Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение жирных кислот в

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54960

⸱

5 декабря 2016 г.

 ,  , 
1UMR408 SQPOV, Sécurité et Qualité des Produits d'Origine Végétale, INRA, Université d'Avignon, 2UMR1333 DGIMI, INRA, Université de Montpellier

В этой статье

Краткое содержание

Мы предлагаем протокол для идентификации жирных кислот без необходимости их очистки. Он сочетает информацию о времени удержания с масс-спектрами трех типов производных жирных кислот: метиловых эфиров жирных кислот (FAME), производных 4,4-диметилоксазолина (DMOX) и 3-пиридилкарбиниловых эфиров (пиколинил).

Аннотация

Разновидности Bacillus содержат разветвленной цепью и ненасыщенных жирных кислот (FAS) с различными позициями метильной ветви (МОС или anteiso) и двойной связи. Изменения в составе FA играют решающую роль в адаптации бактерий к окружающей их среде. Эти изменения влекут за собой изменения в соотношении по сравнению с ISO anteiso разветвленным ассоциациям, а в пропорции ненасыщенных FAS относительно насыщенного, с НЧ двойными связями, созданных на определенных позициях. Точная идентификация профиля FA необходимо понять механизмы адаптации видов Bacillus.

Многие из Bacillus ТВС не имеются в продаже. Стратегия, предлагаемая в настоящем документе идентифицирует ассоциациям путем объединения информации о времени удерживания (при расчете длины цепи эквивалентная (СТЭК)) с масс-спектров трех типов производных ФА: метиловых эфиров жирных кислот (FAMEs), 4,4-диметил оксазолина производные (DMOX), и3-pyridylcarbinyl эфир (пиколинил). Этот метод может идентифицировать ассоциациям без необходимости очистки неизвестного FAS.

Сравнивая хроматографические профили FAME , полученного из Bacillus сегеиз с коммерческой смеси стандартов позволяет для идентификации неразветвленной насыщенной выборке FAS вычисление ЭСЛ и гипотезы о личности другого FAS. FAMEs разветвленных насыщенных ФА, изо или anteiso, отображать постоянный отрицательный сдвиг в ЭХЛ, по сравнению с линейными насыщенными НЧ с одинаковым числом атомов углерода. FAMEs из ненасыщенных ЖК могут быть обнаружены с помощью массы их молекулярных ионов, а также приводят к положительному сдвигу в ЭХЛ по сравнению с соответствующим содержанием насыщенных FAS.

Разветвляющий положение ШДС и двойная позиция связь ненасыщенных ЖК могут быть идентифицированы с помощью масс-спектров электронов ионизации пиколинила и DMOX производных, соответственно. Данный подход определяет все неизвестные насыщенное ветвье изд ФА, ненасыщенный прямой цепью ШДС и ненасыщенные разветвленные ФА от эхиноцереус экстракта B..

Введение

Жирные кислоты метиловый эфир (FAME) газовой хроматографии (ГХ) является важным методом для определения характеристик липидов. Он быстро отделяется и количественно различные жирные кислоты (FAS) образца после короткой стадии экстракции. Производные сложных метиловых эфиров обладают высокой летучестью, стабильными и инертными по отношению к хроматографической колонке, тем самым избегая хвостохранилищ пиков. Их идентификация довольно проста, когда образец состоит из хорошо известных, так как ТВС Хроматографические профили, либо опубликованы или по сравнению со стандартами. Кроме того, повторная инъекция калибровочных стандартов для количественного определения различных ФАР не требуется, учитывая их почти постоянной ответ на обнаружение пламенно - ионизационным детектором (FID) 1.

