суспензии через сито 40 мкм и регулировать объем до 1 мл 0,1% BSA / PBS буфера для сортировки.
    5. FACS-сортировки яркое население 10% на основе спектра флуоресценции с использованием FACS сортировщик 41.
    6. Культура отсортированные клетки в течение следующей недели ˙UВыбор NDER (700 мкг / мл G418 в полной среде DMEM).
    7. Выбирать флуоресцентно меченых клеток с помощью проточной цитометрии, повторяя шаги 1.3.1 1.3.6 еще раз.
    8. После второго раунда отбора, Trypsinize, фильтра и повторно приостанавливать клетки в 0,1% BSA / PBS, как описано (шаги 1.3.1-1.3.4). Отрегулируйте концентрацию до 2 × 10 6 клеток / мл для одной клетки сортировочного в 96 - луночные планшеты с помощью сортировщика FACS.
    9. Приготовьте 3-5 96-луночные планшеты с 100 мкл полной среды DMEM для сбора. Для улучшения выживаемости после сортировки, добавьте 100 мкл отфильтрованной культуральной среды из блюд , где клетки EO771-LG выращивали 42.
    10. После сортировки клеток в 96-луночные планшеты, возвращают клетки в культуре в течение 2 -х дней (37 ° С, 5% СО 2).
    11. Выявление скважин с жизнеспособных отдельных клонов путем исследования под инвертированным микроскопом при 5-кратным увеличением.
    12. Trypsinize и расширение жизнеспособных клонов и заморозить клетки для резервного копирования.
      1. Вымойте скважин с гриз-клонов с помощью 100 мкл стерильной PBS. Добавляют 50 мкл 0,25% вес / об трипсина и инкубировать 2 мин при 37 ° С. Добавляют 50 мкл полной среды DMEM и переносят в стерильный V-образным дном или круглым дном 96-луночного планшета для замедления вращения при 280 х г в течение 5 мин.
      2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 700 мкг / мл G418 полной DMEM и пластины каждого клона в 12-луночные планшеты. Добавить 400 мкл полной DMEM с G418 и культуры до вырожденная.
      3. Промыть лунки с 500 мкл PBS, добавляют 100 мкл 0,25% трипсина и инкубировать 2 мин при 37 ° С. Добавьте 100 мкл полной DMEM и спином вниз в течение 5 мин при 280 х г. Ресуспендируют клеток в 100 мкл полной среды DMEM с G418 и пластинчатых клеток в 6-луночные планшеты, пока вырожденная.
      4. После того, как сливающиеся, Trypsinize клетки, спина вниз и ресуспендируют в 10% ДМСО в ФБС, чтобы заморозить запасы клеток.
      5. Хранить 1/10 Суспензии клеток в культуре, высевая их в 100-мм чашки для культивирования тканей для оценки их метастатического потенциала.
  4. Испытание метастатического потенциала отобранных клонов.
    1. Trypsinize и повторно приостанавливать клеток в физиологическом растворе до концентрации 2,5 × 10 6 клеток / мл и вводят 200 мкл в мышей C57BL / 6 внутривенно через хвостовую вену.
    2. После 2 -х недель, собирают легочной ткани , как было описано выше 23 и количественной оценки опухолевой нагрузки по количеству поверхностной или стереологического методом 43. Выберите клоны с высоким метастатическим потенциалом для прижизненной визуализации.
  5. Поднимите MacBlue (миелоидной специфический промотор , запускающий голубой флуоресцентный белок (СФП) выражение (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) репортер мышей 44.
    Примечание: Как правило, мышей от 8 до 12 недель используются, но мышей уже 7, а уже в 20 недель были протестированы на работу, а также.

2. Многофотонная Микроскоп Настройка и обработки изображений Подготовка

Примечание: В то время как этот протокол может быть выполнена на любом тultiphoton микроскоп, система , используемая для получения данных , показанных в этом протоколе было описано ранее подробно 45.

  1. Включите все микроскопа и лазерных компонентов, включая двухфотонными лазеров и детекторов, по крайней мере на один час вперед нужного времени визуализации.
  2. Непосредственно перед операцией, измерить мощность светового ввода в микроскоп, поместив головку измерителя оптической мощности на пути луча непосредственно перед микроскопом и настраивайте зеркало лазера конца полости ручки до максимальной интенсивности света при 880 нм считывается на оптический измеритель мощности.

