Методическая статья

Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54724

⸱

12 октября 2016 г.

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children’s Research Foundation

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол подготовки образцов с низким числом клеток для анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Аннотация

Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) содержит подробную информацию о клеточной организации и ультраструктуры. Тем не менее, ПЭМ анализ популяций редких клеток, особенно клеток в суспензии, таких как кроветворные стволовые клетки (ГСК), остается ограниченным из-за требования большого количества клеток при подготовке пробы. Есть несколько цитоспина или однослойные подходы для анализа ПЭМ из дефицитных образцов, но эти подходы не в состоянии получить значительные количественные данные из ограниченного числа клеток. Здесь, альтернативный и новый подход для подготовки проб в исследованиях ТЕМ описан для популяций редких клеток, что дает возможность количественного анализа.

Относительно низкое число клеток, то есть 10000 ГСК, был успешно применен для анализа ПЭМ по сравнению с миллионами клеток , обычно используемых для исследований ПЭМ. В частности, Эванс синий окрашивание проводили после того, как параформальдегид-глутаральдегид (PFA-GA) фиксации визуализировать крошечные ячейки PELпусть, что облегчало вложение в агарозы. наблюдались скопления многочисленных клеток в ультра-тонких срезов. Клетки были хорошо сохранившийся морфологии, и ультра-структурные детали комплекса Гольджи и несколько митохондрий были видны. Это эффективный, простой и воспроизводимый протокол позволяет Пробоподготовка из ряда низких клеток и могут быть использованы для качественного и количественного анализа ПЭМ на редких клеточных популяций из ограниченных биологических образцов.

Введение

Ультра-структурные и суб-органелл клеток детали были в основном выявлены с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) исследований из тканей или клеточных гранул 1,2. Твердые куски ткани могут быть легко использованы для исследований методами электронной микроскопии. Тем не менее, анализ ТЭМ 1,3 на клетках в суспензии остаются сложными и требуют высокого числа клеток, то есть миллионы клеток. Из - за этого, ультра-структурный анализ популяций редких клеток в суспензии, например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые не так легко оценить. Многочисленные попытки анализа ПЭМ из дефицитных образцов с использованием цитоспина или однослойных подходы не в состоянии получить значительные количественные данные, из-за ограниченного количества клеток. Таким образом, требование высоким числом клеток ограничивает использование этого мощного инструмента для понимания субклеточных ультраструктурным детали популяций редких клеток.

Ключевым ограничением для ПЭМ с ограниченным числом клетокs в суспензии является локализация клеток для обработки и, таким образом, ПЭМ исследования из ограниченных ячеек с особо малыми размерами оставаться сложной. Несколько альтернативных подходов были приняты для борьбы с этим ограничение: БСА / бисакриламида (БСА-BA) опосредованного полимеризации клеточной суспензии, окрашивание клеток с красителем, чтобы сделать их видимыми на тонкой пленки поддержки, включая покровные, и ПЭМ анализы из цитоспиновых препаратов 4-6. Тем не менее, весьма ограниченный успех был достигнут, так как очень немногие клетки были обнаружены в секциях после ультра-секционирования. Основная задача идентификации разреженные клеток сохраняется, поскольку клеточный монослой остается в основном невидимым в затвердевшего геля для секционирования. Кроме того, цитоспина подготовка клеток может изменить свою клеточную организацию из-за распространения клеток и хрупкости клеточной структуры. Следовательно, эти недостатки, присущие гарантирует новый подход к выполнению исследований ПЭМ из популяций редких клеток с болееконсистенции. Чтобы преодолеть эту проблему, мы описали новый и способ получения альтернативный образец для исследований ПЭМ из редких клеточных популяций 7.

Здесь мы сообщаем эффективный протокол подготовки образца для выполнения ПЭМ из дефицитных биологических образцов с последовательными качественных и количественных результатов. Эванс синий окрашивание проводили после фиксации , чтобы локализовать крошечное осадок клеток из клеток с низким числом, то есть 10000 костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток - предшественников , которые в противном случае остались невидимы, и осадок вкладывается в агарозе до того обезвоживания и смолы внедрения процессов. Этот метод кластеров клетки вместе и позволяет проводить эффективный анализ ультраструктуры и субклеточных организации гемопоэтических стволовых клеток (обозначенном как Lin - Sca-1 + C-Kit + Flt3 - CD34 -; ГСК), редкий 0,2 - 0,5% популяции клеток в костном мозге. Этот экспериментальный протокол может быть полезным для выполнения ультра-структурных исследований и получить количественные результаты на многих редких, но очень важных групп населения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональном животных комитета при исследовательского фонда Цинциннати детей. Для этого исследования, гемопоэтические стволовые клетки были выделены из костного мозга мышей C57BL / 6 инбредных мышей в возрасте 2 - 4 мес. Сортировки клеток с помощью FACS после окрашивания БМ с различными производителями поверхности , включая Lineage, C-Kit, Sca-1, Flt3 и CD34 использовали для очистки HSC на основе лингвист Sca-1 + с-Kit + Flt3 - CD34 - стробирования стратегии в качестве стандартного протокола описано выше 8.

