Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54786

⸱

18 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences of Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University

В этой статье

Краткое содержание

Необходимы новые методы выделения первичных эндотелиальных клеток из кровеносных сосудов. Этот протокол описывает новую методику, которая полностью инвертирует интересующие кровеносные сосуды, подвергая ферментативному перевариванию только эндотелиальную сторону. Полученная культура чистых эндотелиальных клеток может быть использована для изучения сердечно-сосудистых заболеваний, моделирования заболеваний и ангиогенеза.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания изучаются как в медицине, так и в ветеринарии. Эндотелиальные клетки широко использовались в качестве модели in vitro для изучения васкулогенеза, ангиогенеза (опухоли) и атеросклероза. В настоящее время стандартом для исследований in vitro эндотелиальных клеток человека (ЭК) является использование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и эндотелиальных клеток пупочной артерии человека (HUAEC). Для исследования эндотелия у собак доступна только одна клеточная линия (CnAOEC), которая получена из эндотелия аорты собак. Хотя в настоящее время это не совсем понятно, существует разница между ЭК, происходящими из артерий или вен. Для более непосредственного подхода к исследованиям функциональности ЭК in vitro мы описываем новый метод выделения первичных эндотелиальных клеток собак (CaPEC) из различных сосудов. Этот метод снижает вероятность контаминации быстрорастущими клетками, такими как фибробласты и гладкомышечные клетки, проблема, которая распространена при стандартных методах выделения, таких как промывание сосуда ферментативными растворами или измельчение сосуда перед перевариванием ткани, содержащей все клетки. Метод, который мы описываем, был оптимизирован для собачьей модели, но может быть легко использован для других видов, таких как человек.

Введение

Собаки используются в качестве большой животной модели для исследования сердечно - сосудистых заболеваний , а также может страдать от врожденных (генетических) сосудистых аномалий 1, 2. Для изучения этих болезней коммерческие клеточные линии эндотелиальные часто используются для оценки эндотелиальных клеток (EC) функциональные возможности . Для собак есть одна коммерческая линия эндотелиальные клетки доступны (CnAOEC), полученный из собачьей аорты. Эта клеточная линия в основном используется в исследованиях в качестве контроля нормального Écs 3-5. В исследовании сердечно-сосудистой системы человека наиболее часто используемые клеточные линии эндотелиальные являются пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) и человеческого пупочной артерии эндотелиальных клеток (HUAECs), полученные из пупочной вены человека мозга и артерии, соответственно. HUVECs были использованы в качестве золотого стандарта в сосудистых исследований с 1980 года 6. Они считаются классическая модель системы для изучения эндотелиальной функции и адаптации к болезни. Эндотелиальные клетки, выделенные из различных кровеносных сосудов варьируются в appearancе и функциональные возможности из - за генетического фона и воздействия микросреды 7. Кроме того, HUVECs и HUAECs получают из пуповины, а с развитием сосудистой структуры, которая, возможно, не в полной мере имитируют взрослых кровеносные сосуды, в отношении условий, которым они подвергаются, и реакция на болезнь. Следовательно, перевод результатов поиска в HUVECs и HUAECs сердечно-сосудистых заболеваний в целом является недостаточным.

При изучении адаптации и поведение взрослых КЭ, первичные КЭ из емкости интереса следует использовать в качестве более прямой подход. Для того, чтобы изолировать эти клетки, были зарегистрированы несколько методов. Широко описан метод, который также используется для HUVECs, является промывка сосуда с раствором ферментативного расщепления 8. Это часто приводит к загрязнению с не КЭ , таких как клетки гладких мышц и фибробластов 9. Другим часто используемым способом выделения является ферментативное переваривание измельченной ткани сосуда с последующим флуоресцентные-Активированный сортировки клеток (FACS) на основе эндотелиального клеточного маркера кластер дифференцировки (CD) 31 7, 8. FACS сортировочного и последующей клеточной культуры , требует относительно больших количеств клеток , и поэтому не подходит для выделения эндотелием из мелких кровеносных сосудов. Поэтому мы нацелены на разработку нового надежного способа выделения чистого эндотелиальной популяции клеток из различных собачьих кровеносных сосудов с высокой степенью чистоты. Для того, чтобы проверить эффективность нового метода изоляции, мы выделили и получили чистые Собачий Первичные эндотелиальные клетки (ЦАТЭК) культуры из различных собачьих артерий и вен, как больших, так и малых. Этот метод также позволяет культуре эндотелиальных клеток , происходящих из больных и / или аберрантных сосудов , таких как врожденными интра- или экстра-печеночной портосистемных шунтов, распространенное заболевание у собак 2. Метод позволяет выделение дополнительных соответствующих типов клеток одного и того же сосуда, таких как гладкомышечные клетки сосудов, так как большая часть сосуда остается ИНТдействовать во время процедуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика заявление: Кровеносные сосуды, используемые в данном исследовании, собирают способом, получают из свежих собачьих кадавров излишков материала (N = 4) от здоровых собак эвтаназии для неродственных исследований (политики университета 3R). Аберрантных кровеносных сосудов (внутри- и внепеченочных портосистемные шунты, п = 1 каждая) собирали посмертного после информированного согласия владельцев от собак, представленных в университетской клинике для домашних животных из Утрехтского университета.