3. Вакуумная система Настройка

  1. Клей покровное в окно обработки изображений (Справочная Рисунок 1) с цианоакрилату. Позвольте по крайней мере 4 часа для клея полностью высохнуть.
    Примечание: Этот шаг также может быть сделано раньше времени.
  2. Вырезать 100 мкл кончиком пипетки на первой линии от небольшого отверстия и соединить режиссерский конец тонкой Vacuum шланг.
  3. Подключение вакуумной системы в соответствии с рисунком 1 и 2 Дополнительное рис.
  4. С помощью вакуума на и открытым концом заблокирован, отрегулируйте регулятор вакуума для <3 INhg.
    Примечание: Заключительная регулировка уровня вакуума будет осуществляться путем наблюдения сосудистой сети в естественных условиях.
  5. Нанесите тонкую пленку петролейного смазки на нижней стороне пластины формирования изображения для предотвращения линзы объектива иммерсионной среды от будучи злы прочь от пластины формирования изображения.
  6. Поместите пластину формирования изображения на предметный столик микроскопа.
    Примечание: пользовательские изображения пластины (Справочная рисунок 3) представляет собой лист толщиной 1/8 " из алюминия механической обработке и , чтобы поместиться в стадии вставки пространства и со сквозным отверстием в центре для проведения окна изображения.
  7. Вставьте окно вакуума в визуализации пластины с покровным вниз.
  8. Стерилизовать все поверхности и инструменты, включая стадии формирования изображения пластины, и выиграть изображенияДау с 70% -ным этанолом.
  9. Подключение отрезанный конец наконечника пипетки к окну вакуума и заклеивание шланг вниз к пластине формирования изображения.
  10. Принесите объективный близко к окну изображения и поместить большую каплю воды между объективом и покровное.
  11. Убедитесь в том, что нет утечек из покровного, блокируя центральное отверстие окна вакуума и проверки того, что капли воды между объективом и покровного не получает отсасывают.
    ПРИМЕЧАНИЕ: старый стиль компьютера мяч мыши помещается над окном полезно для блокировки центрального отверстия.

4. Хирургическое лечение

  1. Подготовьте стерильный хирургический участок.
    1. Поместите все инструменты в пределах легкой досягаемости. Стерилизовать всех поверхностей и инструментов, в том числе хирургической области и хирургических инструментов с 70% этанола.
  2. Свяжите 3 дюйма длиной 2-0 швом к катетеру, ¼ дюйма над втулкой с двойным узлом.
  3. Подготовить хвостовую вену катетер ВОЛПмычание опубликованный протокол по Гарни и др. 46.
  4. С помощью инфракрасного (ИК) лампу высокой температуры, прогреть животное в своей клетке в течение ~ 5 мин, чтобы увеличить кровоток в хвостовую вену и, чтобы помочь в установке катетера. Рекомендуется держать животное подогревают до физиологических температур на протяжении хирургической процедуры с использованием либо тепла лампы или согревающий площадку.
  5. Обезболить животное с 5% изофлуран и убедитесь, что нет ответа на носок крайнем случае.
  6. Применение глазной мази для глаз животного.
  7. Нанесите лосьон для удаления волос в течение 10-30 сек, чтобы удалить волосы с левой стороны животного; от средней линии груди до ¼ спины и от подмышки только под ребрам.
  8. Очистите излишки лосьона и стерилизовать открытые участки кожи с 70% -ным спиртом.
  9. Приложите стерильный шприц , заполненный PBS в вену катетер хвоста и вставить и ленты в месте после опубликованного протокола по Гарни и др. 46. Убедитесь, что лента надежно приклеена к самой игле и не свободен в зазоре между хвостом и лентой.
  10. Интубации мыши следующие либо опубликованного протокола по Дас и др. 47 или по DuPage и др. 48
  11. Включите вентилятор и установите его на поставку 135 вдохов в минуту и ​​200 мкл смеси изофлуран-кислород.
  12. Подключите трахеи катетер к вентилятору.
  13. Подведите указатель мыши к хирургической области. Проявляйте особую осторожность, чтобы не сместить катетер.
  14. Свяжите 2-0 шовного материала вокруг морды мыши под передним зубам.
  15. Лента катетер к морде.
  16. Лента передней левой лапы к катетеру, чтобы держать его из операционного поля.
  17. Опустите изофлуран анестезии до уровня обслуживания 2,5% и убедитесь, что нет ответа на носок крайнем случае.
  18. Используя острые ножницы, удалить 1 см 2 кожи над левой грудной стенки.
  19. Лифт тон молочной жировой ткани и прижигают оголенным кровеносные сосуды с прижигания пера.
  20. Резекцию жировой ткани путем разрезания с острыми ножницами.
  21. Удалите мышечный слой вплоть до грудной клетки путем разрезания с острыми ножницами. Позаботьтесь, чтобы не порезать вены работает подмышечную у основания передних конечностей.
  22. Используйте пинцет , чтобы захватить и поднять 6 - го ребра. Используя острые ножницы, проводимых под небольшим углом (~ 5 °) перерезал ребро вблизи края отверстия в коже. Проявляйте особую осторожность, чтобы не прикасаться к легочной ткани.
  23. Расширьте отверстие в стенке грудной клетки, чтобы выставить всю мочку легких путем удаления четырех последовательных ребра.
    Примечание: Держите отверстие не менее 5 мм от грудины, чтобы избежать сердца.
  24. Осторожно поднимите мышь, взявшись за хвост и трахеи катетер и переместите мышь на сцену визуализации микроскопа.
  25. С помощью вакуумного отключения, заполнения камеры вакуумного окна с PBS.
  26. Переверните мышь и положение обнаженныйлегкого над окном вакуумной обработки изображений.
  27. Медленно включите вакуум примерно 3-5 дюймов ртутного столба с использованием шаровой кран.
  28. Поместите жгут сдерживающее изготовленную из папиросной бумаги , сложенный вдвое дважды над грудной клеткой мыши и ленты на плиту , как показано на рисунке 2 Дополнительной.
  29. Закрепите датчик бедре пульсоксиметром к верхней части бедра животного и запустить программное обеспечение.
  30. Поместите экологическую камеру на сцене и включите тепла для поддержания мыши при физиологической температуре.
  31. Снизить уровень изофлюрана до 1-1,5% для поддержания анестезии и поддержания кровотока.