В дополнение к FID, обнаружение масс-спектрометрии (МС) обеспечивает дополнительный набор информации для подтверждения FAMEs. Однако, когда FAMEs заряжены с использованием электронной ионизации (EI), полученные спектры не всегда позволяют йэлектронной идентификации ФА тонкой структуры. Например, ветвление положение (т.е. разветвленную метильную группу) трудно предсказать , поскольку диагностические ионы трудно обнаружить 1 и характерное изменение целевого ионного изобилия является машинно-зависимой, предотвращение использования массовых библиотек спектров 2. Еще одна проблема заключается в определении позиции двойного сцепления, так как EI вызывает двойной миграции связи. Таким образом, FA изомеры с различными двойные позиции облигации не могут быть дифференцированы по их масс-спектров. К счастью, другие инструменты были разработаны для идентификации FA. Например, наличие и положение разветвлений или двойных связей в ТВС может быть высказано предположение , путем вычисления длины цепи эквивалент (ECL) 3.

Другие методы дериватизации приводят к различным масс-спектров, в зависимости от местоположения двойной связи или разветвленной метильной группой. 4,4-диметил производные оксазолина (DMOX) 4 позволяют для EASY определение положения мононенасыщенных жирных кислот двойных связей. 3-pyridylcarbinyl эфир (пиколинил сложный эфир) производные позволяют однозначной идентификации местонахождения метилразветвленного 5 ФА. Комбинирование сохранение хроматографический (ECL) и масс - спектры (DMOX и пиколинила) информация позволяет идентифицировать большинства ТВС без необходимости использования сложных способов очистки, как это требуется для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектра, бесспорного метод структурной характеристики 1 ,

Бактерии рода Bacillus, которые включают в себя некоторые патогены человека и животных, способны колонизировать весьма разнообразные ниши и поэтому широко распространены в окружающей среде 6. Среди Bacillus рода, состав ФА под влиянием экологической ниши вида с модуляциями в структуре ФА , чтобы адаптироваться к широкому спектру экологических изменений (например, среда для роста, температуры,рН и т.д.) 7-9. Из-за относительной однородности рисунка FA через видов рода Bacillus , в процессе роста в стандартных условиях, определение состава ФА является одним из основных критериев , используемых для определения видов Bacillus. Уникальный атрибут рода Bacillus является обилие разветвленной цепью , содержащих 12-17 ТВС атомами углерода 10-12 с соотношением между ISO и anteiso изомеров , являющихся ключевым фактором , определяющим адаптации к условиям окружающей среды. Виды Bacillus также приспосабливаться к окружающей среде колебаний, изменяя долю ненасыщенных жирных кислот. У некоторых видов, таких как Bacillus сегеиз, два десатуразы жирных кислот создают двойные связи в различных положениях алкильной цепи 13 с различными ролями в адаптации 9. Пример рода Bacillus иллюстрирует важность точного определения двойной позиции облигаций и FA ветвления. собиратьраторов, идентификация паттернов Bacillus ФА имеет несколько полезных приложений. При этом, мы предлагаем новый GC-MS подход к идентификации образов Bacillus FA , которая преодолевает ограничения , присущие классического анализа ГХ-МС.

Этот новаторский подход может быть использован непосредственно на сырье биологического материала, и состоит из комбинации существующих технологий: информация о времени удерживания (ЭСЛ) и масс-спектры различных производных FAS (FAME, DMOX и пиколинил-эфира).

Мы используем следующую FA номенклатуру. Я, а, и п указывают ISO, anteiso альдегиды, и с прямой цепью и жирных кислот, соответственно. Ненасыщенные ФА были названы C: D, где С представляет собой число атомов углерода в жирной кислоте и D является число двойных связей. Δ X обозначает положение двойной связи, где двойная связь расположена на х - й углерод-углеродной связи, считая от кислотного конца карбоксильной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Бактериальные культуры

  1. Подготовьте газон бактерий (Bacillus эхиноцереус штамм ATCC 14579), распределяя по 100 мкл ночной культуры штамма инкубируют при 30 ° С в LB (среде Лурия-Бертани), над поверхностью пластины агаровой среды LB. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 30 ° C.

2. СТЭК: Эквивалент Длина цепи

  1. Рассчитать электрохемилюминесценции следующим образом: figure-protocol-1 с:
    Я, интересующее вещество;
    N, число атомов углерода метилового эфира с прямой цепью, насыщенных жирных кислот, элюировавшей до растворенного вещества I;
    п + 1, число атомов углерода метильной цепи насыщенных жирных кислот эфира прямой элюирование после растворенного вещества I;
    RTI, Rtn, Rt (п + 1) время удерживания пиков FAME, описанных выше.
    Примечание: Получение Время удерживания цепь насыщенных жирных кислот, сложных метиловых эфиров путем прямой инъекции смеси стандартов (BAME).

3. FAME Подготовка и анализ

  1. Для того чтобы получить липидов жирных кислот, урожай бактериальных клеток путем соскоба колонии из чашки с агаром и передачи 40 мг (сырого веса, что эквивалентно 10 9 жизнеспособных клеток) бактерий в стеклянную пробирку на 10 мл с винтовыми пробками и тефлоновыми уплотнениями.
  2. Выполните переэтерификации с помощью метода связи эфира 14,15 подробно ниже.
    1. Добавляют 5 мл 0,2 М КОН в метаноле до свежих бактериальных клеток и инкубировали при 37 ° С в течение 1 часа. Эта реакция состоит из щелочной метанолизе, разрыв связи сложного эфира в липидной и получения метиловых эфиров жирных кислот.
    2. Добавить 1 мл 1 М уксусной кислоты для снижения рН до 7,0. Проверьте рН с рН тест полосок.
    3. Добавьте 3 мл гексана, чтобы извлечь FAMEs.
    4. Перенести супернатант (органической фазе) в чистые пробирки и концентрировали выпариванием при комнатной температуре при непрерывном токе азота, чтобы получить примерно 200 мклэкстракта. Передача образца в GC ампулу с вставкой.
    5. Вводят экстракты в газовой хроматографии-масс-спектрометрии системы (ГХ-МС).

4. ГХ / МС условия

  1. Вводят образцы FAME в ГХ-МС прибор, снабженный капиллярной колонкой ZB-Wax (длина, 30 м, диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм).
  2. Установите порт впрыска (в режиме без деления потока) температуры до 250 ° С. Использование гелия в качестве газа-носителя, с линейной скоростью 37 см / сек. Держа температуру печи при 50 ° С в течение 1 мин, увеличить до 190 ° С со скоростью 20 ° С / мин, а дальнейшее увеличение до конечной температуры 230 ° С со скоростью 2 ° С / мин.
  3. Для МС, записи масс-спектров с помощью электронной ионизации (EI) при 70 эВ, а также установить приобретение полного ионного тока от 50 до 400 атомных единиц массы (а.е.м.) (2 сканирований / сек).
  4. При необходимости вводят DMOX и пиколинил производные при тех же условиях excepт программу температуры печи следующим образом:
    DMOX: 50 ° С (1 мин), 20 ° С / мин до 210 ° С и 2 ° С / мин до 240 ° С (5 мин);
    Пиколинила: 6 ° С (1 мин), 20 ° С / мин до температуры 220 ° С и 2 ° С / мин до 250 ° С (20 мин).

5. пиколинил Эфир Подготовка от FAME 16

  1. Упаривают FAME выписку из раздела 3 с потоком азота (по крайней мере 10 мг сухого материала) и растворяют в 1 мл сухого дихлорметана.
  2. Готовят 1,0 М раствор тер трет-бутоксида калия в тетрагидрофуране.
  3. Добавьте экстракт известностью и 0,2 мл 3-пиридинметанола до 0,1 мл раствора, приготовленного на стадии 5.2.
  4. Раствор нагревают при 40 ° С в течение 30 мин в закрытом сосуде.
  5. После охлаждения до комнатной температуры, добавляют очищенную деионизированную воду (2 мл, см Материалы таблицу) и гексане (4 мл). Смешать с вихрем, позволяют фазы для разделения, и собирают органическую фазу.
  6. доктору его путем добавления безводного сульфата натрия до тех пор, органическую фазу совершенно ясно. Перенести его в чистую пробирку. Затем выпарить до 200 мкл. Передача образца в GC ампулу с вставкой.