ВНИМАНИЕ: Некоторые высокотоксичные химикаты используются во время этой процедуры. Они являются токсичными при вдыхании и попадании на кожу. Пожалуйста, носите перчатки и защитную одежду. Работа в вытяжном шкафу при работе с этими химическими веществами.

1. Клетки, Закрепление, Окрашивание и Pre-вложения

  1. Сортировать 10000 гемопоэтические стволовые клетки ( с использованием Lin - Sca-1 + с-Kit + Flt3 - CD34 - стробирования стратегии; LT-ГСК популяция) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, содержащей 600 мкл Айскоува модифицированную Дульбекко Средний (IMDM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки с использованием FACS.
  2. Спин вниз отсортированные ГСК при 1000 мкг в течение 10 мин в микроцентрифуге пробирку объемом 1,5 мл с использованием центрифуги с откидными ковшами. Удалить среду путем осторожного аспирации и оставить 200 мкл среды в пробирках при каждом шаге. На этой стадии осадок клеток остается невидимой в трубке.
  3. Зафиксировать клетки, добавляя 0,2 мл 2Х раствора закрепителя при комнатной температуре (КТ) в течение 1 часа 1,9.
    1. Сделайте раствор закрепителя свежим перед использованием. На 1х, раствор состоит из 3% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М какодилатный буфер.
  4. Центрифуга клеток при 1000 мкг в течение 10 мин при 30 ° С с использованием центрифуги с поворотно-откидной ведрами.
  5. Вымойте клеток с 600 мкл 0,1 М буфера какодилатномс помощью центрифугирования и оставить 200 мкл буфера в трубке после центрифугирования.
  6. Пятно фиксированные клетки путем добавления 200 мкл 2 мг / мл раствора синего Эванса в какодилатном буфере и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Клетки будут окрашены в синий цвет.
  7. Мыть клетки 3 раза с помощью 600 мкл 0,1 М какодилата буфера с помощью центрифугирования и оставить 200 мкл буфера в пробирку каждый раз.
  8. Повторное приостановить клеток в 200 мкл буфера и передачи клеточной суспензии в 0,5 мл пробирку. Центрифуга при 1000 мкг в течение 10 мин с использованием настольную центрифугу. Удалить буфер осторожно, не нарушая наблюдаемую сейчас крошечные клеточный осадок, и оставьте 50 мкл буфера в пробирку.
  9. Добавить 200 мг с низкой температурой плавления агарозы в 5 мл 0,1 М какодилатный буфера в 15 мл пробирку для 4% раствора агарозы. Расплавления агарозы путем переноса трубки в кипящей воде в стеклянной бутылке емкостью 100 мл, и держать тепл до использования.
  10. Добавьте 200 мкл 4% низкой температурой плавления агарозы, растворенного в 0,1 М cacodylaТЕ буфера к суспензии клеток в 0,5 мл пробирку и сразу же центрифугировать при 1000 х г в течение 10 мин при 30 ° С, используя настольную центрифугу.
  11. После подтверждения того, что клетки осаждали при нижней части 0,5 мл трубки в полутвердой агарозы после центрифугирования, немедленно передать трубку до 4 ° С или лед в течение 20 мин, чтобы закрепить агарозы. Этот шаг является очень критично, как небольшой видимый клеточный осадок на этом этапе приводит к хорошему кластером клеток под электронным микроскопом.
  12. Аккуратно перенести затвердевшей агарозы , содержащий осадок клеток из трубки до 35 мм пластиковые чашки Петри , содержащие буфер , с использованием 27 г иглы 3,10.
  13. Обрежьте затвердевшей агарозы, содержащие осадок клеток в одну часть около 1 - 2 мм с помощью скальпеля. Перенести в агарозном кусок, содержащий осадок клеток в новый 1,5 мл трубки.
  14. Вымойте 2 - 3 раза с помощью 600 мкл 0,1 М какодилатном буфера путем добавления и удаления буфера с помощью пипетки без центрифугирования, Используйте эту агарозном кусок, содержащий осадок клеток для следующего шага. На этом этапе, образец можно хранить при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем перейти к следующему шагу.

