Методическая статья

Быстрое приобретение 3D-изображений с помощью высокого разрешения Эпископическое микроскопии

DOI:

10.3791/54625

⸱

21 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем подробный протокол с использованием эпископической микроскопии высокого разрешения для получения трехмерных (3D) изображений эмбрионов мышей. В этом усовершенствованном протоколе используется модифицированный метод подготовки тканей для улучшения проникновения флуоресцентного красителя, что позволяет проводить морфометрический анализ образцов как маленьких, так и крупных размеров.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпископическая микроскопическая технология высокого разрешения (HREM) позволяет быстро получать цифровые объемные и трехмерные (3D) морфометрические данные высокого разрешения. Здесь мы опишем подробный протокол визуализации всего эмбриона мыши. Протокол состоит из четырех основных разделов: подготовка образцов, встраивание, получение изображений и, наконец, 3D-визуализация. Технология требует, чтобы образцы окрашивались флуоресцентным красителем, что может быть проблематично для больших или плотных образцов. Чтобы преодолеть это ограничение, мы усовершенствовали существующий протокол для усиления проникновения красителя в ткани путем предварительной обработки образца раствором, содержащим мочевину и додецилсульфат натрия. В протоколе используется только обычное лабораторное оборудование и реагенты для легкой адаптации в стандартных лабораторных условиях. Мы показываем, что полученные 3D-изображения с высоким разрешением точно повторяют подробные морфологические особенности внутренних органов эмбрионов мышей, тем самым позволяя проводить морфометрический анализ. Вместе мы представляем подробный и улучшенный протокол с использованием стандартного лабораторного оборудования для получения 3D-изображений малых и больших образцов с высоким разрешением.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Появление технологий 3D-визуализации открыло возможность системного анализа детальных морфологических особенностей во время развития плода. В настоящее время доступны различные методы 3D-визуализации, включая микромагнитно-резонансную томографию (микро-МРТ), микрокомпьютерную томографию, высокочастотный ультразвук, оптическую когерентную томографию, оптическую проектную томографию и эпископическую микроскопию1-4. Каждый модальность имеет свои уникальные особенности в разрешении, контрастности, скорости, стоимости, внутриутробных возможностях и доступности.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) и эпископическая микроскопия высокого разрешения (HREM) являются методами визуализации эпископической микроскопии4. В этом случае серийные изображения с высоким разрешением непрерывно захватываются с лицевой стороны блока, а не с участков тканей. Полученные изображения точно отражают детальные морфологические особенности с минимальными искажениями тканей или без них. Полученные объемные данные легко преобразуются в 3D-изображения с высоким разрешением, пригодные для точного морфометрического анализа. Благодаря относительно низкой стоимости и высокому разрешению, HREM и EPIC стали превосходными альтернативами для системной оценки мышиных моделей врожденных дефектов человека2,4-8.

Оба метода EFIC и HREM требуют, чтобы образцы были внедрены в подходящую среду. EFIC обнаруживает автофлуоресценцию, излучаемую внедренной тканью. Из-за этого он ограничен образцами с высоким уровнем автофлуоресценции, но не образцами с относительно слабой аутофлуоресценцией, такими какэмбрионы на ранних стадиях. Чтобы преодолеть зависимость от автофлуоресценции, образцы окрашивают флуоресцентным красителем, таким как эозин, для визуализации HREM. Выбор красителей и методов окрашивания также делает HREM более совместимым для обнаружения молекулярных сигналов в контексте архитектуры и морфологии тканей4,10.

В этой статье мы представляем улучшенный протокол HREM, подходящий для оценки всего тела эмбрионов мышей на поздней стадии. Чтобы облегчить окрашивание, мы включаем этап предварительной обработки для увеличения проникновения в ткани, что позволяет визуализировать HREM более старых эмбрионов мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все случаи использования животных утверждаются по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Бостонской детской больнице.

