Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Маркировку рака молочной железы на пациента получены ксенотрансплантатов с прослеживаемы Репортеров для опухолевого роста и метастазирования исследований

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54944

⸱

30 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем метод стабильной классификации пациентов происхождения ксенографтов (PDXs) с лентивирусов частиц, выражающих зеленого флуоресцентного белка и люциферазы журналистам. Этот метод позволяет отслеживать рост PDXs на основной сайт, а также обнаружение спонтанных и экспериментальные метастазы , используя в естественных условиях систем формирования изображения.

Аннотация

Использование доклинических моделей для изучения биологии опухоли и реакции на лечение занимает центральное место в исследованиях рака. Давно существующие клеточные линии человека и многие трансгенные модели мышей часто не в состоянии повторить ключевые аспекты злокачественных новообразований человека. Таким образом, разрабатываются альтернативные модели, которые лучше представляют гетерогенность опухолей пациентов и их метастазов. Модели ксенотрансплантатов (PDX), полученные от пациента (PDX), в которых хирургически резецированные образцы опухоли приживаются мышам с ослабленным иммунитетом, стали привлекательной альтернативой, поскольку они могут быть трансплантированы через несколько поколений и более эффективно отражают гетерогенность опухоли, чем ксенотрансплантаты, полученные из линий раковых клеток человека. Ограничением использования PDX является то, что их трудно трансфектировать или трансдуцировать для введения отслеживаемых репортеров или для манипулирования экспрессией генов. В настоящем протоколе описаны методы трансдукции диссоциированных опухолевых клеток из PDX с высокой эффективностью трансдукции, а также использование меченых PDX для экспериментальных моделей метастазов рака молочной железы. Протокол также демонстрирует использование меченых PDX в экспериментальных моделях метастазирования для изучения процесса колонизации органов метастатического каскада. Метастазы в различные органы могут быть легко визуализированы и количественно оценены с помощью биолюминесцентной визуализации у живых животных или экспрессии GFP во время вскрытия и в удаленных органах. Эти методы являются мощным инструментом для расширения использования нескольких типов PDX для исследования метастазирования.

Введение

Развитие пациента , полученных ксенотрансплантатов (PDXs), где хирургическим резецированные образцы опухолей привиты непосредственно в ослабленным иммунитетом мышей, имеет ряд преимуществ по сравнению со стандартными моделями клеточных линий ксенотрансплантатных и представляет собой значительный шаг вперед в исследовании рака 1,2. PDXs может быть сохранена и расширена за счет последовательных проходов с минимальным изменением генетических и биологических характеристик опухоли, выращенной при первом прохождении; и более точно отражает гетерогенность опухоли , чем ксенотрансплантаты , полученные из клеточных линий рака у человека 3-8. Эти модели в настоящее время широко используются в качестве платформы для персонализации лечения рака 9,10, как доклинических платформы в разработке лекарственных средств 6,11 и в качестве экспериментального инструмента для изучения биологии рака 4,12.

Большинство PDXs имплантируются и культивируют подкожно, что посильно позволяет производить измерение роста опухоли с течением времени с использованием калибров. Однако, Метастатическое заболевание было более сложно смоделировать с помощью PDXs. Специально для рака молочной железы, ксенотрансплантаты с метастатической способности к различным органам были описаны 3,5,13, но частота спонтанного распространения на метастазами крайне низка. Там, где сообщалось, идентификация и количественное определение метастатического бремени опирается на кропотливого гистологического исследования органов-мишеней посмертных. линии раковых клеток, экспрессирующих биолюминесцентного (люциферазы, Luc) или флуоресцентный (зеленый флуоресцентный белок, GFP), репортеры ген обычно используются в экспериментальных моделях рака молочной железы метастазы в головном мозге, легких, костей и печени после внутрисердечной, хвостовой вены, intrafemoral и селезеночной инъекции 14-16. В то время как эти модели обходят распространение от первичных опухолей, они имеют важное значение для изучения механизмов тропности органов и метастатического колонизации. Однако клетки, полученные из первичных опухолей пациентов и PDXs может иметь низкую цену или трансфекцию трансдукции USINг стандартные процедуры. Один из альтернативных вариантов заключается в создании PDX-клеточных линий , полученных в пробирке 17, который может быть затем метили с использованием традиционных протоколов культуры ткани. Такой подход, однако, не подходит для маркировки большинства PDXs, для которых клеточная линия вывод является трудным и может изменить фенотип клеток. Здесь мы приводим протокол для трансдукции PDX-диссоциированных опухолевых клеток с лентивирусов векторы , подходящие для работы с изображениями в естественных условиях. Кроме того, мы описываем экспериментальную метастаз с помощью внутрисердечной инъекции диссоциированных Luc-GFP меченых клеток PDX мышей с иммунодефицитом.

Базовый протокол для трансдукции PDX-диссоциированных органоидам с геном-репортером , выражающей лентивирусов ранее был описан 18. В текущем протоколе мы опишем дополнительные методы для обогащения опухолевых клеток человека и получить около 100% эффективность трансдукции, а также использование меченых PDXs для обнаружения экспериментального рака молочной железыметастаз. Этот протокол может быть адаптирован для маркировки нескольких типов рака согласно PDXs с различными люминесцентными и флуоресцентных маркеров, а также модуляции экспрессии генов (т.е. shRNA нокдауна интерес генов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все шаги, требующие использования животных в этом протоколе следует руководству Университета Колорадо комитета по этике исследований на животных (IACUC).

1. Подготовка инструментов, медиакультуры и другие реагенты

  1. Приготовьте 100 мл mammosphere среды, содержащей модифицированную по Дульбекко и Хана F-12 среде Дульбекко (DMEM / F12) (1: 1), базовый фактор роста фибробластов (bFGF, 20 нг / мл), эпидермальный фактор роста (ЭФР, 10 нг / мл ), гепарин (4 мкг / мл), 1x В27, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл). Сделать СМИ в стерильных условиях и хранят при температуре 4 ° С в течение 3-х месяцев.
  2. Готовят эпителиальную буфер обогащения (ЕЭБ), содержащий PBS рН 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ ЭДТА. Фильтр стерилизовать и хранить при температуре 4 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Сделайте 5 мл аликвоты пищеварения буфера в стерильные 15 мл конические пробирки и хранят при -20 ° С в течение нескольких месяцев. В ночь перед опухолевой пищеварения, оттепель пищеварения буфера (5 мл на 500 мгопухоль) на льду, при температуре 4 ° С. Добавить 1x антибиотик-противогрибковое смесь перед использованием.
  4. Автоклавы (121 ° С в течение 30 мин) по меньшей мере, два пинцеты, скальпель и ножницы для рассечения PDXs.
  5. Сделать 500 мл промывочного буфера, содержащего DMEM: F12 и 5% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Алиготе 10 мл на опухоль в день опухоли рассечение.
  6. Подготовьте полибрен запас на 4 мкг / мкл стерильной водой. Фильтр и аликвоты в 1,5 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие 100 мкл каждого, хранить при температуре -20 ° C.

2. Генерация высоких титрах Lentiviral частицы, несущие прослеживаемы Маркеры

  1. Покупка или генерировать высокий титр лентивирусов частицы , несущие ген - репортер (т.е.., GFP и Люк для отслеживания в естественных условиях роста опухоли) 18,19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: лентивирусов титр> 10 8 TU / мл (трансдукции единиц на миллилитр) рекомендуется для успешной трансдукции PDXs. Лентивирусов рСтатьи должны быть pseudotyped с конвертом G гликопротеин из Вирус везикулярного стоматита (VSV-G), что позволяет трансдукции самых разнообразных клетках млекопитающих.
    Примечание: Протокол , используемый здесь для генерации и титрования с высоким титром лентивирусов частиц можно найти на www.kottonlab.com . Векторы, используемые в настоящем протоколе являются pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro и двойственное промотор фага EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W. Этот вектор был создан путем замены Dsred с геном люциферазы ниже по течению от EF1aL промотора в фаг-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W вектор, своего рода дар Даррелл Коттон, Бостонский университет.

3. Генерация пациента, полученных ксенотрансплантатов

  1. Сформировать пациента получены ксенотрансплантаты (PDX) от рака молочной железы путем имплантации первичных и метастатических опухолей молочной железы в молочной жировой слой иммунодефицитами мышей 3,4. Сформировать опухоли при максимальной рекомендуемой величины диаметра 1 см, как более крупные опухоли лikely содержат некротические ядра.
    Примечание: Подробные методы создания и пересадки ксенотрансплантаты описаны в Дероз и др. 18. Рост установленных перевивных-PDXs в> опухолей см диаметр 1 занимает от 4 до 24 недель после имплантации в иммунодефицитами NOD / SCID / ILIIrg - / - (NSG), в зависимости от собственных темпов роста опухоли. В то время как этот протокол описывает трансдукции рака молочной железы PDXs, он может быть использован для вирусной трансдукции любой опухоли , подходящей для краткосрочных экстракорпорального прохода. Чувствительность PDXs к краткосрочным (24 - 96 ч) в пробирке выживания присуща каждой опухоли и должна быть определена экспериментально.

4. Опухоль Вскрытие и диссоциация PDX-производных опухолевых клеток

  1. Усыпить мышей , несущих PDX с использованием CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков (следуют институциональные рекомендации исследовательской комиссии по этике животных). Погрузитесь мышей в 0,2% Chlorhexidine раствор в течение 1 мин. Установите курсор на положении лежа на спине на верхней части рассечение доски, а также использовать штифты для фиксации расширенные верхние и нижние конечности к доске.
  2. С помощью асептической техники, использовать скальпель, чтобы разрезать кожу вокруг опухоли. Подтягивает кожу с набором щипцов и отделить его от опухоли с помощью чистой скальпелем до тех пор, пока опухоль не полностью подвергается. Используя чистую набор щипцов и скальпеля, удалить опухоль и поместить его в 5 мл мыть носитель на льду.
  3. Возьмите рассеченные опухоль в шкаф BLS2 для дальнейшей обработки. Удалить вложение и прополоскать опухоль с 10 мл Хэнкса сбалансированном солевом натрия модифицированными с 10 мМ HEPES (HBSS / HEPES), в два раза.
  4. Отбросьте опухоль в стерильном предварительно взвешенную 60 см планшета для культуры ткани. Взвесить пластину, содержащую опухоль, для оценки массы опухоли.
  5. Используя скальпель, разрезал опухоль пополам, а затем вырезать 3 мм диск из одной половины и поместить его в контейнер с 10% -ным формалином в течение 24 часов. Используйте эту ткань для того чтобы проверить гетерогенностьОбразец опухоли (родительская PDX). Добавить 200 мкл HBSS / HEPES (достаточно, чтобы избежать ткани высохнуть) и пропустить через мясорубку оставшуюся опухоль в минимально возможные части, используя пинцет и чистый скальпель.
  6. Передача рубленое опухоль в стерильный 50 мл коническую трубку. Добавить по крайней мере, 1 мл буферного раствора, содержащего переваривания 1x противогрибковое-антибиотик на 100 мг опухоли.
    Примечание: добавление антибиотиков / противогрибкового средства предотвращает загрязнение опухолевых клеток в пробирке.
  7. Дайджест опухоли в течение 3 ч при 30 ° С, встряхивая при 125 - 200 оборотов в минуту.
    Примечание: Повышение температуры до 37 ° С повышает эффективность пищеварения (более отдельных клеток с течением времени), но это, как правило, сопровождается увеличением гибели клеток. Для большинства опухолей, сбраживание при 30 ° С в течение 3 ч приводит в достаточном количестве жизнеспособных диссоциированных клеток, чтобы перейти к шагу маркировки.
  8. Остановить пищеварение, добавляя 35 мл мыть носителя (DMEM / F12 с 5% FBS). Фильтруют через нейлон 70 мкм сито в чистый мл C 50onical трубка для удаления непереваренной ткани. Центрифуга отфильтрованные средах, содержащих переваренные клетки при 400 мкг в течение 5 мин.
  9. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток лизис буфера. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  10. Добавляют 10 мл промывочного буфера (DMEM: F12, 5% FBS), чтобы остановить лизиса. Проходят клетки через 40 мкМ нейлоновая сетка, чтобы удалить сгустки. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин и удаления надосадочной жидкости, место на льду.
  11. Ресуспендируют переваривали клетки в 5 мл буфера для промывок и рассчитывать как жизнеспособные и нежизнеспособные клетки с использованием трипанового синего. Если коротко, то смешайте 50 мкл клеток и 50 мкл трипанового синего и считать трипанового-синих исключающие клеток с помощью гемоцитометра.
    Примечание: Этот неочищенный переваривания продукт будет содержать клетки опухоли человека , полученные из PDX, а также мышь стромальных клеток (фибробласты, клетки крови и др.). Переваренной клетки теперь могут быть обработаны для маркировки (стадия 6), или раковые клетки человека могут быть обогащены с помощью одной из процедур, описанныхв работе 5.

5. Обогащение клеток человека рака эпителиальной

  1. Разрушающим клетки мыши стромальные с помощью родословие Истощение набора (Lin +) клеток 20.
    Примечание: Рекомендуется для высоко васкуляризированных опухолей и / или опухолей с высоким содержанием стромы, в которых экспрессия EpCAM неизвестна или утраченного).
    1. Возьмите до 10 7 жизнеспособных клеток в чистой 5 мл полипропиленовую пробирку, добавляют 2 мл ЕЭБ и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Отбирают пипеткой супернатант полностью.
    2. Осадок клеток Ресуспендируют в 40 мкл охлажденного льдом EEB на 10 7 клеток.
    3. Добавьте 10 мкл биотин-антитело коктейле на 10 7 клеток, перемешать, осторожно пипеткой и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин (коктейль содержит антитела к клеткам Lin + мышь).
    4. Добавьте 30 мкл холодной EEB на 10 7 клеток, перемешать, осторожно пипеткой.
    5. Добавьте 20 мкл анти-биотин микрошариков на 10 7 клеток перемешать, осторожно пипеткой и инкубировать при температуре 4 & #176 ° С в течение 15 мин.
    6. Вымойте клеток с 3 мл холодной EEB, центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл EEB и место на льду.
    7. Поместите колонку в магнитном поле магнитного сепаратора. Промыть колонку с 0,5 мл эпителиальной буфера обогащения и дайте ему капать через. Не допускайте, чтобы столбец высохнуть.
    8. Поместите новую коллекцию полипропиленовую трубку под колонкой. Медленно, добавьте 500 мкл, содержащих меченых клеток через колонку (Lin + меченых клеток будут сохранены в магнитном колонке). Сбор сточных вод в качестве фракции с немеченых клеток, представляющих фракцию клеток, обогащенной родословная отрицательной (опухоль).
    9. Полоскание в столбце 3 раза с помощью 500 мкл приливами и собирают сточные воды в той же трубе в виде стоков на этапе 5.1.8. Хранить сточные воды на льду и переходите к шагу маркировки (6).
    10. Дополнительно: Возьмите столбец вне магнитного поля. Поместите новую полипропиленовую трубу поди элюции LIN + фракции путем добавления 500 мкл EEB, три раза и с помощью прилагаемого плунжера.
  2. Обогащение EpCAM + эпителиальных раковых клеток человека (рекомендуется для лечения опухолей, известных выразить CD326 + и содержат высокое содержание стромы мыши).
    1. Возьмите до 10 7 жизнеспособных клеток в чистой 5 мл полипропиленовую пробирку, добавляют 2 мл холодной ЕЭБ и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин. Отбирают пипеткой супернатант полностью.
    2. Осадок клеток Ресуспендируют в 60 мкл охлажденного льдом ЕВВ на 10 7 клеток.
    3. Добавьте 20 мкл EpCAM микрошариков на 10 7 клеток, перемешать, осторожно пипеткой и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
    4. Вымойте клеток с 3 мл холодной EEB, центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл EEB и поставить на лед.
    5. Поместите колонку в магнитном поле мини-сепаратора. Промыть колонку с 0,5 мл EEB и дайте ему капать через. Не допускайте, чтобы высушить колонкувне.
    6. Поместите новую коллекцию полипропиленовую трубку под колонкой. Медленно, добавьте 500 мкл, содержащих меченых клеток через колонку (EpCAM + меченые клетки будут сохранены в магнитном колонке). Сбор сточных вод в качестве фракции с немеченых клеток, представляющих мышь стромальных клеток.
    7. Промыть колонке 4 раза 500 мкл буфера для ME и собирать сточные воды в той же трубе в виде стоков на этапе 5.1.8.
    8. Возьмем столбец вне магнитного поля. Поместите новую полипропиленовую трубу под и элюции EpCAM + фракции путем добавления 500 мкл буфера, МЕ три раза. Вымывать магнитно меченых клеток, плотно нажимая на поршень в колонну. Сбор стоков, содержащий обогащенную EpCAM + опухолевых клеток фракции и держать на льду. Перейдите к шагу 6.

6. Трансдукция PDX-производных опухолевых клеток

  1. Центрифуга диссоциированных опухолевых клеток при 300 5 мин GX и ресуспендируют в 2 мл mammosphere лечеба. Количество жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего, как и в 4.11.
  2. Приготовьте 10 мл mammosphere среды, содержащей 8 мкг / мл полибрена (2 мкл акций полибрена на мл носителя).
  3. Определить объем , необходимый для 2 - х 10 5 жизнеспособных опухолевых клеток. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют осадок в 2 мл полибрена средах. Пластина 2 х 10 5 жизнеспособных опухолевых клеток на лунку в культуральной пластины 6-хорошо сверхнизкой прилипание ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптимальное количество клеток, необходимых для трансдукции с одним лентивирусов вектора.
    ВНИМАНИЕ! Lentiviral частицы и все расходные материалы, используемые с лентивирусов частиц должны быть обработаны следующие организационные процедуры рекомбинантных ДНК биологической опасности.
    Примечание: лентивирусов трансдукции первичных клеток молочной железы сильно способствует миоэпителиальных клеток , которые могут привести к плохому маркировке просветными клеток и селекции субпопуляций опухолевых клеток во время мечения 21.
    4. <литий> Выдержите вирус с 200 мЕд / мл нейраминидазы при 37 ° С в течение 1 ч до начала трансдукции , чтобы увеличить связывание вирусных частиц в различных субпопуляций первичных клеток и коррекции этого потенциального смещения 21.
  4. Добавить лентивирусов частиц при 10 MOI (2 × 10 6 ТУ в течение 2 × 10 5 жизнеспособных клеток) , если PDX-диссоциированные клетки истощаются из клеток Lin + мышь или обогащены EpCAM + клеток. Добавить лентивирусов частиц при 30 MOI (6 х 10 6 ТУ на 2 х 10 5 жизнеспособных клеток) при использовании не-обогащенных PDX-диссоциированных клеток.
    Примечание: Увеличение МВД России позволяет эффективно трансдукции даже при наличии большого количества мусора и мертвых клеток в сырых экстрактах. Держите одну скважину с немеченых клеток, чтобы служить в качестве контроля для жизнеспособности и эффективности трансдукции.
  5. Вихревой смешивать вируса с клетками. Инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2 в течение до 96 часов. Добавьте 500 мкл свежей mammosphere СМИ 24 ч после трансфекции. Клетки не АТТАКч к пластинам, не аспирата средств массовой информации.

7. Оценка эффективности трансдукции и повторной имплантации меченых клеток мышей с иммунодефицитом

  1. Монитор экспрессии отслеживаемой маркера (GFP) каждые 24 часа в сутки с помощью флуоресцентного микроскопа на 10-кратным увеличением.
    Примечание: GFP выражение можно наблюдать уже через 24 часа после заражения , но в большинстве PDXs экспрессия GFP отчетливо видна через 72 часа (рисунок 1).
  2. Оценить эффективность трансдукции путем оценки процентного содержания GFP + клеток в пределах общей скважины.
    Примечание: Поскольку культуры содержат опухолевые клетки, остаточные стромальные клетки и мертвые клетки в различной степени, лунки ниже 10% GFP + клетки могут быть имплантированы в хост-мыши.
  3. Передача трансдуцированных клеток из 6-луночные планшеты в 15 мл коническую пробирку. Добавляют 1 мл mammosphere носителя в скважину, чтобы собрать все клетки остались позади. Место на льду.
  4. Добавьте 10 мл HBSS / HEPES для трансдуцированных клеток и Сentrifuge при 300 мкг в течение 5 мин, 4 ° С. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в 50 мкл подвальный матрицы экстракта (BME) на льду.
    Примечание: BME аликвоты должны быть оттаивали на льду, 1 - 2 ч до использования. БМЭ будет затвердевать при комнатной температуре; держать на льду во все времена.
  5. Загрузите BME внедренных клеток в шприц 0,5 мл инсулина, держать на льду, и привести к виварии для реимплантации в ГЯП мышей.
  6. Обезболить самка 4 - 8 недель старых мышей ГЯП, используя 5% изофлуран / 95% кислорода в течение 5 мин, а затем 2% изофлуран / 98% кислорода или в соответствии с утвержденными этике исследований на животных утвержденным протоколом.
  7. Когда животное не реагирует на болевые раздражители (схождение-пинч), очистите область инъекции с последующим бетадин салфетками этанолом, и вводят в 50 мкл клеток в 4 - й молочной жировой ткани. Обеспечить мышей с обезболивании для облегчения инъекции дискомфорта, как указано в протоколе утвержденного.
  8. Разрешить клетки образуют опухоли (2 - 12 недель) и следить за GFP и / илиактивность люциферазы с использованием перестраиваемого системы света и / или в естественных условиях системы люциферазы визуализации (рисунок 2).
    Примечание: Следуйте рекомендациям для анестезии, анальгезии, измерения опухолевой и критериев эвтаназии, утвержденных институциональное животных комитетом по этике.

8. Контроль качества меченых PDXs

  1. Определить эффективность маркировки путем оценки люциферазы и экспрессии GFP в меченых опухолях.
    Примечание: Следуйте институциональное животных исследования комитет по этике утвердил процедуры в естественных условиях биолюминесценции томографии (рис 2, 3).
    1. Dissect опухоли размером от умерщвленных мышей, когда размер опухоли достиг 1,0 - 1,5 см в диаметре (или до того в соответствии с утвержденными протоколами, как описано в разделе 4). Препарирование следует проводить в соответствии с системой перестраиваемый света (или эквивалентную систему, которая позволяет оценить флуоресценции GFP).
    2. От каждой опухоли, качественно оценить реrcentage из GFP + опухоли с помощью микроскопии. Если меньше, чем 100%, рассекают только GFP + часть. Рассекают мм диск 3 и зафиксировать в 10% формалине для парафин и гистологического анализа, за исключением небольшой кусочек для РНК или других желаемых анализов, и сохранить как большую часть опухоли, как это возможно в отдельных 1,5 мл криопробирок, содержащих 90% FBS / 10% ДМСО для криоконсервации.
  2. Re-имплантатах части меченых опухоли в новые реципиента NSG мышей 18 , чтобы расширить и использовать в экспериментальных исследованиях метастазирования.
  3. Выполните стандартную иммуногистохимическое окрашивание парафином тканей, полученных из опухолей до трансдукции и в каждом поколении после этого проверить, что меченые PDXs остаются гистологическое похожи на оригинальные PDXs.
    Примечание: Маркеры, используемые для контроля качества меняются в зависимости от каждого PDXs. Для рака молочной железы PDXs, экспрессия рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2), рецептор эпидермального фактора роста 1 (HER1 или EGFR), годовыхн-цитокератин (пан-CK) рекомендуются для первичного скрининга.

9. Экспериментальные модели метастаза с мечеными PDXs

  1. После действия, описанные в разделе 4, диссоциируют опухолевых клеток из меченого PDX. Если опухоль насыщена сосудами или богатой стромы мыши, выполняют обогащение раковых клеток, как описано в 4.5 или 4.6.
  2. Количество жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего, и разбавьте 250000 клеток в 100 мкл PBS (Ca 2+, Mg 2+) бесплатно на мышь. Сохранить клетки на льду. Для инъекции нескольких мышей, корректировать число, соответственно (и подготовить избыток по меньшей мере, одной дополнительной инъекции, чтобы учесть наличие ошибок при использовании пипеток).
  3. Доведите клетки на льду в соответствующей процедуре помещения для животных и перейти к внутриотраслевой сердца инъекций в соответствии с утвержденным протоколом IACUC.
    Примечание: Подробные протоколы внутри сердца инъекции раковых клеток, были описаны в другом месте 22,23.
  4. Отслеживание и количественно метастатическогорастянут во времени с использованием биолюминесцентного изображений. Визуализируйте макроскопические метастазы в различных органах с помощью биолюминесценции и / или GFP визуализации изолированных органов при аутопсии 24 (рисунок 6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот метод описывает трансдукции PDX-диссоциированных клеток рака молочной железы с использованием высоких титрах лентивирусов векторов pSIH1-H1-copGFP-T2A-Puro и фаг-EF1aL-люциферазы-UBC-GFP-W. Эти векторы экспрессии флуоресцентный маркер , который позволяет оценить эффективность трансдукции в пробирке, а уже через 24 ч после заражения (рис 1а). Для большинства PDXs, экспрессия GFP будет задержано до 72 часов после инфицирования (рис 1b), в это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе:

Применение с высоким титром лентивирусов частиц (> 10 8 TU / мл) является важным шагом в успехе этого протокола, так как позволяет тщательный контроль состава СМИ во время трансдукции в пробирке. В то время как многочисленные методы производства с высоким титром вирусных частиц были хорошо описаны 18,19; этот протокол использует лентивирусов частицы , полученные , как описано подробно на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Даррел Kotton в Бостонском университете для обеспечения фаг-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W вектор и протоколы для производства лентивирусов с высоким титром, используемых в этих исследованиях. Эта работа была профинансирована DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) и R01 CA140985 (CAS) грант .NCI P30CA046934 Центр поддерживается в естественных изображений и тканевой культуры, сердечники в университете Колорадо AMC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/F12 (1:1)ГиклонSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
гепаринSigmaH4784
B27Gibco/Thermo Fisher17504-44
Антигрибковые антибиотикиHycloneSV30010
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105-500Буфер для пищеварения
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS красный Ca2+/mg2+ свободныйHycloneSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
Cultrex CultrexCultrex3433-005-01Экстракт матрицы основания (BME)
30 ° C шейкерNewBrunswick Scientific CO. INCSeries 25 Инкубатор шейкер
70 μ m фильтрыFalcon7352350
скальпелиFisher22079690
дезинфицирующее средство ClorhexidineDurvet NDC# 30798-624-35
Красная кровь  реагент для лизиса клетокSigmaR7757
НейраминидазаSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326+) микрогранулы*Miltenyil Biotec130-061-101
Набор для истощения клеток линии, мышь*Miltenyil Biotec130-090-858
MiniMACS Separator Miltenyil Biotec130-042-102
Магнитная стойка Mini MACSМагнитная стойка Miltenyil Biotec130-042-303
Колонны MSMiltenyil Biotec130-042-201Можно использовать колонки MS или LS, регулируйте по количеству ячеек.
Illumatool Настраиваемая световая системаLightools исследованияРазличныеДля флуоресцентной визуализации in vivo
Устройство для визуализации Xenogen IVIS200РазличныеДля визуализации in vivo люминесценции
Клон цитокератина человека MNF116 Моноклональное антителоDAKOM0821Пан-цитокератин 
Антитела к рецептору эпидермального фактора ростаКлеточная сигнализация4267SEGFR

Ссылки

  1. Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
  2. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Kabos, P., et al. Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures. Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).
  5. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  6. Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research. Curr Protoc Pharmacol. , (2012).
  7. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  8. Garrido-Laguna, I., et al. Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).
  9. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).
  10. Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy. Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).
  11. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  12. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).
  13. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  14. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  16. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  17. Powell, E., et al. p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).
  18. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Curr Protoc Pharmacol. , (2013).
  19. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  20. Indumathi, S., et al. Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology. Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).
  21. Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias. Nat Commun. 6, 6927(2015).
  22. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (67), e4260(2012).
  23. Kang, Y. Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis. Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).
  24. Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).
  25. Lawson, D. A., et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PDX-модель рака молочной железылентивирусная трансдукциямечение опухолевых клетокбиолюминесцентная визуализацияэкспрессия GFPдиссоциация опухолиобогащение эпителиальными клеткамивизуализация in vivo
Маркировку рака молочной железы на пациента получены ксенотрансплантатов с прослеживаемы Репортеров для опухолевого роста и метастазирования исследований
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.