2. Osmification, Обезвоживание, встраивание

  1. Удалить буфер какодилат из 1,5 мл трубки с Клеточный осадок, содержащий агарозы с помощью пипетки. Добавить 1,0 мл 1% -ного тетраоксида осмия (OSO 4) раствор в вытяжном шкафу, и инкубировать в течение 1 часа при температуре 4 ° С.
  2. Промыть три раза с 600 мкл 0,1 М какодилатный буфер и переноса образца в стекл нный сцинтилл ционный флакон на 20 мл с крышкой.
  3. Процесс образец для обезвоживания, инфильтрации и встраивания в смолу (например, LX-112) с последовательными изменениями следующих растворов в 6 - луночного планшета с. Перемещение клеток гранул агарозы кусок с помощью щипцов.
    1. Погрузить образец в 25% этаноле при комнатной температуре в течение 15 мин.
    2. Погрузите образец в 50% этанола при комнатной температуре в течение 15 мин.
    3. Погрузите образец в 75%этанол при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Погрузить образец в 95% -ном этаноле при комнатной температуре в течение 15 мин.
    5. Погрузить образец в 100% этанола при комнатной температуре в течение 15 мин, дважды.
    6. Погрузить образец в этаноле: смолы (3: 1) при комнатной температуре в течение 30 мин.
    7. Погрузить образец в этаноле: смолу (1: 1) при комнатной температуре в течение 30 мин.
    8. Погрузить образец в этаноле: смолу (1: 3) при комнатной температуре в течение 30 мин.
    9. Погрузить образец в чистой смолы при комнатной температуре в течение 60 мин, дважды.
  4. Переноса образца в нижней части пирамиды наконечника в форме резиновую форму тщательно с помощью щипцов и добавьте более чистую смолу на верхней части образца, чтобы заполнить форму. Инкубируйте образца при 60 ° С в течение 72 ч для полимеризации смолы.
  5. Удалите полимеризованный пирамиду смолы из пресс-форм путем скручивания резиновой пресс-формы. Маленький черный скопление клеток должна быть видна в полимеризованной пирамиды смолы, как описано выше 7. Прикрепите полимеризованный пирамиду смолы на монтажном цилиндре с использованием Цианоакрилат.

3. Секционирование и просвечивающей электронной микроскопии

  1. Обрежьте блок пирамиды с бритвенным лезвием и алмазного ножа после установки блока на ультра-микротома. Сделать короткую широкую трапециевидную форму с верхней и нижней части блока параллельно друг другу, и с равномерно наклонные стороны. Такая форма пирамиды помогает для последовательного секционирования.
  2. Кроме того, обрезать блок вокруг клеточного осадка с алмазным ножом и удалите пластиковые секции вокруг ячейки гранул агарозы кусок.
  3. Вырезать секции 1 мкм с использованием ультра-микротом. Перемещение секций 1 мкм из воды лодки на предметное стекло , используя инструмент наращивания ресниц и инструмент металлическая петля , как сообщалось ранее 7. секции передачи на слайдах и передачи слайдов к горячей плите (37 ° C) для сушки.
  4. Добавить каплю раствора толуидиновым синим в секциях с использованием шприца, укомплектованный фильтр 0,22 мкм и инкубировать в течение 3 мин. Промыть слайды с дистиллированной водой и ли др секции сохнуть. Проверка с помощью оптического микроскопа, чтобы определить положение клеток.
  5. Вырезать ультратонкие срезы (70 - 100 нм) с использованием алмазного ножа. Move 2 - 3 секции по 200 меш сетки из воды лодки в стеклянную чашку Петри с использованием инструмента наращивания ресниц.
  6. Перенести стеклянную чашку Петри, содержащую сетки с секциями на горячей плите при температуре 30 ° C, чтобы высушить участки в течение 30 мин.
  7. Пятно сетки с каплями 1% ацетата уранила при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем промыть в дистиллированной воде 6 - 8 раз. Пятно с Рейнольдс цитратом свинца, при комнатной температуре в течение 5 мин и промыть в дистиллированной воде 6 - 8 раз. Перенести стеклянную чашку Петри, содержащую сетки на горячей плите при температуре 37 ° С для сушки секций.
  8. Анализировать разделы с помощью электронного микроскопа, при 80 кВ 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффективный и последовательный протокол для подготовки проб для проведения анализа ПЭМ от низкого числа клеток описана. После фиксации окрашивания Эванс синий и передачи клеток в 0,5 мл трубки микроцентрифужных помогла визуализировать крошечные осадок клеток 7. Osmification с тетраоксида осмия в агарозе привело к легкому обнаружению темной клеточного осадка в процессе дегидратации и встраивание.