5. витальных изображений

  1. Принесите 25 х 0,95 числовой апертуры (NA) линзы объектива рядом с покровным и добавить большую каплю воды между ними.
  2. Использование режима эпифлуоресцентной, просмотра канала FITC и довести ткань легкого в фокусе.
  3. Если это не сделано до операции, яnject опухолевые клетки через хвостовую вену катетер.
    1. Отсоедините шприц PBS из хвостовой вены катетера.
    2. Загрузите стерильный шприц с 100 мкл суспензии опухолевых клеток (2 × 10 7 клеток / мл в PBS максимум).
      Примечание: Этот шаг может быть сделано заблаговременно, чтобы изучить приход раковых клеток в легких в различные моменты времени.
    3. Соедините шприц с опухолевыми клетками на хвостовую вену катетер.
    4. Медленно вводят опухолевые клетки в хвостовую вену.
    5. Отсоедините шприц с опухолевыми клетками из хвостовой вены катетера.
    6. Снова подключите шприц PBS в хвостовую вену катетер.
      Примечание: Определить местоположение всех опухолевых клеток перед инъекцией декстран, как становится трудно отличить опухолевые клетки от декстрана сигнала через окуляр после инъекции.
  4. Расположить опухолевых клеток к изображению
    1. Для визуализации отдельных опухолевых клеток, обнаружить все опухолевые клетки и записывают их местоположения с гоэлектронной многоточечной панели программного обеспечения.
      1. Найдите все поля зрения для изображения путем наблюдения опухолевые клетки в микроскоп окуляром.
      2. В программном обеспечении, переключиться на панель многоточечной, нажав на кнопку многоточечного и сохранить расположение ячейки, нажав на кнопку Add Position.
    2. Для мозаики изображений, найти происхождение мозаики и установить координаты изображений
      1. Найдите позицию в верхнем левом углу структуры для захвата.
      2. Нулевые х, у и г координаты сцены, нажимая на кнопку «ноль» на контроллере этапе.
      3. Загрузите соответствующий список мозаичных координат, нажав на кнопку "Загрузить" и выберите из списка.
        Примечание: Пример списка для 2 × 2 мозаики с 20% перекрытием поля 500 мкм зрения на бы: Поз.1 = (0,0), поз. 2 = (400,0), поз. 3 = (0400), поз. 4 = (400400).
  5. Удалите шприц шIth PBS в вену катетера хвост и заменить шприц, содержащий декстран.
  6. Медленно вводят до 100 мкл 20 мг / мл 155 кД родамина-декстрана, растворенного в PBS в мышь через хвостовую вену катетер с последующей инъекцией 50 мкл стерильной PBS для промывки линии. Не вводить никаких пузырьков в линию. При необходимости, вводят декстран-по крайней мере, через один час после инъекции клеток рака так, чтобы общий объем вводилась мышам, не превышает 4 мл / кг / час.
  7. Настройка параметров визуализации.
    1. Включите микроскоп многофотонной режим.
    2. Установите зум до коэффициента 2X, нажав на кнопку сигналы синхронизации и обновления поле Коэффициент увеличения.
    3. Отрегулируйте мощность лазера до ~ 10% (~ 10-15 мВт на образце), нажав на кнопку детекторов и лазерной и затем отрегулировать ползунок питания Tsunami до 10.
