Визуализация IL-22-экспрессирующих Лимфоциты Использование Reporter Мыши

Wei Shen; Wenqing Li; Julie A. Hixon; Caroline Andrews; Scott K. Durum

doi:10.3791/54710

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация IL-22-экспрессирующих Лимфоциты Использование Reporter Мыши

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54710

⸱

25 января 2017 г.

Wei Shen¹ , Wenqing Li¹ , Julie A. Hixon¹ , Caroline Andrews¹ , Scott K. Durum¹

¹Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем здесь трансгенную модель репортерной мыши для визуализации клеток, продуцирующих IL-22 внутри различных тканей мыши. Этот метод может быть использован для отслеживания местоположения других цитокинов или белков-секретарей у мыши.

Аннотация

Reporter мыши широко используются для наблюдения локализации экспрессии целевых генов. Этот протокол фокусируется на стратегии по созданию новой модели мыши трансгенный репортер. Мы выбрали для визуализации экспрессии гена интерлейкина (IL) 22, потому что этот цитокин имеет важные действия в кишечнике, где она способствует ремонт тканей, поврежденных воспалением. Reporter системы предлагают значительные преимущества по сравнению с другими методами идентификации продуктов в естественных условиях. В случае IL-22, другие исследования были впервые выделили клетки из тканей , а затем повторно стимулировали клетки в пробирке. IL-22, который обычно секретируется, был в ловушке внутри клеток с помощью препарата, и внутриклеточное окрашивание использовали для визуализации его. Этот метод идентифицирует клетки , способные продуцировать IL-22, но он не определяет , были ли они делают это в естественных условиях. Конструкция репортер включает вставку гена флуоресцентного белка (tdTomato) в ген IL-22 в таком промY , что флуоресцентный белок не может быть секретируется и , следовательно , остается в ловушке внутри клеток , продуцирующих в естественных условиях. Флуоресцентные производители могут быть визуализированы в срезах тканей или экс естественных условиях анализа с помощью проточной цитометрии. Сам процесс строительства для репортера включали recombineering бактериальную искусственную хромосому, которая содержала ген IL-22. Эта хромосома инженерии была затем введена в геном мыши. Гомеостатическое выражение репортер IL-22 наблюдалось в различных тканях мышей, в том числе селезенки, вилочковой железы, лимфатических узлов, патч бляшках, и кишечника, с помощью проточной цитометрии. Колит индуцируют Т-клеток (CD4 ⁺ CD45RBhigh) передачи, и выражение репортер визуализировали. Позитивные Т-клетки сначала присутствуют в брыжеечные лимфатические узлы, а затем они накапливаются в собственной пластинке слизистой оболочки дистального тонкой кишки и толстой кишки тканей. Стратегия, использующая BACs дал выражение репортер хорошо точность воспроизведения по сравнению с IL-22 ExpresSion, и это проще, чем нокаута в процедурах.

Введение

Ячейка типа специфическая экспрессия репортерных генов полезно для идентификации клеток, активно выражающих цель в тканях под гомеостаза и возмущенных состояний. Она также позволяет для очистки этих клеток, которые остаются жизнеспособными, чтобы изучить их другие свойства. Репортер мышей были использованы в выяснении механизма действия для специфических цитокинов, факторов транскрипции и регуляторных элементов. Предыдущие стратегии ^{^1,} ^{^2,} ³ в основном полагались на стука репортера в локуса - мишени в хромосоме мыши, процедура отнимает много времени и дорого. Таким образом, б....