1. Подготовка образцов

  1. Временный спаривание
    1. Поместите C57BL6 дикого типа самца и самку вместе в одной клетке.
    2. Проверьте для формирования матовую пробки рано утром следующего дня. Спаривание плагин (он же, вагинального или совокупление плагин) представляет собой закаленный желеобразные отложения , которое блокирует вход во влагалище.
    3. Установите дату пробку как день эмбрионального 0,5 (e0.5).
  2. Выделение эмбрионов мыши
    1. Эвтаназии беременных самок СО 2 удушья.
    2. Помещенный мышей навзничь на впитывающей подушечки и распылить брюшную область с 70% -ным этанолом.
    3. Подтяжка кожи и сделать первоначальный 5 мм надрез на хвостовом брюшной области с использованием хирургических ножниц. Вырезать и удалить кожи живота, чтобы полностью раскрыть внутренние органы
    4. Вырезать вблизи ваGina, чтобы удалить всю матку.
    5. Обрежьте между имплантацией участков вдоль рога матки. Каждый сегмент или зародыш должен иметь только один эмбрион внутри.
    6. Хранить сегменты матки в 1X ледяным фосфатно-буферным раствором (PBS).
  3. Эмбрион рассечение
    1. Поместите каждую Conceptus в отдельное блюдо с ледяным PBS под стереоскоп.
    2. Удалить матки ткани, плаценту, а затем последовательно плодные оболочки с использованием тонких препаровальный пинцет.
    3. Передача расчлененный эмбриона в 50 мл пробирку с 1x ледяной PBS с помощью большой пипетки передачи. Избегайте собирание эмбриона непосредственно с пинцетом, чтобы свести к минимуму повреждение тканей.
  4. фиксация
    1. Закрепить расчлененный эмбрионов в 10% нейтральном забуференном растворе формалина при температуре 4 ° С в течение более 24 ч, по меньшей мере, 10 объемов образцов фиксирующих.
  5. предварительная обработка
    1. Подготовить Клиринговый Решение: 4М мочевина, 10% глицерина, 4% додецилсульфат натрия (SDS) в бидистиллированной воде.
    2. Заменить закрепитель с Расчетной Solution.
    3. Осторожно повернуть образец на качалке при комнатной температуре в течение 1 - 2 недель. Обмен Клиринговый Solution один раз на второй и третий день. Образец медленно становится ясным и прозрачным.
    4. Заменить Клиринговый решение с 10% -ным формалином и оставить на качалке в течение 2-х дней.
  6. дегидратация
    1. Вымойте предварительно обработанных образцов с 1x PBS 3 раза в течение 5 минут каждый.
    2. Дегидрировать образцов в серии этанола возрастающей при комнатной температуре на пологом качалке. Для E15.5 эмбрионов, используют серию восходящий этанол в том числе 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% этанола, 2 ч каждый шаг. Для более старых эмбрионов, время инкубации должна быть увеличена.
  7. Окрашивание
    1. Подготовка окрашиванием Решение: добавить 0.1375 г эозина Y динатриевой соли и 0,0275 грамм акридинового оранжевого геми (хлорид цинка) соли к 50 мл 100% этанола. Смесь перемешивают в течение 2 часов. Фильтр с фильтровальной бумагой. Хранить при комнатной температуре и исключить воздействие света, покрывая с алюминиевой фольгой.
    2. Перенос образца в окрашивании раствор в течение 1 ч.
    3. Заменить свежим Окрашивание раствором и пятно в течение ночи.
  8. инфильтрация
    1. Готовят инфильтрацией решение: объединить 100 мл раствора А JB-4 комплекта вложения, 1,25 г катализатора С, 0,275 г эозина Y динатриевой соли и 0,055 г акридинового оранжевого геми (хлорид цинка) соли. Движение, чтобы смешать (200 оборотов в минуту) в ведре со льдом в течение 2 ч, а затем фильтруют с помощью фильтровальной бумаги.
    2. Храните инфильтрации решение при 4 ° С и избегать света, покрывая с алюминиевой фольгой.
    3. Перенос эмбрионов инфильтрации Решение: окрашиванием раствором (1: 1), и инкубировать в течение не менее 3 ч на качалке при 4 ° С.
    4. Перенос эмбрионов инфильтрации раствора и инкубировать в течение 3 чг на качалку в холодном помещении.
    5. Заменить инфильтрации решение один раз в день, и оставить в холодном помещении на пологом качалке в течение еще трех дней.

2. Вложение

  1. Держите Решение B и инфильтрации решение на льду.
  2. Сделать Встраивание Solution (1:25 раствора В и инфильтрации раствора) непосредственно перед вложением.
  3. Orient образец в вложению формы, а затем залить холодной Встраивание раствора в вложению формы аккуратно. Переориентирование с булавкой, если это необходимо.
  4. Используйте булавку, чтобы изучить вопрос о затвердевает вложении решение. Выталкивайте блок образца и обрежьте ее в случае необходимости.
  5. Переориентировать блок образца с использованием отдельной формы для получения перекрестной ориентации.
  6. Поместите держатель блока в верхней части пресс-формы вложения. Аккуратно влить Встраивание решение в пресс-форму до тех пор, форма и держатель блока не погружена Встраивание Solution.
  7. Храните образец в контейнере вторичного и оставить егона льду в течение 3 - 4 часа в вытяжном шкафу.
  8. Хранить Затвердевший образцов в 4 ° С.
  9. Отслаиваться вложение плесени. Поместите блок под стереомикроскопа с косом освещении, чтобы проверить положение образца в блоке. На блоке лица, Марк линии сетки вокруг образца.
  10. Обрезка блок, чтобы удалить количество доступа встраивания материала с использованием отмеченных линий сетки в качестве ссылки.

3. Получение изображения

  1. Зажим образца блока к микротома и получить свежую поверхность разреза. Установить толщину секции (например, e9.5-10.5, 1,5 мкм; e11.5-12.5, 2,0 мкм; e13.5-15.5, 2,5 мкм; E16.5-старшего, 3 мкм). Держите образец / блок в исходном положении микротом.
  2. Установите стерео микроскоп масштабирования по горизонтали, обращенную блок поверхности образца.
  3. Включите компьютер и микроскоп, и запустить программное обеспечение захвата изображений.
  4. Визуализируйте и фокусировки оптики на блок-лицав режиме "живой" вид программного обеспечения визуализации.
  5. Align микроскоп и микротом, если это необходимо, чтобы блок-лицо находится в центре видоискателя.
  6. Отрегулируйте масштаб так, чтобы весь блок-лицо в видоискателе.
  7. Выберите зеленый флуоресцентный белок (GFP) фильтр (возбуждение 470 ± 20 нм, дихроичный 495 нм, эмиссия 525 ± 25 нм) и переориентировать в случае необходимости.
  8. Измерьте и установите время экспозиции вручную (например, 80 - 400 мини - сек).
  9. Приобретать изображения блок-лица после каждого свежего вырезать и сохранить изображения автоматически, если это возможно.
  10. Запись важных параметров, включая разрешение, толщина секции и масштабирования.
  11. После окончания всего образца, экспорта и конвертировать все файлы изображений в формате JPEG, если это необходимо.
  12. Переверните все исходные изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений, а также настроить яркость и контрастность.
  13. Сохранить все обработанные изображения в отдельной папке.

4. 3DВизуализация

  1. Загрузите все обработанные изображения в 3D-визуализации программного обеспечения, следуя инструкциям.
  2. Входное разрешение и толщина секции , чтобы преобразовать все изображения в объемных данных (т.е. воксельная размер) и сохранить 3D - файл.
  3. Совместите все изображения, используя автоматический режим. Настройте отдельные изображения вручную, если это необходимо.
  4. Сохраните выровненный изображение на новое имя файла.
  5. Анализ морфометрических особенностей образца с использованием программного обеспечения визуализации 3D.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщали высокого качества ЭМВР изображения эмбрионов мыши между E9.5 и E13.5 8. Качество изображения конца поставил эмбрионов, однако, в значительной степени нарушена из-за проникновения ограниченного тканевого эозином флуоресцентного красителя. Для повышения эффективности окрашивания, мы протестировали несколько предварительной обработки методы, которые совместимы с флуоресцентной визуализации 11. В частности, эмбрионов мышей E15.5 обрабатывали либо Sca / е А2 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем модифицированный протокол с использованием рутинного лабораторного оборудования для получения серийных ЭМВР изображения, которые совместимы для быстрой 3D визуализации и анализа морфометрического сложных структур. Поскольку изображения с высоким разрешением взяты непосредственно из блока лица, а не отдельных участков, мелкие морфологические особенности сохраняются и быстро реконструированы в цифровом виде в программе 3D визуализации.

3D визуализация дает значительные пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим докторов Ичэнь Хуанга, Чуньмина Го и Чжэньфан Чжоу за их техническую поддержку. Это исследование финансировалось NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) и Американской кардиологической ассоциацией (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

мыши раствор DDR3 RDIMM 64 ГБ

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лаборатория ДжексонаC57BL6
этиловый спиртфармко-аапер111000200200 пруф, абсолют, ACS/USP/кошерный класс
формалинасигмаHT501128-4л
мочевинысигмаU5128
для очистки глицеринаFisher scientificG33-4раствор для очистки
Додецилсульфат натрияИнвитроген15525-017Раствор для очистки
Эозин и динатриевая сольFisher научнаяBP241925Раствор для инфильтрации
Акридин Апельсин hemi (хлорид цинка) сольSigmaA6014Раствор для инфильтрации
Ватман бумагаGE3030-153
JB-4 Набор для встраивания - Раствор АPolysciences, Inc.0226A-800Инфильтрационный
раствор JB-4 Встраиваемый комплект - Solution BPolysciences, Inc.0226B-30Решение для встраивания
JB-4  Комплект для встраивания - CatalystPolysciences, Inc.02618-12Раствор для инфильтрации
для встраивания пресс-форм Polysciences, Inc.23185-116 x 8 мм
Отслаивающиеся острые формы для встраивания Polysciences, Inc.18986-122 мм x 22 мм квадрат, усеченный до 12 мм x 12 мм
JB-4  Держатели пластиковых блоков Polysciences, Inc.15899
Одноразовые градуированные трансферные трубыVWR414004-014
Чашка для петраVWR25384-088Щипцы для рассечения эмбрионов
Inox Tip  ROBOZRS-5015Инсекция эмбриона
Graefe Tissue Tirp  ROBOZRS-5153Диссекция эмбрионов
Деликатные операционные ножницы  ROBOZRS-6700Embryo dissection
14 мл Полипропиленовые трубки с круглым дномFalcon352059
50 мл Полипропиленовые конические тубыFalcon352098
Ведро для льдаMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 мл (3,4 унции) Антистатические полистирольные весыVWR89106-766
330 мл (11,2 унции) Антистатические полистирольные весылодки VWR89106-770
хлорид натрияMP биомедицинские102892раствор PBS
хлорид калияSigmaP0662PBS раствор
фосфат калия одноосновнойSigmaP5405PBS раствор
натрия фосфат двухосновной гептагидратSigma-AldrichS9390PBS раствор
Цифровой фотоаппаратHamamatsu PhotonicsC11440-10C
МикротомLeicaRM2265
ОсветительCarl ZeissHXP 200C
Флуоресцентный стерео зумМикроскоп Carl ZeissAxio Zoom.V16
Стерео МикроскопOlympusSZX16
Волоконно-оптический источник светаLeicaKL 1500 LCD
Одноразовое лезвие для микротомаVWR95057-832
Однолезвийный диспенсерPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D программное обеспечениеVisage Imaging5.4
КомпьютерDell T7600, 2 жестких диска SAS емкостью 900 ГБ и памятью
Шейкеры с качающейся платформойVWR40000-304
Стандартная мешалка с подогревомVWR12365-382
Аналитические весыMettler ToledoAB54-S

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D3D

Похожие статьи