  8. Изображение каждое место, чтобы проверить наличие опухолевых клеток и визуализировать поток и целостность vasculature.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Суда должны появиться полностью озарен проточных эритроцитов и флуоресцентный декстран должны содержаться в сосудах без утечки к экстраваскулярных пространств. Примерно 10 - 20 опухолевые клетки, как ожидается, будет в пределах апертуры окна вакуума.
  9. Отрегулируйте начальную глубину каждого места, чтобы быть отображены.
    1. Для каждого места, отрегулируйте положение г, вращая ручку фокусировки на контроллере ступени к изображению верхний срез клетки опухоли.
    2. Поместите ячейку в центре поля зрения.
    3. Нажмите на кнопку Multipoint нажмите на позиции поля зрения, чтобы выделить его и нажмите Add затем кнопку Delete, чтобы заменить сохраненную позицию ячейки в списке многоточечной.
    4. Визуально наблюдать относительную яркость опухолевой клетки в каждой позиции.
  10. Сохраните новые местоположения каждой из ячеек, нажав на кнопку Сохранить в панели многоточечномуd указать имя файла.
  11. Для визуализации отдельных опухолевых клеток, выбрать три клетки приблизительно эквивалентной яркости и удалить все другие места из списка многоточечной, нажав на их месте в списке, а затем нажав на кнопку Удалить.
  12. Нажмите на кнопку детекторов и лазерной и отрегулируйте ползунки для усиления ФЭУ из зеленого и красного каналов 45 , так что сигналы ниже насыщения.
  13. Отрегулируйте ползунок для синего канала 45 так , что макрофаги появляются бирюзового.
    Примечание: Любой второй гармоники сигнала появляется только в синем канале и может быть отделен от бирюзового макрофагами, следуя процедуре канала вычитания ранее описанный 45.
  14. Установите глубину начала г-стек до 0 мкм и конечную глубину до 24 мкм при движении ступени г к месту и нажав на кнопку в начале и конце кнопки соответственно.
    Примечание: Ячейки в пределах этой глубины будут визуализированы с лучшим сигналом дляшум и разрешение.
  15. Установить размер шага г до 3 мкм.
  16. Установить параметры визуализации следующих параметров ранее описанных 45,49.
    1. Для визуализации отдельных опухолевых клеток, нажмите на кнопку сигналы синхронизации, а затем введите 4 V в поле Коэффициент масштабирования (что эквивалентно коэффициент увеличения 1.5X), введите 3 в поле средних кадра и нажмите на кнопку Time-Lapse и введите 10 в поле Время покадровой.
      Примечание: Эти настройки будут приобретать 1 кадр каждые 3 сек.
    2. Для мозаики изображений, нажмите на кнопку сигналы синхронизации и введите коэффициент масштабирования 1,5 В (эквивалентно коэффициент увеличения 4Х), введите 3 числа средних кадров и нажать на кнопку ЗАМЕДЛЕННАЯ и введите 10 в Time- истечь поле время задержки.
      Примечание: Эти настройки будут приобретать 1 кадр каждые 3 сек.
  17. Включение многоточечного, Z-стек и режимы визуализации т покадровой, нажав на их кнопки.
  18. Нажмите на кнопку записи для получения изображений.
    НЕE: Легочная ткань очень нежна и чувствительна к фото-повреждениям. Если после того, как поток времени покадровой визуализации крови останавливается в изображаемой области, лазер, скорее всего, слишком высока и последующее изображения других полей должно быть сделано при более низкой мощности.
  19. Каждый 30-45 мин, медленно вводят 50 мкл PBS или физиологический раствор для поддержания гидратации животного.

6. Эвтаназия

  1. Увеличение изофлуран до 5%.
  2. Держите животное под 5% изофлуран до 30 секунд после того, как она перестает дышать и удалить животное со сцены.
  3. Выполните шейки дислокации, чтобы обеспечить полную эвтаназию.

Анализ 7. Изображение

  1. Для экспериментов одиночных изображений клеток:
    1. Загрузка изображений в Фиджи и отформатировать их как HyperStack.
    2. Для каждого г среза в HyperStack, играть Промежуток времени фильм и искать остаточного движения ху. Если остаточное движение ху найден, применить плагин называется StackReg 36 в стекеустранить движение.
  2. Для мозаичных изображений экспериментов:
  3. Загрузка изображений в Фиджи и сшить их вместе, открыв Мозаика Строчка макросъемки (Дополнительный файл кода Мозаика стежками) и ввода информации об изображениях, таких как каталог, имя базового файла, число х и у полей в мозаике и количества ломтиков и моменты времени.
    Примечание: Из-за того, как Java интерпретирует каталоги, имена папок должны иметь два обратных слеша как подпапке сепараторов. Из-за ограничений в области встроенного плагина Попарном колющие, имена файлов базы не должен содержать тире.
  4. Для того, чтобы получить четкое представление о границах сосудистую систему, в среднем вместе все моменты времени для канала крови в одно изображение, а затем повторить это изображение в качестве фона для каждого кадра из фильма других каналов.
    Примечание: Это делается просто запустив Perform крови Усреднение макрос (Дополнительный файл кода Выполните крови Усреднение).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать тип результатов , которые могут быть достигнуты с помощью этого метода, мы вводили опухолевые клетки , E0771-LG , меченных флуоресцентным белком Clover в хвостовую вену мышей MacBlue 44 в переменных точках времени до операции. После операции 155 кД родамина маркированы декстран вводили IV маркировать сосудистую и замедленная изображения была выполнена.

При визуализации мышей через 24 ч после...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Высокое разрешение в естественных условиях оптической визуализации в сочетании с флуоресцентно меченных функциональных тегов , таких как белки и антитела резко возросло наше понимание метастатического каскада. Это дало возможность прямой визуализации и количественной оценки одноклеточных и субклеточных параметров в опухолевых клетках, клетки-хозяева и их микросреды. Эта визуализация в пределах первичной опухоли привело, например, к открытию дискретных микросреды, которые поддерживают либо инвазии роста или расп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано NIH-CA100324, грантом поддержки онкологического центра Национального института рака Эйнштейна P30CA013330, R01CA172451 JWP и Интегрированной программой визуализации. Эта технология была разработана в Центре биофотоники Грусса-Липпера и в рамках Интегрированной программы визуализации в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна. Мы признательны за поддержку этих Центров в этой работе. Авторы благодарят Майка Роттенкольбера, Рикардо Ибагона и Энтони Легджадро из механической мастерской Эйнштейна за их умелое и своевременное мастерство, лабораторию Мэтью Круммеля за щедрые чертежи дизайна окон, Кевина Эличери и Джереми Бредфельдта за их опыт в микроскопии и рекомендации по усилителям, а также Эллисон Харни и Бояну Глигориевич за содержательные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вакуумный регулятор из никелированной латуни 1/8 NPT с внутренней резьбой, с манометром, 0 - 20" Hg VacuumMcMaster Carr4172K12 Вакуумный регулятор
Латунный фитинг для шланга с зазубринами для шланга 1/4" ID x 1/8" NPTF наружная трубаMcMaster Carr5346K13Адаптер для шланга вакуумного регулятора
Фильтрующие колбы марки Pyrex с трубчаткой; Горловина протулка под резиновую пробку No4; Емкость: 50 млCorning Life Sciences Glass5360-50Вакуумная колба
Круглое стекло Покровные стекла Толщина #1,5, 0,16 - 0,19 мм 10 мм в диаметре.Тед Пелла, Инк.260368Чехлы
Exel International Одноразовые сейфы для внутривенных катетеров; 22 г x 1 дюйм;Exel International26746Катетер для трахеи
PERMA-HAND Черные плетеные шелковые шовные материалы, ETHICON LIGAPAK Размер дозирующей катушки 2-0VWR95056-992
Струнный жидкий суперклей, прозрачный, 0,14 унцииHendel Corp.LOC1647358Цианоакрилатный клей
тетраметилродамина изотиоцианат; DextanSigma-AldrichT1287-500MG155 kD
Лабораторная прозрачная трубка из ПВХ Tygon, 1/16 дюйма ID, 1/8 дюйма OD, толщина стенки 1/32 дюйма, длина 25 футовMcMaster Carr5155T12Тонкая трубка и ; Трубка для
устойчивой к растрескиванию полиэтиленовой трубки Luer, внутренний диаметр 1/8 дюйма, внешний диаметр 1/4 дюйма, толщина стенки 1/16 дюйма, белый, длина 50 футов Макмастер Карр5181K24 Толстые трубки
Депилляторный лосьонNair-Micro
Медицинская трубка 95 Дюрометр LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1Трубка для катетера в хвостовую вену
30 G x 1 дюйм BD PrecisionGlide NeedleBD305128Иглы для катетера хвостовых вен
Puritan Nonsterile Cotton-tipping Тампоны Fisher Scientific867WCNOGLUE
Прозрачный поликарбонатный фитинг с колючей трубкой, редукционный прямой для трубки 3/32" x 1/16" IDMcMaster Carr5117k51Соединители между трубками
Резиновые пробки с одним отверстиемFisher Scientific14-135FСтопор для вакуумной колбы
SHARP Прецизионные барьерные наконечники, для P-100, 100 и микро; lDenville Scientific Inc.P1125наконечником для пипетки
Fisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Opthalmic Othalmic Ointation
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cactery Pen
Graefe Micro Disсекционные щипцы; Зубчатый; небольшой изгиб; Ширина наконечника 0,8 мм; Длина 4 дюймаRoboz SurgicalRS-5135 щипцы
Сверхтонкие микродиссекционные ножницы 4 " Прямые острые/острые 24 ммRoboz SurgicalRS-5912Острые ножницы
Микродиссекционные ножницы 4" Прямые тупые/тупыеRS-5980Тупые ножницы
салфеткиFisher Scientific06-666-A упряжь
Система PhysioSuiteKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
1 мл Шприц, туберкулиновый наконечникBD309659Шприц
ЦианоакрилатСкобыLOC1647358крышки Клей
Клей ВазелинFisher Scientific19-086291Адаптер для водного
барьера Luer Cannulla 1,5 - 2,2 ммГарвардский аппарат734118Коннектор катетера
PhysioSuite MouseSTAT пульсоксиметрKent ScientificПульсоксиметр
Изоэтезия (изофлуран)Henry Schein Animal Health50033250 мл
КислородTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
ПВХ шаровой кран, нажимной для подключения, 1/4 ВГрейнджер3CGJ7Вакуумный клапан
Аппарат искусственной вентиляции легких для мелких животныхHarvard Apparatus683Альтернатива доступна в Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985062 
Реагент для трансфекции Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J MiceJackson Laboratory026051 
Многофотонный микроскопOlympusFluoview FV1000Альтернатива специально изготовленному эндоскопу
Экологический корпусПрецизионная пластиковаякамера для FV1000Альтернатива изготовленному на заказ корпусу
Фосфатный буферный физиологический растворThermoFisher Scientific14190136
Лазерный измеритель мощностиКогерентноеполеMaxIITOP
Лазерный измеритель мощности головкакогерентныйPM10
pcDNA3-клевер флуоресцентный белоквектор Addgene40259
G418 сульфатный селективный антибиотикThermoFisher Scientific10131027
MoFlo флуоресцентно-активирующий сортировщик клеток Beckman CoulterXDP
Trypsin EDTA 1xCorning25-052-Cl
40 &микро; m MeshFalcon352235
96 лунок ТарелкаCostar3599
60 мм Чашка для культурыCorning430196
10 см Чашка для культурыCorning353003
Сыворотка крупного рогатого скота АльбуминSigma-AldrichA4503
Фосфат Дульбекко Буферный Солевой Раствор 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J Мышинаялаборатория Джексона000664 
Ким ВайпсФишер Сайентифик06-666-A 
Лабораторная лента с роботизированные хирургические

Ссылки

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Z

Похожие статьи