Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции В Vivo С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Summary

Микроглии фагоцитоза имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей и недостаточной фагоцитарной функции были замешаны в патологии. Тем не менее, оценки функции микроглии в естественных условиях является технически сложной задачей. Мы разработали простой, но надежный метод для точного мониторинга и количественной оценки фагоцитарной потенциала микроглии в физиологической обстановке.

Abstract

Микроглия — это тканевые резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС) и они выполняют различные функции, поддерживающие гомеостаз ЦНС, включая фагоцитоз поврежденных синапсов или клеток, мусора и/или вторгшихся патогенов. Нарушение фагоцитарной функции было вовлечено в патогенез таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и возрастная макулярная дегенерация, при которых накапливаются бляшки и друзы β амилоиде соответственно. Несмотря на свою важность, микроглиальный фагоцитоз сложно оценить in vivo. В этой статье мы описываем простую, но надежную методику точного мониторинга и количественной оценки фагоцитарного потенциала микроглии сетчатки in vivo. Предыдущие методы опирались на иммуногистохимическое окрашивание и методы визуализации. В нашем методе используется проточная цитометрия для измерения поглощения микроглией флуоресцентно меченых частиц после интравитреальной доставки в глаз у живых грызунов. Этот метод заменяет традиционные практики, которые включают в себя трудоемкие срезы тканей, иммуноокрашивание и визуализацию, что позволяет более точно количественно оценить фагоцитарную функцию микроглии менее чем за шесть часов. Эта процедура также может быть адаптирована для проверки того, как различные соединения изменяют микроглиальный фагоцитоз в физиологических условиях. Хотя этот метод был разработан на глазу, его использование не ограничивается исследованиями зрения.

Introduction

Общая цель этого метода заключается в точной оценки и количественного определения в естественных условиях микроглии фагоцитоза. Микроглии являются резидентные макрофаги ткани центральной нервной системы (ЦНС). Они выполняют различные функции, чтобы обеспечить поддержание гомеостаза тканей. К ним относятся иммунного надзора, секрецию нейротрофических факторов и, ключевое значение, фагоцитоз ^1. Микроглии фагоцитоза играет ключевую роль в нескольких важных событий во время развития головного мозга и сетчатки глаза, такие как фагоцитоз несущественных синапсов (синаптических подрезке) и удаление апоптотических нейронов ^2-4. Кроме того, микроглии фагоцитоз поврежденных или апоптотических нейронов, клеточных остатков и нарушало микробов было показано, что необходимо для поддержания гомеостаза ЦНС до зрелого возраста ^5. Наконец, микроглии фагоцитоза участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и связанных с возрастомдегенерация желтого пятна, где было высказано предположение , что неисправны или недостаточная пропускная способность фагоцитарной может способствовать накоплению амилоида-бета (A & beta ; ) бляшек и друз, соответственно ^6,7.

Микроглии функция жестко регулируется их микросреды, в частности растворимых факторов, таких как фактор роста опухоли-бета или межклеточных взаимодействий. Нейроны конститутивно экспрессируют несколько клеточной поверхности лиганды, такие как CD200 и CX3CL1, в то время как микроглии исключительно выражают соответствующие рецепторы CD200R и CX3CR1. Эти рецепторы содержат иммунорецептора ингибирования на основе тирозина мотивы (ITIMs) в их внутриклеточной части. Эти рецепторы ингибитора имеют решающее значение для предотвращения чрезмерной стимуляции микроглии, которая может способствовать нейровоспаления. Таким образом, при нормальных физиологических условиях, межклеточные взаимодействия между нейронами и микроглии держать микроглии в состоянии покоя. Во время повреждения ткани, однако, нейроны могут понижающей регуляции ехрression этих лигандов, удаление их ингибирующее действие на активацию микроглии. Микроглии функции ( в том числе фагоцитоза), таким образом , тесно связана с их микросреды ^8. Тем не менее, на сегодняшний день не существует стандартизированные тесты для изучения микроглии фагоцитоза в физиологическом контексте, или таким образом, чтобы полностью повторяющей их микросреду ЦНС.

Несколько анализы были разработаны для измерения фагоцитарную активность микроглии в пробирке, где первичные микроглии или линии микроглии клеточные культивировали с клетками - мишенями (например, апоптотических нейронов) или флуоресцентно меченных бусинок. Целевое поглощение затем оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии изображений или проточной цитометрии ^9-12. Эти анализы позволяют тестирование как фармакологические или генетические манипуляции могут повлиять на микроглии фагоцитоза и, в то время как информативный, не в полной мере повторить комплекс в естественных условиях окружающей среды. Косвенные методы изучения микроглии фагоцитозав естественных условиях сообщалось: они выполняются с помощью окрашивания молекул как полагают, участвуют в фагоцитозе (например, CD68), оценка физической близости микроглии и мишеней для фагоцитоза (например, скомпрометированных нейронов или синапсов элементов), или с помощью иммуногистохимического обнаружения фагоцитирующих целевые задачи в клетках микроглии (например, A & beta ; ) ^{13-17 лет.} Два исследования использовали более прямые подходы к оценке микроглии фагоцитоза в естественных условиях. Хьюз и его коллеги использовали методы визуализации для измерения микроглии поглощение гранул доставленных через внутричерепного маршруту ^18. Sierra и др. Разработали точный метод для количественной оценки микроглии фагоцитоз апоптотических клеток с использованием сложных методов визуализации ^4. Тем не менее, эти методы включают сложные протоколы для подготовки ткани, секционирование, визуализации и анализа данных. Ранее мы использовали анализ проточной цитометрии для оценки фагоцитоза фоторецептора изэр сегменты по пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) клеток в культуре ^19. Здесь мы опишем протокол для быстрой оценки поглощения флуоресцентно меченных частиц микроглии сетчатки глаза в качестве количественной меры в естественных условиях микроглии фагоцитоза.

Протокол мы описываем здесь обеспечивает надежное и количественное измерение сетчатки микроглии фагоцитоза в чуть менее шести часов в трех важных этапов: (1) поставки интравитреального флуоресцентно меченый частиц, (2) сбора и подготовки ткани сетчатки, и (3) потока цитометрии анализ. Метод, который мы разработали это надежный метод для оценки микроглии фагоцитоза в сетчатке, и она может быть успешно использован для тестирования, как различные соединения или генетические манипуляции изменяют этот ключ микроглиальную функцию в физиологических условиях. В специализированной области ЦНС, сетчатка легко доступной модели системы для изучения функции микроглии ^20. В то время как этот метод был разработан в Tон глаз, мы считаем, что это может быть полезно для всех неврологов, расследующих функции микроглии фагоцитарную.

Protocol

Все животные были обработаны в соответствии с этическими принципами, установленными научно-исследовательским институтом Скриппса.

1. Подготовка материалов для инъекций

1. Стерилизовать 33 G иглы и шприца: разобрать и автоклаве при 115 ° С ^ο Подготовка иглы для инъекций ростом в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS).
2. Растаяйте флуоресцентно меченных частиц при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. Приготовьте раствор для инъекций частиц путем восстановления до 50 мг мл раствора / в стерильной PBS с Ca ²⁺ / Mg ^2+.
   Примечание: AF488-меченые частицы грибного происхождения , которые были проверены для фагоцитоза анализов используются в данном протоколе ^21-23. Для оптимального поглощения, подготовить частицы свежей и непосредственно перед инъекцией.
   Примечание 2: Particle концентрации могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента.

2. Интравитреальная Инъекция Бусина Solution

Примечание: Два рюди необходимы для выполнения инъекции, таким образом, таким образом, что человек, выполняющий инъекции может держать мышь и сохранить фокус на глазное яблоко, в то время как другой человек проходит загруженный шприц и толкает поршень.

1. Анестезировать грызуна путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг / мл кетамина и 10 мг / мл ксилазина в дозе 20 мкл / 10 г веса тела. Перед инъекцией, использовать носок щепотку для оценки уровня анестезии.
   Примечание: Isoflurane оказывает глубокое воздействие на функции клеток миелоидного, таким образом, его использование на протяжении всего этого анализа следует избегать ^24,25.
2. Нагрузка игла с 0,5 мкл раствора флуоресцентно меченых частиц.
3. Положите мышь в сторону под операционным микроскопом (рис 1A-B). Используйте мягкий материал, например, пакет геля, для лучшего позиционирования мыши. Для молодых мышей , у которых глаза еще не открыты, аккуратно открыть веки при помощи тонких 45 ^O под углом щипцов путем создания fissuповторно вдоль щели, из которых в конечном итоге веки открытыми.
   1. С помощью тонких 45 ^O под углом пинцетом осторожно применять давление вокруг веко, так что глазное яблоко выскакивает слегка из гнезда. Держите голову двумя пальцами чуть выше уха и его челюсти и осторожно растягивать кожу параллельно веки слегка держать глаз из розетки. Будьте осторожны , чтобы не понять слишком близко к горлу (рис 1В).
4. Для того, чтобы проколоть глазного яблока, вставить иглу шприца в роговичного лимба (где роговица и склеры подключиться). Это видно, как серый круг в пигментированных мышей. слегка Отвести иглу, чтобы изгнать небольшой объем стекловидного жидкости, а затем вводят. Лицо, осуществляющее инъекцию следует осторожно держать мышь с одной стороны, и иглы с другой стороны; второй человек должен медленно толкать поршень.
5. Отвести шприц медленно. Нанесите увлажняющий глаз капли, чтобы держать глаза увлажненной.
6. Пусть грызун восстанавливаться в клетке над тепловым площадку и продолжать следить за развитием животного. При работе с мышат, не возвращают животное в клетку с другими животными оповещения, пока он не дышит и способные к самопроизвольному движению. При работе со взрослыми, не возвращают грызуна в клетку с другими животными оповещения, пока он не восстановит грудины отдохновение.

3. Заготовка ткани сетчатки

Примечание: ретинальной ткани из глаз не инъецировали флуоресцентно меченый частицами должны быть собраны в качестве контроля для анализа методом проточной цитометрии. Хотя анализ может быть выполнен с использованием одного сетчатку, для обеспечения наилучшей производительности двух сетчаток должны быть объединены вместе.

1. Собирают ткани сетчатки 3 ч после инъекции в стекловидное флуоресцентно меченых частиц.
   Примечание: В то время как время после введения раствора частиц могут быть оптимизированы для каждого конкретного эксперимента, мы обнаружили, что 3 ч после инъекции, поглощение частиц можно было видеть на протяжении многих слоев OF сетчатки (рис 1C-D).
2. Жертвоприношение мышей путем смещени шейных позвонков.
3. Соберите глазные яблоки, слегка нажав на веко с помощью тонких 45 ^O угловыми щипцов proptose глазного яблока. Расположите щипцов позади глазного яблока и тянуть.
4. Проанализируйте сетчатки глаза под микроскопом рассекает. Перенести глазное яблоко в чашку Петри , содержащую небольшое количество PBS с Ca ²⁺ / Mg ^2+. В сухом месте чашки Петри, перфорировать глазное яблоко в роговице лимба с кончика высокодисперсных щипцов.
5. Держите глазное яблоко с помощью тонких 45 ^O под углом пинцетом и использовать пружинные ножницы , чтобы вырезать вокруг роговицы лимба, пока примерно половина окружности лимба роговицы не вырезается.
6. Держите глазное яблоко с изобразительным 45 ^о наклоненными пинцетом и довести глазного яблока в PBS. С второй парой тонких 45 ^O под углом щипцов рвать роговицы и склеры друг от друга. Хрусталик и сетчатка выйдет яntact.
7. Отделите объектив и сетчатки глаза. Соберите сетчатку и передать пробирку 5,4 мл полистирола , содержащую 2 мл PBS с Ca ²⁺ / Mg ^2+.

4. Подготовка суспензии отдельных клеток

1. Подготовка суспензии отдельных клеток с использованием набора для нервной ткани диссоциации с незначительными модификациями инструкциями изготовителя. Вкратце, растирают сетчатка пипетированием вверх и вниз с P1000 пипетки и выполняя ферментативного расщепления при температуре 37 ^° С без встряхивания.

5. Окрашивание Суспензии отдельных клеток для анализа потока Cytometric

1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл окрашивающего буфера (фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко, с 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,09% азида натрия) и переноса в U-дно 96-луночного планшета. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г.
   Примечание: азид натрия вреден для человека и окружающей среды. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты оборудования аго отказаться от отходов в соответствии с местными правилами.
2. Переверните планшет над раковиной, чтобы отбросить супернатант. Для того, чтобы блокировать Fc рецепторы, ресуспендирования клеток в 25 мкл буфера, содержащего краситель 5 мкг / мл анти-мышиного CD16 / CD32 антитела на каждую лунку. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Добавьте 25 мкл окрашивающего буфера, содержащего 0,5 мкг / мл анти-мыши Ly6C-Арс-Cy7, 0,5 мкг / мл анти-мыши Ly6G-Пе-Cy7 и 2,5 мкг / мл анти-мышиной CD11b-AF650. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
4. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Переверните планшет, чтобы отбросить супернатант. Промыть ресуспендирования клеток в 200 мкл буфера для окрашивания.
5. Центрифуга в течение 5 мин при 130 х г. Ресуспендируют в 200 мкл буфера, содержащего краситель 0,5 мкг / мл йодистого пропиди (PI). Переезд в микротитровальных пробирки 1,2 мл.
6. Промыть лунки с дополнительными 100 мкл окрашивания буфера, содержащего 0,5 мкг / мл PI и бассейн с предыдущими 200 мкл в1,2 мл микротитровальные трубки. Общий объем 300 мкл окрашенных клеток получается.