1. Выделение и культуры первичных Собачий эндотелиальных клеток

  1. Предварительное покрытие 6-луночные планшеты с 2 мл / лунку 0,5% вес / об желатин и оставить в течение 2 ч в инкубаторе с увлажненной атмосфере 5% СО 2 при 37 ° С. Удалите избыток раствора желатина перед посевом первичные клетки.
  2. Консерванта удалить кровеносный сосуд (ы) интерес (например, аорта, полая вена, полая Порте) из свежего собачьего трупа (рис 1А). Поддержание анатомии сосудистой системыпутем размещения прямых щипцов на обоих концах судна, представляющего интерес. Избегайте ненужных манипуляций ткани с щипцами, чтобы предотвратить повреждение эндотелиальных клеток.
    1. Обрежьте зажат сосуд на обоих концах с хирургическими ножницами и удалить из трупа. Транспорт в Хенка сбалансированный солевой раствор (HBSS) на льду.
      Примечание: Длина судна примерно 5 см является предпочтительным для этой процедуры, но те, которые измеряют 1 см будет также обеспечить достаточное количество клеток для культуры.
  3. Перенести кровеносный сосуд в чашке Петри заполнены охлаждаемым льдом HBSS. Используя хирургические ножницы, удалите прилипший ткань и жир с внешней стороны сосуда, сохраняя само судно нетронутыми (рис 1b). Убедитесь, что судно хорошо видна во все времена при резке: тянуть в сторону окружающих тканей с помощью зажима или щипцов для оптимального зрения.
    1. Закройте все ветви сосуда с лигатур (например, полиглактином 3-0) , а затем удалить ихс хирургическими ножницами или скальпелем.
  4. Осторожно ввести конец сосуда с изогнутыми Хальстед противомоскитных щипцов, зажим кончик пинцетом на другом конце сосуда , а затем убирается, медленно переворачивая сосуд , пока он не будет полностью наизнанку (рис 1С-G). Внешняя сторона теперь состоит из слоя эндотелиальных клеток. Если какие-либо трудности встречается при переворачивания судна, погрузить в HBSS снова, чтобы уменьшить трение.
  5. Поместите кошелек-струнные швами на обоих концах судна , чтобы закрыть его полностью и для предотвращения воздействия любого не-эндотелиальной сосудистой ткани к процедуре пищеварения (рис 1H). Используйте лигатуры концы, чтобы манипулировать перевернутый сосуд.
  6. Если пищеварение и культура выполняется позже, криоконсервируют перевернутый сосуд перед тем протоколом переваривания (этап 1.7).
    1. Поместите перевернутый сосуд в криопробирку и залить клеточной культуры замораживания среды. Замораживание до -80 ° С с использованием замораживания COntainer. Хранить при температуре -80 ° C, если сосуды должны быть использованы в течение одной недели. Для длительного хранения, место криопробирок при -180 ° C. При выполнении изоляции EC, растаяйте криопробирки быстро на водяной бане (37 ° C) и сразу же место в охлажденном на льду HBSS. Продолжайте, как указано в пункте 1.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примите во внимание, что общий выход КЭ после выделения будет ниже из-за потери жизнеспособности в процессе замораживания.
  7. Передача судна в 50 мл пробирку и промойте его дважды в HBSS для удаления эритроцитов (или остаточной среды замораживания в случае размораживания) (рис 1I).
  8. Дайджест судна в 50 мл пробирку с раствором 30 мл коллагеназы типа II (0,15 ед / мл) и диспаза (0,15 ед / мл) в собачьих эндотелиальных клеток Рост среднего (CECGM) в течение 1 ч при температуре 37 ° С с прерывистым пологий агитация.
  9. Извлеките сосуд из трубки и центрифугирование клеточной суспензии в течение 5 мин при 250 х г.
  10. Ресуспендируют осадок клеток в CECGM ай семян 2 мл клеточной суспензии на лунку (1 - 3 скважины в зависимости от размера судна). Культуры клеток при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в воздухе и изменение культуральной среды дважды в неделю.
  11. Прохождение клетки, когда конфлуэнтности 70 - 80% достигается.
    1. Вымойте клетки с подогретого HBSS для удаления мертвых или не присоединенные клетки. Добавить 200 мкл рекомбинантной клеточной диссоциации фермента (1x) в каждую лунку и поместить обратно в инкубаторе в течение 5 минут или пока все клетки отсоединяются.
    2. Передача клеток в 15 мл трубки и прекратить трипсинизации путем добавления 10 мл культуральной среды (CEGM), включая 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Центрифуга в течение 5 мин при 250 х г. Продолжить культуру в тарелку или колба желатина, предварительно покрытые.

