Методическая статья

LED Thermo Flow - Сочетание оптогенетика с проточной цитометрии

DOI:

10.3791/54707

⸱

30 декабря 2016 г.

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптически контролируемые вещества являются мощными инструментами для изучения сигнальных путей. Чтобы расширить спектр возможных экспериментов, мы разработали устройство для исследования оптически контролируемых веществ в режиме реального времени с помощью проточной цитометрии: светодиод Thermo Flow.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптогенетические инструменты позволяют проводить изолированные, функциональные исследования практически любой сигнальной молекулы в сложных сигнальных путях. Основным препятствием является контролируемая доставка света к образцу клетки, поэтому наиболее популярными инструментами для оптогенетических исследований являются анализы клеток на основе микроскопии и эксперименты in vitro. Проточный цитометр имеет серьезные преимущества перед микроскопом, в том числе способность быстро измерять тысячи клеток с разрешением одной клетки. Однако он пока не получил широкого распространения в оптогенетике. В этой статье мы представляем устройство, которое сочетает в себе возможности оптогенетики и проточной цитометрии: светодиод Thermo Flow. Это устройство освещает клетки на определенных длинах волн, интенсивности света и температуре во время проточных цитометрических измерений. Он может быть построен по низкой цене и использоваться с наиболее распространенными проточными цитометрами. Чтобы продемонстрировать его полезность, мы охарактеризовали кинетику фотопереключения белков Dronpa in vivo и в реальном времени. Этот протокол может быть адаптирован практически ко всем оптически контролируемым веществам и существенно расширяет набор возможных экспериментов. Что еще более важно, это значительно упростит открытие и разработку новых оптогенетических инструментов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптогенетика инструменты набирает популярность, отчасти потому , что они могут быть использованы , чтобы расшифровать проводку сигнальных путей 1-4. Они основаны на способности белков фотоактивируемых изменять свою конформацию и аффинностью связывания при освещении светом. Соединяя эти белки сигнальных элементов позволяет для конкретного регулирования одного игрока в сложных внутриклеточных сигнальных путей 5-12. Следовательно, путь передачи сигналов может быть исследована с высоким временным и пространственным разрешением.

Большинство сотовых на основе оптогенетика исследования используют методы микроскопии на основе в сочетании с культивированием в присутствии света с последующим биохимического анализа 11,12. В противоположность этому, проточный цитометр singularizes клеток вдоль капилляра и измеряет размер клеток, зернистость и интенсивности флуоресценции. Этот метод имеет значительные преимущества по сравнению с микроскопии или биохимических методов, в том числе способность анализировать thousanDS живых клеток при разрешении одноклеточного в очень короткое время. Следовательно, желательно, чтобы совместить оптогенетика с проточной цитометрии.

Насколько нам известно, не существует никакого установленного протокола для оптогенетика цитометрии. Широко принято процедура вручную освещать клетки снаружи реакционной трубки с фонариком устройствами. Тем не менее, ручное освещение в проточном цитометре требует свет, чтобы пройти через реакционную трубу и, для клеток живого изображения, цилиндрический, нагретой камере воды. Это приводит к тому существенное рассеивание света и потери света. Кроме того, интенсивность света, заданные вручную освещения не является воспроизводимой между экспериментами (угол, расстояние и т.д.) и существует практический предел числу длин волн в одном эксперименте.

Построив устройство LED Thermo Flow, мы смогли преодолеть эти ограничения. С помощью этого устройства, клетки могут быть освещен с определенными длинами волн в ТЕмпратуре-контролируемым образом в процессе измерений цитометрическими потока. Это позволяет точные и воспроизводимые количества света внутри и между экспериментами.

Чтобы продемонстрировать полезность нашего устройства в естественных условиях, мы записали флуоресценции сигнал Dronpa в клетках Ramos B во photoswitching. Ramos B клетки получают из человеческой лимфомы Беркитта. Dronpa представляет собой флуоресцентный белок, который существует в виде мономера, димера или тетрамера. В своей мономерной форме, она нефлуоресцирующего. Освещение с 400 нм светом вызывает димеризацию и тетрамеризации и делает белок флуоресцентной Dronpa. Этот процесс может быть отменено при освещении 500 нм светом. Белок Dronpa был использован для управления функцией и расположение сигнальных белков 4,13.

Здесь мы выразили белок Dronpa-линкер-Dronpa в В-клетках Ramos для изучения photoswitching из Dronpa в проточном цитометре. С помощью нашего прибора, мы смогли эффективно ивоспроизводимо photoswitch Dronpa во время записи его интенсивность флуоресценции в реальном времени. Этот метод обеспечивает существенные преимущества по сравнению с современными протоколами освещения с ручным освещения и значительно расширяет экспериментальный репертуар оптогенетика инструментов и каркасных соединений. С помощью нашего прибора позволит значительно упростить и ускорить открытие и разработку новых инструментов оптогенетика.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и создание устройства

  1. Пилотные эксперименты
    Примечание: Требуемая интенсивность света для конкретного оптогенетика инструмента и клеточного типа могут существенно различаться. Пилотные эксперименты с прототипами являются полезными для оценки минимальной интенсивности света необходимо. Оптогенетика инструмент, используемый для следующих экспериментов является слитая конструкция Dronpa-линкер-Dronpa. Последовательность Dronpa был коммерчески получен (см перечень материалов). Длинный линкер был клонирован между двумя последовательностями Dronpa, чтобы позволить выраженная конструкция с образованием межмолекулярных (и межмолекулярные) димеров. Шаги, описанные ниже, могут быть адаптированы ко многим другим оптогенетика инструментов или оптически контролируемых веществ.
    1. Трансдукции Ramos В-лимфоциты с содержащей конструкцию Dronpa-линкер-Dronpa следующей инструкции производителя по трансдукции с помощью ретровирусов, содержащих супернатант от упаковки клеток. Урожай и подсчета клеток в соответствии с заранееviously опубликован протокол 13.
    2. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 × 10 6 / мл в среде (RPMI 1640, 10% инактивированной нагреванием FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 ед / мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола) и передавать их в стеклянную трубку FACS.
    3. Вставьте трубу в проточном цитометре и измеряют интенсивность флуоресценции Dronpa (GFP) канала 14,15.
    4. Носите защитные очки для всех дальнейших шагов, чтобы защитить глаза от возможного повреждения длин волн.
    5. Установите вручную на 500 нм светодиод свет на внешней стороне трубки и продолжать измерение интенсивности флуоресценции Dronpa.
    6. Увеличение числа и / или интенсивность света СИД, пока не снижается интенсивность флуоресценции Dronpa.
    7. Установите вручную на 400 нм светодиод свет на внешней стороне трубки и продолжать измерение интенсивности флуоресценции Dronpa.
    8. Необходимо увеличить число и / или интенсивность света СИД до флуо Dronpaценция интенсивность увеличивается.
    9. Используйте по крайней мере столько же света СИД для создания устройства, так как по прогнозам, будет необходимо с photoswitching на этапах 1.1.5 и 1.1.7.
  2. Создание устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство было построено профессиональным обрабатывающего цеха, в Arbeitsgruppe Technik из Университета Фрайбурга. Большинство деталей изготовлены на заказ и не являются коммерчески доступными. Точные размеры каждой части изображены на рисунках 1 и 2. Для пояснения сборки этого устройства, Дополнительное видео 1 обеспечивается и наиболее существенные шаги описаны ниже.
    1. Мельница часть А из поливинилхлорида (ПВХ) с точным измерениям , показанным на фиг.1А.
    2. Вставьте светодиодные фонари в просверленные отверстия кусок A и запечатать каждое отверстие с ПВХ клеем, чтобы предотвратить утечку воды.
    3. Подключение светодиодов к многоканальному трансформатора (каждая длина волны должна занимать отдельную Channэл) с регулируемой выходной мощностью от 0-29 мА.
    4. Приложить внешнюю оболочку (В) с 3-мя винтами к части А, как показано, чтобы защитить светодиоды от физических повреждений.
    5. Для того, чтобы иметь возможность подключить устройство к водяному насосу, клея в трубе зажимов (C) в просверленные отверстия кусок A (изображен на рисунке 1а, поперечное сечение Y: 9 мм и 61,5 мм) с помощью клея ПВХ.
    6. Вырезать 58,5 мм из плексигласа трубки (D1).
    7. Производство частей D2 и D3 из оргстекла , как показано на рисунке 2.
    8. Клей кусок D3 в нижней части D1 с Plexiglas клеем.
    9. Прикрепите резиновую уплотнительное кольцо кусок D2 и приклейте ее к верхней части D1 с плексигласа клеем.
      Примечание: Части D1, D2 и D3 вместе образуют кусок D.
    10. Вставьте кусок D в кусок А с 3-мя винтами.
    11. Проверьте устройство на предмет утечки воды перед подачей питания к трансформатору.

2. Измерение Кинетика с оптогенетика Tool

  1. Подготовка клетки
    1. Культура Ramos В-клетки в RPMI-среде (RPMI 1640, 10% инактивированной нагреванием FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 ед / мл стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола) при плотности 3- 10 х 10 6 клеток / мл при 37 ° С и 5% СО 2.
    2. Урожай Ramos B-клеток путем центрифугирования при 350 х г и 4 ° С в течение 5 мин.
    3. Граф клеток с использованием счетной камеры Нейбауера следующие инструкции изготовителя и ресуспендируют 1-5 × 10 6 клеток в 600 мкл среды.
    4. Передача клеток в FACS стеклянной трубки, положить их на лед и защитить их от света до измерения.
  2. Приготовьте цитометр потока и устройство.
    1. Подключите устройство к водяной насос с подогревом и регулировать температуру до 37 ° С.
    2. При использовании стекла FACS труб, замена черный уплотнительное кольцо потока цитометр с резиновым уплотнительным кольцом и дополнительно нанесите водоотталкивающее грлегкость.
  3. измерение
    1. Осторожно вставьте стеклянную трубку FACS в устройство и подключить его к проточного цитометра (рисунок 3).
    2. Начните измерение и запись Dronpa интенсивности флуоресценции (GFP канала).
    3. Осветите образец клеток с 400 нм или 500 нм света соответственно и регистрируют интенсивность флуоресценции (GFP Dronpa канала).
  4. Анализ данных
    1. Анализ экспериментальных данных с подходящим программным обеспечением проточной цитометрии. Участок вперед разброс против бокового рассеяния и ворота живых клеток. Участок интенсивности флуоресценции Dronpa с течением времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование LED Thermo Flow с проточной цитометрии

Функциональное Ядро устройства представляет собой цилиндрическую камеру, в которой светодиоды расположены по кругу, указывая внутрь. Эта камера может быть соединена с источником воды и насосом, который позволяет контролировать температуру светодиодов, а также образец клеток. Светодиоды подключены к трансформатору, и, следовательно, интенсивность света для каждой длины волны мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thermo Flow LED представляет собой инновационное устройство для изучения оптогенетика инструментов в цитометр потока.

До сих пор оптогенетика образцы были освещены только с микроскопией лазерами или фонарика устройств 11,12. В зависимости от угла и расстояния фонаря к образцу, существует значительная вариабельность в количестве освещения, как ожидается, между экспериментами. Кроме того, существует ограничение на количество фонариков один человек может работать в эксперименте. Это ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Й. Шмидта из Фрайбургского университета за создание устройства. Мы благодарим. Нильсена и Д. Медгьеси за поддержку и критическое прочтение данной рукописи. Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft через SFB746 и Excellence Initiative Немецкого научно-исследовательского общества (GSC-4, Spemann Graduate School).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклянная трубка FACSThermo Fisher Scientific; Уолтем, США14-961-26Проточные стеклянные трубки 12x75 мм
Проточный цитометрBD Bioscienceg; Гейдельберг,Германия Fortessa IISpecial Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Кембридж, США41645
PolyJetSignaGen, Роквилл, СШАSL100688
светодиод 505 нмAvago Technologies; Бёблинген, ГерманияHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 нмAvago Technologies; Бёблинген, ГерманияUV5TZ-400-15
Трубка из плексигласа 15 ммMaertin; Фрайбург, Германия76999
Оргстекло 3 ммMaertin; Фрайбург, Германия692230
Оргстекло 2,5 ммMaertin; Фрайбург, Германия692225
оргстекло 1,5 ммMaertin; Фрайбург, Германия692215
ПВХ черепица 5 ммMaertin; Фрайбург, Германия690020.005
Черепица ПВХ 6 ммMaertin; Фрайбург, Германия690020.006
Блок ПВХ 50 ммMaertin; Фрайбург, Германия690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Дармштадт, Германия61870-010
2-меркаптоэтанолEMD; Германия805740
FCSPAN Biotech; Айденбах, ГерманияP30-3302
Пенициллин/Стрптомицин (10 000 Ед/мл)Invitrogen, Life Technologies; Дармштадт, Германия15140-122
Клей из плексигласа AcrifixEvonic Industries, Эссен, Германия1R0192
Tangit Клей из ПВХHenkel, Dü Ссельдорф, Германия

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

Похожие статьи