Semi-шлифы из блоков...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот метод позволяет проводить анализ ПЭМ на низких числа клеток, с помощью синего Эванса окрашивания и агарозы вложения, чтобы локализовать крошечное клеточный осадок во время дегидратации, смолы и вложении секционирования процессов. Важно то, что он поддерживает кластеры клеток вместе и сохраняет ультраструктуру клетки, что желательно, чтобы исследовать множество ячеек для количественной оценки данных.

В исследованиях на ТЕМ, клеточный осадок, содержащий миллионы клеток часто требуется для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Центр исследований патологии за помощь в исследованиях с электронным микроскопом в Медицинском центре детской больницы Цинциннати. Работа была поддержана NIH (Американское общество гематологов Bridge award to-MDF; R01 DK102890 в МДФ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Параформальдегид 20% Водный растворЭлектронная микроскопия Sciences15713<сильный>ВНИМАНИЕ Токсичен при вдыхании, контакте с кожей. Надевайте перчатки, используйте вытяжной шкаф.
Глутеральдегид 70% Водный растворЭлектронная микроскопия Наука16350<сильный>ВНИМАНИЕ Токсичен при вдыхании, контакте с кожей. Надевайте перчатки, используйте вытяжной шкаф.
Буфер для какодилагата Электронная микроскопия Sciences12300Внесите 0,1 М какодилагат буфер (pH 7,4) в дистиллированную воду, храните при температуре 4 °C. <сильно>ВНИМАНИЕ Раздражитель при вдыхании или контакте с кожей, надевайте перчатки и работайте в вытяжном шкафу.
Эванс Блю SigmaE-2129
Низкоплавкая агароза Sigma AldrichA-5030
Тетраоксид осмияЭлектронная микроскопия Sciences191301 г в 50 мл 0,1 М какодилатного буфера для получения 2% OsO<суб>4 запас, <сильно>ОСТОРОЖНО Очень токсичен при вдыхании или контакте с кожей, сильный окислитель, носите защитную одежду, защитные очки, используйте вытяжной шкаф.
Комплекты для встраивания LX-112 (LADD®)
DDSA (додеценилянтарный ангидрид)LADD21340Смешайте 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 вместе, а затем добавьте 1,4% DMP-30
NMA (надический метилангидрид)LADD21350
Эпоксидные смолы Epon 812 (LX-112)LADD21310ВНИМАНИЕ Токсично при вдыхании, контакте с кожей. Надевайте перчатки, защитную одежду, используйте вытяжной шкаф.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)LADD21370
Цитрат свинца Рейнольдса (EM Stain II)LeicaВНИМАНИЕ Токсичный при вдыхании, избегайте контакта с кожей или глазами.
Уранилацетат (ЭМ окрашивание I)Leica8072820<сильно>ВНИМАНИЕ Токсично при вдыхании, избегайте попадания на кожу или в глаза.
Модифицированная среда Дульбекко от Iscove (IMDM)ATCC30-2005состав: NaCl, NaHCO3, HEPES, глюкоза, Ca, Mg, пируват дернины и т.д. Для получения подробной информации https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
форме для пирамидального наконечника Монтажные цилиндры Ted Pella10585
Ted Pella10580
Ultra-microtome (Leica EM UC7)
Сетки с 200 ячейками (nikil)для электронной микроскопии SciencesG-200 Ni
Hitachi модель H-7650 
Программное обеспечение для модуля захвата изображенийAMT-600 
35 мм пластиковые чашки ПетриFisher scientific
Quick Bond Super Glue Cyanoacrylate Электронная микроскопия Науки72588
Бритвенные лезвия
Стеклянные сцинтилляционные флаконы Fisher scientific 03-337-14
Стеклянные горки 
ресниц
Metal Loop tool 
Электронный микроскоп Инструмент для

Ссылки

  1. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
  2. Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
  3. Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
  4. Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
  5. Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
  6. Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
  7. Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
  8. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
  9. Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
  10. Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
  11. Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи