Методическая статья

Визуализация Cell Shape Переоборудование и Cell движения в Drosophila гаструляцией Использование DE-кадгерин Reporter Трансгенные Мухи

DOI:

10.3791/54764

⸱

29 декабря 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем процедуру получения живых изображений гаструляции дрозофилы. Это позволило нам лучше понять апикальную констрикцию, связанную с ранним развитием, и дополнительно проанализировать механизмы, управляющие клеточными движениями во время модификации структуры ткани.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как дрозофилы. Это морфологическое изменение также признается как эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT). Дисрегуляция EMT связано с фиброзом и метастазирование рака. Существует доказательство того, что возникающие ЕМТ контролируется ряда молекулярных механизмов. Как также известны такие, многие ключевые гены, контролирующие верхушечный перетяжку являются важными факторами в ЕМТ наблюдается в метастазирования рака. Как EMT во время гаструляции Drosophila, эпителиальные клетки можно заставить изменить свою форму и быть перепрограммирован перенаправлять судьбу клеток по отношению к различным другим типам клеток. Здесь мы предлагаем надежный метод визуализации дрозофилы гаструляцией для анализа инициации морфогенетических клеточных движений и идентификации клеточных судеб на этой стадии эмбрионального развития. Используя этот метод, мы определяем грELL перегруппировки во время гаструляции и демонстрируют важность апикального сужения во время гаструляции с помощью GFP маркированы DE-кадгерин.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как Drosophila 1,2. Интересно отметить , что возникающие данные свидетельствуют о том, что этот процесс регулируется через взаимодействие между механическими и молекулярных механизмов 3. Кроме того, эпителиальный к переходу мезенхимальной (EMT), которая представляет собой важный процесс в гаструляцией, также участвует в процессах заболеваний человека , таких как рак 4-8 метастаз. Как также известны такие, многие гены , которые контролируют верхушечный перетяжку, являются ключевыми факторами в ЕМТ наблюдается при раке метастазирования 9. Таким образом, верхушечный Сужение во время гаструляции является отличной моделью для исследования вышеупомянутых регулирующих механизмов и повысить понимание метастазирования рака. Преимущество этого метода заключается в том, что мы можем наблюдать движение клеток во время гаструляции в режиме реального времени и, следовательно, мы будемвозможность скрининга генов, участвующих в гаструляции, а также метастазирование рака.

Хотя относительно неизвестной, клеточная адгезия к клетке , как полагают , играет центральную роль в вершинной сужением 1. Drosophila генетика хорошо подходит для отдельных исследований на уровне клеток , исследующих регуляторных молекулярных механизмов. Эта модель позволит нам раскрыть важность апикального сужения во время гаструляции. Более того, этот метод может быть использован для скрининга генов, участвующих в метастазировании рака. Захват живые образы Drosophila гаструляцией еще больше позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы , регулирующие перестановку ткани. Здесь мы приводим подробное описание простого способа для достижения этой цели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Трансгенные мухи , используемые в настоящем исследовании , включают следующее: DE-хама :: GFP 10.

1. Подготовка компании Apple плиты

  1. Приготовить смесь из 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H 2 O. Смесь нагревают в микроволновой печи и вылить его в 3 см для культивирования клеток блюдо с. Хранить смесь при температуре 4 ° С для последующего использования.
  2. После приготовления яблочного тарелку, добавить тонкий слой замешанного дрожжевого пасты поверх него, чтобы позволить мухи заложить яйца.

2. Эмбрион Подготовка и протокол Живая съемка

  1. Поместите около 50 мух (25 мужчин и 25 женщин) в бутылке к спариванию, а затем откладывают яйца на ночь на яблочной пластины, покрытой в замешанного дрожжей. Установите яблочный сок пластины во рту бутылки. Держите бутылку вверх дном в инкубаторе. Оберните пластиковые бутылки Drosophila акции с алюминиевой фольгой , чтобы подсказать йе летит заложить больше яиц.
  2. На следующее утро, заменить старый яблочный сок пластины с новым.
  3. Пусть мухи откладывают яйца в течение 3 до 4 часов, обернув бутылку с алюминиевой фольгой.
  4. Через три-четыре часа спустя, собирают эмбрионов в зародыше ситечко из яблочного сока пластины с помощью кисти или ватный плохо, и мыть их с PBS. Вымойте эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS в 12-луночные планшеты для культивирования.
  5. Dechorionate эмбрионов с 50% хлорной извести в течение 5 мин в 12-луночные планшеты для культивирования.
  6. После процесса dechorionation, мыть эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS.
  7. Перенос эмбрионов до 3 см для культивирования клеток блюдо, содержащую PBS и выберите стадии 5 эмбрионов под микроскопом на основе уровня прозрачности в их границах. Пипетировать инсценированном эмбрионов с использованием 200 мкл кончиком пипетки.
  8. Затем поместите два выбранных эмбрионов на покровного стекла, и удалить избыток PBS с бумагой крученого ткани. Сориентировать эмбрионов спинной стороной вверх напокровное с использованием бумаги крученого ткани. После этого, приложите эмбрионов к покровного стекла с силиконовой смазкой с помощью тонкой иглы и бумаги витую ткани.
  9. Добавьте небольшую каплю масла галоидоуглеводородов 700 на зародышах и помещают покровное, содержащий зародыши вверх дном на отступом горкой, оставляя некоторое пространство в нижней части слайда.
  10. Изучение эмбрионов с помощью конфокальной системы визуализации, аргоновой / 488 лазера, а также цель нефти погружения (63x).
    Примечание: Определение эмбриона на соответствующей стадии развития имеет важное значение для захвата изображений события гаструляции. В этих условиях наблюдается почти все эмбрионы развиваются нормально до, по меньшей мере стадии 14. Анализируемый эмбрионов можно культивировать в дальнейшем развивать как взрослый.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы покажем , гаструляции события зародыша дрозофилы и общий обзор процедуры подготовки эмбриона (Рисунок 1). Клеточные мембраны помечены с помощью DE-кадгерин :: GFP и живой визуализации движений клеток производится во время гаструляции у дрозофилы (рисунок 2). Так как DE-кадгерин GFP мух позволяют визуализировать приверженности клеток перекрестки, мы можем проследить верхушечный форму и движения с использованием этой системы клеток. Что е...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что ранее мы сообщали о подобной процедуре для получения изображений процесса гаструляции в реальном времени у Drosophilla1, метод, который мы описываем здесь, является подробным и легко отслеживает экспрессию эндогенного кадгерина и, таким образом, весьма полезен для генетического скрининга ключевых факторов, участвующих в гаструляции. Чтобы добиться максимального успеха при проведении этой процедуры визуализации, важно использовать предметное стекло с отступом. Механическое давление ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Фондом Астелласа по исследованиям метаболических расстройств (HT), Научным фондом Такеда (HT) и Программой MEXT-Supported для Фонда стратегических исследований в частных университетах (HT).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Галокарбоновое масло 700SigmaMKBH 5726
Вакуумная смазка СиликонBeckman335148
Стеклянная крышка Стекло мацунамиТолщина No124 - 36 мм
Embryo starinerCorningCorning3477
Пластиковые стоковые бутылки DrosophillaHitecMKC-100
DE-Cadherin knock-in мухиREF (10)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP

Похожие статьи