2. Характеристика

  1. Культура Собачий аортального эндотелиальные клетки (CnAOECs) и сравнить морфологии первичных и коммерческих клеточных линий, два раза в неделю с помощью микроскопа.
    Примечание: Tон типичный растущий образец КЭ в виде пятен может быть лучше всего наблюдается при конфлуэнтности> 70% достигается.
    1. Культура CnAOECs в CECGM на 0,5% вес / об желатин, предварительно покрытых T75 колбу. Прохождение клетки один раз в неделю, когда конфлуэнтности составляет 70 - 80%.
      1. Для пассирования, промыть клетки один раз с подогретого HBSS и добавляют 1 мл рекомбинантного клеточной диссоциации фермента (1x). Поместите колбу обратно в инкубаторе в течение 5 минут или пока все клетки отсоединяются. Деактивировать трипсина путем добавления культуральной среды 10 мл (CEGM), включая 10% FCS. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 250 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл культуральной среды.
      2. В 10 мкл аликвоты клеточной суспензии и разбавить 1: 1 с 0,4% трипановым синим. Граф клеток с использованием автоматизированного счетчика клеток, и осаждаются 4.0 х 10 5 жизнеспособных клеток в новой T75 колбу. Добавьте 10 мл предварительно подогретой CECGM в колбу и культуры при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2.
  2. Изолировать РНК из прохода 1 из культивируемых CaPECs и CnAOECs.
    1. Соберите по крайней мере , 1 × 10 3 клеток в виде гранул, добавляют 20 мкл реагента для подготовки проб (ППР) и инкубировать в течение 1 мин для лизиса клеток. После инкубации, необходимо тщательно собрать клеточный лизат, содержащий тотальную РНК, и хранят при -70 ° С.
  3. Преобразование мРНК в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК (например, iScript) , следуя инструкциям изготовителя. кДНК Хранить при температуре 4 ° C до одной недели или при -20 ° С в течение длительного времени, пока не готова к выполнению КПЦР.
  4. Мера экспрессии гена эндотелиальной маркера CD31, чтобы подтвердить эндотелиальных клеток происхождение. Выполнение экспериментальной установки и количественной оценки с использованием руководящих принципов ПРЕСИС MIQE 10. Для нормализации, измерения экспрессии генов эталонных GAPDH, RPS19 и B2MG 11.
    1. Готовят 10-кратное разведение полученной кДНК в нуклеазная свободной воды.
    2. Подготовить4-кратное разбавление из проб кДНК, объединенных по стандартной линии и использовать нуклеазы свободной воды в качестве контроля нешаблонном. Развести образцов пять раз, чтобы достичь 50-кратного общего разбавления для реакции КПЦР. Пипетка 10 мкл реакции в двух экземплярах в формате 384-луночного с использованием 4 мкл кДНК и 6 мкл флуорофора , смешанного с 20 пмоль обратного и прямого праймера (таблица 1).
    3. Установите программу до 95 ° С в течение 5 мин для активации полимеразы Taq, а затем 39 циклов 10 сек при 95 ° С в течение денатурации и 30 с при Tm для отжига и удлинения. Тт для каждого праймера набора приведен в таблице 1.
    4. Perform кривой плавления анализа после каждого бежать, чтобы обеспечить только один продукт усиливается. Осуществить нормировку уровни экспрессии образцов, используя среднее относительное количество эталонных генов, и вычислить & Delta; CТ если эффективность реакции составляет от 95% до 105%.
  5. Оценка функциональных возможностей ИС с Angiogenesis анализ.
    1. Добавьте 10 мкл внеклеточного матрикса в каждую лунку предварительно охлажденный ангиогенеза горкой и намазать наконечником пипетки, чтобы покрыть поверхность скважины. Держите внеклеточный матрикс на льду и избежать введения пузырьков воздуха в гель. Затвердеть гель, помещая стекло в чашку Петри с водой замачивают бумажных полотенец в термостате при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в течение 30 мин.
    2. Добавить 1,0 × 10 4 первичных КЭ в 50 мкл эндотелиального роста среднего на лунку. Инкубировать слайд в течение 6 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
    3. Через 6 ч фотографировать с увеличением 20X, убедившись в том, чтобы включить все хорошо в изображении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Различные кровеносные сосуды были успешно подвергнуты описанному протоколу изоляции (рисунок 2). Можно было препарировать и инвертировать аорта, полая вена, полую и Порта, коронарной артерии от здоровых собак (все сосуды от каждой собаки, п = 4). С того же подхода КЭ были выделены из двух врожденных портосистемные шунты (внепеченочных и внутрипеченочных, п = 1 каждый). Хотя аорту легко инвертировать, грудные сегменты аорты более сложной, чем брюшной аорты. В грудных сегм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В исследованиях , посвященных собачьего КЭ основной линии CnAOEC используется для моделирования эндотелиальные родословных собаки 3, 12, 13. В исследованиях на людях, культуре HUVEC по - прежнему считается золотым стандартом. Очевидно, ориентируясь только на КЧС, полученных из пуповины является фирма ограничение в сердечно-сосудистых исследований. Эндотелиальные клетки имеют специфический характер экспрессии генов, определяющий артериовенозной спецификации. Для того, чтобы учесть эти различия в послеродовых с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность Хансу де Граафу и Томасу Венендалю за их техническую помощь в культивировании ЭК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа типа IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAXLife Technologies31966-021
Сбалансированный солевой раствор Хэнка LifeTechnologies14025-050
Среда для роста эндотелиальных клеток собак Клеточное применениеCn211-500
CnAOECsКлеточное применениеCn304-05
Фетальная сыворотка теленка (FCS) GE Healthcare16000-044
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013
SPRBio-Rad170-8898
Набор для синтеза iScriptBio-Rad170-8891
SYBR зеленая суперсмесьBio-Rad170-8886
Среда для замораживания клетоквосстановления Gibco/Life Technologies12648-010Держите на льду перед использованием
Контейнер для заморозки, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562
ЖелатинSigma-AldrichG1890
Хирургические ножницы (Майо или Метценбаум)B. Braun MedicalBC555R
Москитные щипцы B. Braun MedicalFB440R
Щипцы от комаров изогнутыеB. Braun MedicalFB441R
полиглактин 3-0EthiconVCP311H
трипановый синийBio-Rad145-0013
Автоматизированная счетная камераBio-Rad145-0102
Счетные стекла, двухкамерныеBio-Rad145-0011
MatrigelBD BiosciencesBD356231Медленное оттаивание на льду
&-микро-горка АнгиогенезIbidi81501
Эндотелиальный рост СредаLonzaCC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit ЛонзаСС-4176

Ссылки

  1. Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
  2. van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
  3. Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128(2012).
  4. Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
  5. Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445(2015).
  6. Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
  7. Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
  8. van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
  9. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183(2007).
  10. Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74(2010).
  11. Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
  12. Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
  13. Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
  14. van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
  15. Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
  16. Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Эндотелиальные клетки собакметод инверсии сосудовколлагеназное перевариваниепротокол культивирования клетокмаркер эндотелиальных клетоканализ ангиогенезатест с исклюًчением трипанового синегопокрытие желатиномподдержание пассажей клеток
Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.