6. DMOX Подготовка от FAME 17

  1. Упаривают FAME выписку из раздела 3 с потоком азота (по крайней мере 10 мг сухого материала).
  2. Для сухого экстракта FAME, добавляют 250 мг 2-амино-2-метил-1-пропанола. Промыть сосуд с азотом, добавьте пробку, и поместите его в нагревательном блоке в течение ночи при 190 ° С.
  3. После охлаждения до комнатной температуры, добавляют 3 мл дихлорметана в пробирку, и 5 мл очищенной деионизированной воде (см Материалы таблицу).
  4. Встряска для разделения фаз, а затем удалить водную фазу.
  5. Промывают органическую фазу с помощью 5 мл воды. Встряска для разделения фаз, а затем удалить водную фазу.
  6. Сухое путем добавления безводного сульфата натрия до тех пор, органическую фазу совершенно ясно иперенести его в чистую пробирку. не испарятся в токе азота до достижения объема 200 мкл. Передача образца в GC ампулу с вставкой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стратегия идентификации ФА из бактериальных клеток представлена на рисунке 1. Каждый шаг обеспечивает дополнительную спектральную информацию или информацию о хроматографического удерживания. Этап 1 состоит из предварительной идентификации FA с использованием стандартного раствора. Шаг 2 позволяет для интерпретации спектров FAME EI и их ЭСЛ, для того, чтобы предварительно определить продукты. Шаг 3 идентифицирует точное местоположение в разветвление разветвленного-FAS. На...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Профили хроматограммы FAS , показанные в Таблице 1 , соответствуют B. Cereus ATCC 14579 , выращенного на агаровой поверхности пластины. Подобные профили были получены , когда бактерии выращивали в аэрированных жидких средах при той же температуре 8. В случае бактерий , выращенных в жидкой среде, биомассы бактерий собирали центрифугированием среды роста и могут быть промыты в соответствии с описанными ранее протоколов в зависимости от условий роста 8,19. Идентификация разли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарны Томас Mison за его техническую поддержку, а также Рейчел Kopec для пересмотра рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
GC/MSShimadzuQP2010
капиллярная колонка ZB WAXPhenomenex7HG-G007-1130 м x 0,25 мм x 0,25  &микро; m
Метанол LichrosolvVWR1.06018.2500
Гидроксид калияAldrichP1767
THFHipersolv Chromanorm28559.320
ДихлорметанHipersolv Chromanorm23373.320
ГексанHipersolv Chromanorm24575.320
3-пиридинеметанолAldrichP6-680-7
Тертиобутоксид калияОлдрич156671
2-амино-2-метил-1-пропанолA-9879
MilliQ AcademicMilliporeZMQS50001
Бактериальная кислота метиловый эфир (BAME) СмесьSigma-Aldrich47080-U Supelco

Ссылки

  1. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
  2. HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
  3. Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
  4. Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
  5. Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
  6. Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
  7. Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
  8. de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
  9. Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
  10. Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
  11. Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
  12. Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
  13. Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
  14. Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
  15. Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
  16. Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
  17. Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
  18. Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
  19. de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
  20. Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
  21. van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
  22. Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Идентификация жирных кислотгазовый хромато-масс-спектрометрический анализметиловые эфиры жирных кислотэквивалентная длина цепи44-диметилоксазолиновые производные3-пиридилкарбиниловые эфирыжирные кислоты с разветвленной цепьюненасыщенные жирные кислотыположение метильного разветвленияположение двойной связи
Определение жирных кислот в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.