6. Анализ проточной цитометрии

1. При использовании обычного три лазера (фиолетовый, синий и красный лазер), во избежание PE, PerCP-Cy5.5, BV510 и PI красители из-за значительного перелива из очень ярких флуоресцентных AF488-частиц. Используйте четвертый (желтый) лазер для оптимизации этого анализа, так как она позволяет PE-меченых антител и PI (в канале mCherry вместо канала PerCP-Cy5.5) , которые будут использоваться (рисунок 2).
   Примечание: Если желтый лазер не доступен, использовать мертвые клетки исключения красителя в другом канале.
2. Ворота на PI отрицательные клетки (PI-) , чтобы исключить мертвые клетки (рис 2б).
3. После исключения мертвые клетки, ворота на CD11b - положительных клеток (CD11b ^+), это будет включать в себя все миелоидных клеток (рис 2С).
4. В популяции CD11b ^+, ворота на Ly6C ^- / Ly6G ^- исключитьнейтрофилы (CD11b ⁺ / Ly6G ⁺⁾ и моноциты (CD11b ⁺ / ⁺ Ly6C; Рисунок 2D). После того, как стробирования на микроглии (здесь определяется как CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^- для простоты), две четкие группы населения должны быть видны; один отрицательный и один положительный для флуоресцентно меченых частиц. Фагоциты будут рассмотрены частицы и, следовательно , AF488 ⁺ (рис 2E).
   Примечание: Ly6C положительный или Ly6G положительные популяции также могут быть проанализированы для измерения поглощения частиц с помощью этого окрашивания подход. Процент фагоцитарных ^CD11b - клеток хорошо коррелирует с процентом фагоцитарной микроглии (рис 2F). Для исследователей без опыта проточной цитометрии, более простой анализ с одним только CD11b окрашивания может быть выполнена, хотя и это будет включать в себя фагоцитарную нейтрофилы и моноциты, а также микроглии. В рамках этого CD11b ⁺ / Ly6C ^- / Ly6G ^{- <}/ SUP> популяции, эти клетки> 99% микроглии, о чем судили с помощью окрашивания маркеров F4 / 80 и CX3CR1; Эти маркеры могут быть добавлены, но не нужны в наших руках.

Results

Здесь мы опишем метод , чтобы быстро и надежно определить число фагоцитирующих микроглии ретинальных в физиологическом условиях с использованием анализа методом проточной цитометрии (рисунок 2). Этот метод может быть адаптирован для тестирования эффекта соединений и / или генетических манипуляций на фагоцитарную способности микроглии (Фигуры 3А, 3В). Он также может быть использован в молодых (10 - 20 дней) или послеродового взрослых мышей

Discussion

Существуют три важных шагов в этом способе: (1) инъекции в стекловидное флуоресцентно меченый частиц; (2) сбор и подготовка ткани сетчатки; и (3) Цитометрический анализ. Мы рекомендуем, чтобы исследователи практике Интравитреальная инъекции перед выполнением метода мы представляем здесь. Мышей - альбиносов (например, BALB / C) и окрашенный раствор (например, флуоресцентно меченных частицы) могут быть использованы для облегчения визуализации иглы и введенного раствора. Интравитреальная инъекции являются...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Стереомикроскоп	Nikon	снят с производства
Hamilton  шприц, серия 600	Sigma	26702
33 калибр, малый концентратор RN NDL, 0,5 дюйма, тип точки 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 конъюгат	ThermoFisher Scientific	Z-23373	Подготовьте непосредственно перед инъекцией
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 щипцы	Инструменты для тонкой науки	11251-35	Нужны два
щипца Dumont #5SF Инструменты	для тонкой науки	11252-00
Весенние ножницы Vannas - 3 мм Режущая кромка	Инструменты для тонкой науки	15000-10	Набор для
диссоциации изогнутой нервной ткани – Постнатальные нейроны	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 мл Полистирольная трубка с круглым дном	Falcon	352054
96 лунок U-образная нижняя пластина	Falcon	353077
Буфер для окрашивания (BSA)	BD Biosciences	554657
антитело CD11b-BV650 BioLegend		101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
Propidium Iodide	BD Biosciences	556463
Очищенное антитело против мышей CD16/32	BioLegend	101301