Методическая статья

Патч зажим Запись Starburst амакриновые клетки в плоскопанельных горе Подготовка деафферентированной Mouse Retina

DOI:

10.3791/54608

⸱

13 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол показывает, как выполнить цельноклеточной записи патч зажим на нейроны сетчатки из плоского монтажа подготовки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сетчатка млекопитающее представляет собой слоистую ткань состоит из нескольких типов нейронов. Чтобы понять, как визуальный сигналы обрабатываются в пределах своей сложной синаптической сети, электрофизиологические записи часто используются для изучения связи между отдельными нейронами. Мы оптимизировали препарат плоским крепление для патч зажим записи генетически маркированных нейронов в обоих GCL (слой ганглиозных клеток) и INL (внутренний ядерный слой) сетчаток мыши. Запись INL нейронов в плоских монтирует отдается предпочтение по сравнению ломтиками, потому как вертикальные, так и боковые соединения сохраняются в предыдущей конфигурации, позволяя схемы сетчатки глаза с большими боковыми компонентами, которые будут изучены. Мы использовали эту процедуру, чтобы сравнить ответы зеркально-Partnered нейронов в сетчатке, таких как холинергических звездообразования амакринных клеток (мешочков).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как легкодоступная часть центральной нервной системы, сетчатка на протяжении десятилетий была полезной моделью в исследованиях в области нейробиологии. Генетическая маркировка нейронов позволила детально охарактеризовать синаптические связи в сетчатке. Благодаря множеству доступных методологий для изучения функции и морфологии нейронов сетчатки, техника записи с помощью патч-зажима сыграла важную роль в нашем современном понимании вертикально передаваемых сигналов в сетчатке. Эти сигналы исходят от поглощения фотонов фоторецепторами и направляются в зрительные центры мозга через спайковые ганглиозные клетки сетчатки (РГК). Несмотря на большой объем знаний, накопленных к настоящему времени, нейронное разнообразие в васкуляризированной сетчатке млекопитающих остается нерешенным и препятствует полному пониманию цепей сетчатки, которые обеспечивают нормальное зрение. Отчасти это связано с тем, что большинство записей было выполнено на срезах сетчатки для обмена целостности латеральной цепи на доступ к более проксимальным нейронамсетчатки 1-3. Таким образом, чтобы получить полную картину того, как сетчатка воспринимает зрительные сигналы, желательно записывать нейроны в плоских креплениях, где боковые связи, большие и маленькие, могут быть лучше сохранены.

Когда синаптическая передача от фоторецепторов к биполярным клеткам прерывается из-за дефектного сигнального пути метаботропного глутаматного рецептора 6 (mGluR6) в деполяризующихся биполярных клетках4-6 или просто в результате потери фоторецепторов в дегенерированных сетчатках7-10, многие РГК проявляют колебательную активность. Эти колебания происходят из нескольких источников, однако наибольшее внимание привлек тот, который связан с соединением щелевого перехода между амакриновыми клетками AII (AII-ACs) и биполяризующими биполярными колбочками (DCBC) и, следовательно, является наиболее понятным1,7,11. Мы обнаружили еще один источник, который сохраняется при фармакологической блокаде вышеупомянутой сети AII-AC/DCBC и вызывает колебания SAC типа OFF у мышей RhoΔCTA и Nob с деафферентированной сетчаткой7,8,12. Здесь мы подробно описываем наш протокол подготовки плоских креплений сетчатки для записи нейронов INL. В этом подходе используются коммерческие линии мышей (прикладные номера Jax 006410 и 007905) для маркировки холинергических нейронов сетчатки экспрессией флуоресцентного белка (tdTomato), которая может быть идентифицирована под флуоресцентным микроскопом, оснащенным контрастной оптикой. Ранее сообщалось о некоторых экспериментальных результатах, полученных с помощью этогоподхода4,5,7,13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этическое одобрение - процедуры, связанные с субъектов животных были проведены в соответствии с нормами и правилами Национальных институтов здравоохранения руководящих принципов для исследований животных, утвержденные институциональном ухода за животными и использовать комитет из Медицинского колледжа Бэйлора.

1. Внешние и внутренние решения

  1. Используйте раствор Рингера млекопитающих во время рассечения сетчатки глаза и в качестве внешнего решения в последующем электрофизиологические записи. Приготовьте раствор Рингера млекопитающих от 10x маточного раствора (без кальция) в день записи, а также добавлять CaCl 2 по каплям через 15 мин carbogenation (95% O 2 и 5% CO 2). Окончательный 1x раствор содержит (в мМ): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 и MgSO 4 10 D-глюкоза.
  2. Используйте два внутренних решений для характеристики SAC колебаний. Контрольная работаполезность приготовленных растворов в длительных цельноклеточная записей патч зажим на ГКС мыши взрослых и хранить верифицированные порции в 500 мкл аликвотах при -20 ° С до использования.
    1. Для записи мембранного потенциала колебаний, используют внутренний калий раствор на основе, содержащий (в мМ): 125 К-глюконат, 8 NaCl, 4 АТФ-Mg, 0,5 Li-ГТФ, 5 EGTA, 10 HEPES и 0,2% biocytin (вес / V). Доведения рН до 7,3 с помощью КОН.
    2. Для записи возбуждающих и тормозных постсинаптических токов, используют цезий на основе внутреннего раствора, содержащего (в мМ): 100 Cs-метансульфонат, 8 NaCl, 4 АТФ-Mg, 0,5 Li-ГТФ, 5 EGTA, 10 HEPES и 0,2% biocytin ( вес / объем). Отрегулируйте рН до 7,3 с CsOH.

2. Подготовка к Дню записи

  1. Для того, чтобы подготовить нитроцеллюлозную мембрану с открытыми отверстиями, вручную пробивать мембраны с индивидуальным перфоратор, выполненной из затупленного 16 G иглой шприца и придавить мембрану между двумя чистыми стеклянными пластинами. Для общеправительственногокрепление сетчатку, чтобы центральное отверстие диаметром 0,2 мм и окружают его на 4 больших отверстий, которые 1-1,2 мм в диаметре.
  2. Для того, чтобы индивидуальные засыпки нить для загрузки внутреннего раствора в электродах, растопить 10 мкл кончиком пипетки в середине и слегка удлинить растопленное часть, пока она не остывает и затвердевает. Непосредственно перед использованием, используйте чистую лезвие для обрезки нити, пока не будет немного длиннее, чем патч-пипеток.
  3. Извлечь патч пипетки в программируемом съемника из боросиликатного стекла трубки с внутренней нитью. Производство в микропипетки на день эксперимента и использовать их немедленно.
    Примечание: Для записи УКД, мы используем следующие настройки: Съемник тепла: 484; тянуть: 0; скорость: 25; время задержки: 1; давление: 400 и значение рампа 462. OD и идентификатор боросиликатных трубок 1,65 мм и 1,0 мм соответственно. Сопротивление пипеток составляет 10-14 МОм.
  4. Один час до сбора урожая ткани, разморозить трубу внутреннего раствора Шекинг его на вихрь в течение> 30 мин.

3. Retina Вскрытие

  1. Обезболить животное на 4% изофлуран в кислороде, пока животное не теряет способность реагировать на носок щепотку. Жертвоприношение животного путем смещения шейных позвонков.
  2. Отрезать обе глазные яблоки прочь зрительных нервов на уровне 1-2 мм от зрительного нерва головок с прямыми однонаправленным ириса ножницами.
  3. Кидайте глазные яблоки на бумажное полотенце, чтобы удалить чистую кровь, а затем погрузить их в раствор carbogenated млекопитающих Рингера. Удар отверстие на лимба с 23 G иглой и рассекают глазные яблоки разрезанием вдоль лимба с микро-ножниц. Удалите роговица и хрусталик с использованием тонких щипцов.
    1. Для сетчатки глаза целом монтажа, аккуратно очистить всю сетчатку выключить пигментного эпителия с тонким пинцетом и сделать четыре 1.5-2 мм ортогональные разрезы от края к головке зрительного нерва.
  4. Погрузите пробитое нитроцеллюлозную мембрану в блюдо и аккуратно перетащить на сетчатку над ней сGCL стороной вверх. Установите головку зрительного нерва в центральное отверстие при подготовке целого монтажа сетчатки глаза. Перенесите мембрану с сетчаткой в ​​другую чистую чашку. Аккуратно придавить сетчатку с тонкой кистью, чтобы выглядеть как мальтийский крест и положи все четыре ребра над отверстиями.
    1. Если часть сетчатки подлежит рассмотрению в то время, разрезать каждую окуляр, полученный из шага 3.3 в 3-4 штуки с бритвенным лезвием с пигментный эпителий остается прикрепленной. Защитите неиспользованные части от света в carbogenated внешнем растворе и использовать их в течение 12 часов.
  5. Пятно нитроцеллюлозную мембрану с куском сухой фильтровальной бумаги и удалить стекловидное и внутреннюю ограничивающую мембрану с пинцетом и кисточка.
  6. Убедитесь, что все ребра сетчатки полностью прикреплены к мембране перед передачей в сборе в записи камеры с запаянной стеклянной крышкой скольжения в нижней части. Закрепите мембрану с вакуумной смазкой к покровным и rehydratе сетчатку с внешним раствором. Будьте осторожны, чтобы не поймать пузырьки воздуха находящиеся под узлом.
  7. Установите камеру на сцену вертикального микроскопа. Заливать камеру с теплым (34-35 ° C) carbogenated внешнего раствора со скоростью ~ 3 мл в мин.
  8. Осмотрите сетчатку под 10-кратным объективом, а затем использовать 60x водно-иммерсионной линзу, чтобы увидеть GCL и INL нейроны под дифференциального интерференционного контраста (DIC) и / или эпифлуоресцентной. Для визуализации tdTomato-экспрессирующих мешочков использовать белый светодиодный источник света в сочетании с фильтром возбуждения 554 нм и фильтр эмиссии 581 нм.

4. цельноклеточной патч зажим Запись от плоскопанельных горы Retina

  1. Фильтр внутреннего раствора через шприц-фильтр в пользовательских засыпки нити.
  2. Вставьте нить в свежего разливного микропипетки и дозировать внутреннего раствора вблизи наконечника до тех пор, пока раствор не покрывает провода электрода серебро для>5 мм. Закрепить микропипетки на электрододержатель с всасывающим полюсом, через который под давлением внутри электрода можно регулировать с помощью толкания или вытягивания поршня из трубки соединенных 10 мл пластмассовый шприц.
  3. Найти пипетку под цели и довести его до ~ 100 мкм над сетчаткой. В режиме тока повторителя (I = 0), используйте смещение по постоянному току к нулю, стоящий сигнал постоянного напряжения. Измерьте сопротивление пипеток под токовыми клещами режиме (I зажим) путем введения фиксированной амплитуды волны квадратных токов через пипетку в то время как он находится в ванне и нейтрализовать разницу поворотом ручки rРаботайте с . Используйте чтение на ручке rРаботайте с, чтобы вычислить сопротивление пипеток по закону Ома.
  4. Медленно довести электрод до ~ 10 мкм выше сетчатки. Применение положительного давления на электрод. Смотрите изменения отражения вблизи кончика пипетки по мере приближения к сетчатке. Быстро, но осторожно заставить пипетку в GCL и уменьшить положительный pressuповторно немедленно.
  5. Переместите пипетку к меченым нейроне. Избегайте контакта с другими нейронами, кровеносные сосуды и endfeet клеток Мюллера. Применить более положительное давление, если это необходимо для предотвращения электрода засорения.
  6. Поместите наконечник вблизи средней линии меченым нейроне, пока ямочка не видно. Освободить положительное давление и позволить плазматическую мембрану отскакивать обратно на кончик пипетки.
  7. Применить от 20 до 120 Pa отрицательные токи пипетку, чтобы помочь формированию гига-ом печатью. Применить нежный всасывания, при необходимости, чтобы вытащить плазматическую мембрану в пипетку. Подождите, через 5 мин после формирования уплотнения к разрыву клеточной мембраны. Это позволяет пролил внутреннее решение быть очищены от суперфузии. Разрывают мембрану нежным всасыванием.
  8. После разрыва мембраны и в то время как в текущем режиме зажим, переключатель на мосту баланса и настроить его с помощью ручки rРаботайте с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленькой камере, как САК, требуется только незначительная корректировка, если таковые имеются. Alternнительно, запись возбуждающие и подавляющие постсинаптические токи в режиме зажима напряжения (V Clamp), удерживая ячейку при обращении потенциалов хлорида (около -75 мВ) и глутамат (около 0 мВ), соответственно. Проверить и отрегулировать положение пипеткой в ​​случае необходимости, чтобы приспособить случайные сетчатку и / или дрейф Микроманипулятор.
  9. Для записи мембранного потенциала или изменение тока до, во время и после медикаментозного лечения, подготовки синаптические блокаторы (например, CNQX, АП5, пикротоксином, тубокурарин и т.д.) и модуляторы каналов (например, флупиртин, допамин, меклофенамовая кислота и т.д.) свежие на день эксперимента из замороженных запасов. Развести препараты с раствором carbogenated Рингера. Применяют их в периодическом режиме через перфузией.
  10. После записи, осторожно удалите пипеткой из сомы. Перенести сборку из камеры в чистую посуду. Отделить и повторно прикрепить сетчатку на другую уплощенной нитроцеллюлозную мембрану без пробивки холэс обеспечить плоскостность сетчатки глаза во время фиксации.
  11. Закрепить сетчатку, погрузив его в 4% параформальдегид в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалить сетчатку от нитроцеллюлозной мембраны и промойте его экстенсивно с 1x PBS. Показывают морфологии записанных клеток O / N окрашивания стрептавидином красителя конъюгированных с разведенной в 1x PBS с 0,4% тритона Х-100 при температуре 4 ° C 14. Установите сетчатку в antifade среде и наблюдать записанные клеток с использованием сканирующей конфокальной микроскопии.
    Примечание: Процедуры, связанные с параформальдегида, который является летучими и токсичными, следует проводить в проекте камеры для безопасности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичные записи балансовые и УКД OFF-типа от деафферентированной сетчатки мыши показаны на рисунке 1. Холинергических клеток в обоих GCL и INL может быть надежно идентифицированные tdTomato флуоресценции и , предназначенные для целых клеток записи патч зажим под DIC (Рисунок 1А) выявить колебания их мембранных потенциалов (верхние следы) и синаптических токов , которые управляют его (нижние следы, рис 1б). Ингибирующие и возбуждающие син...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие лаборатории зафиксировали от GCL нейронов в квартире монтажа подготовки 15-18, но наши процедуры позволяют записи из INL нейронов. Настоящим выделить несколько шагов, которые имеют решающее значение для успешного проведения рутинных записей.

Свежесть и плоскостность сетчатки имеют большое значение для проникновения в его пипеткой записи. В связи с этим, фирма прикрепление сетчатки к пробитой нитроцеллюлозные мембраны имеет первостепенное значение и достигается за счет перех...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Чжун Чана и Синь Гуаня за техническую помощь. Мы благодарим доктора Рори Маккуистона из Университета Содружества Вирджинии за создание нашей первой установки для патч-хомутов и советы по экспериментальным процедурам. Мы благодарим доктора Самуэля Ву за предложения по записи напряжения. Работа поддерживается грантами NIH EY013811, EY022228 и грантом A Vision Core EY002520. C-KC является заведующей кафедрой Фонда исследования сетчатки Элис Р. Макферсон в Медицинском колледже Бейлора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стационарный флуоресцентный микроскоп с DICOlympusBX51-WI
МикроманипуляторыSutterMP-225
Патч-усилитель с зажимомA-M SystemAM2400
AD преобразовательNational InstrumentNI-USB-6221
Контроллер нагревателяWarner InstrumentTC-324B
Inline нагревательWarner InstrumentSC-20
Перистальтический насосRaininDynamax
пипеткаSutter InstrumentP-1000
Стеклянная трубка с нитью накалаKing Precision GlassИндивидуальный
стимуляторA.M.P.I.Master-8
БиоцитинSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-глюкозаSigmaG6152
K-глюконатSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-метансульфонатSigmaC1426
CsOHSigma232041
Шприцевой фильтрNalgene171
1 мл шприцRainin
10 μ l наконечник для пипеткиGenesee Scientific24-130RL
Streptavidin-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
17013002

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
  2. Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
  3. Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
  4. Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
  5. Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  6. Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
  7. Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).
  8. Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
  9. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
  10. Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
  11. Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).
  12. Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
  13. Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  14. O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
  15. Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
  16. Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
  17. Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253(2014).
  18. Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  19. Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).
  20. Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
  21. Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
  22. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

patch clamptdTomato

Похожие статьи