Методическая статья

Культура мышиных эмбриональных плюсны: физиологическую модель Эндохондральный окостенение

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54978

⸱

3 декабря 2016 г.

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, The Roslin Institute and R(D)SVS, The University of Edinburgh

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол для препарирования и культивирования эмбриональных плюсневых костей мыши на 15-й день (E15). Эта высокофизиологичная модель эндохондрального окостенения ex vivo обеспечивает условия, приближенные к ситуации in vivo, чем клетки в монослое или 3D-культуре, и является жизненно важным инструментом для исследования роста и развития костей.

Аннотация

Фундаментальный процесс эндохондрального окостенения находится под жестким контролем у здорового человека, чтобы предотвратить нарушение развития и/или продольный рост костей. Таким образом, крайне важно, чтобы мы углубили наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе таких расстройств, чтобы обеспечить прогресс в пользу пациентов и людей. Культура экспланта плюсневых органов мыши является высокофизиологичной моделью ex vivo для изучения эндохондрального окостенения и роста костей, поскольку скорость роста костей в культуре имитирует наблюдаемую in vivo. Уникальность заключается в том, что культура плюсневых органов позволяет исследовать хондроциты в различных фазах хондрогенеза и поддерживает межклеточные взаимодействия и клеточно-матриксные взаимодействия, тем самым обеспечивая условия, более близкие к ситуации in vivo, чем клетки в монослое или 3D-культуре. В этом протоколе подробно описывается сложное вскрытие эмбриональных плюсневых костей из задней конечности мышиных эмбрионов E15 и последующие анализы, которые могут быть выполнены для изучения эндохондрального окостенения и продольного роста костей.

Введение

Скелет является весьма запутанным, динамичный и сложный орган, который имеет целый ряд функций, охватывающих от локомоции, ионного гомеостаза. Состоящий из кости и хряща, скелет состоит из популяций функционально различных клеток , которые работают для поддержания его структурных, биохимических и механической целостности 1. Одной из главных функций скелета является его роль в развитии и росте. Эти процессы требуют гармоническое сочетание нескольких клеточных популяций, которые регулируются за счет тесной эндокринных и генетического контроля.

За исключением плоских костях , например , лопаткой, черепа и грудины, скелет млекопитающего формируется посредством процесса , известного как эндохондральной окостенения. Этот процесс, как регулируется и пространственно молекулярно, начинается с конденсации мезенхимальных клеток , полученных в основном из мезодермы 2. Под влиянием фактора SOX9 транскрипции, клетки в те интерьер сгущений дифференцируются в хондроциты, выражающие и секретирующих хрящевых специфические внеклеточного матрикса (ЕСМ) компоненты, такие как тип II коллагена и аггрекан. Клетки на краю конденсации, выразить тип I коллагена и образуют надхрящница, разграничивая проспективное кости 3. Позже osteoprogenitors из надхрящница дифференцируются в остеобласты, направленный экспрессии факторов транскрипции, Runx2 и Osterix 4. Это приводит к преобладанию остеобластов и этот слой переименован в надкостницу, который образует минерализованную костистую воротник вокруг средней части кости. Сосудистый проникновение надкостницы и вторжения в хрящевой эшафот происходит в результате чего с ним, haematopoetically полученные резорбции костей клетки, остеокласты, которые резорбции хондроцит остатки и большую часть хрящевой матрицы 5. Пространства, образованные заполнены osteoprogenitors, приводящих к первичной оссификациицентр, который постепенно занимает ядро ​​диафиза и сливается с надкостницей. Другие клетки дают начало костного мозга. Вокруг рождения, кровеносные сосуды и osteoprogenitors проникают в хрящевую богатую матрицу с обеих сторон (эпифиза) развивающегося диафизе с образованием вторичного окостенения центра. Расположенный между эпифизом и диафиза на обоих концах длинных костей является полоса хряща - пластинка роста эпифиза - который отвечает за координацию линейный рост всех длинных костей 6.

Chondrocytes внутри пластины роста первоначально пролиферируют и в дальнейшем прогрессировать через морфологически различных зон, согласованных путем последовательного экспрессии транскрипции и факторов роста. Кульминацией этой последовательности событий является выход из клеточного цикла и гипертрофии хондроцитов в центре этого предшественника хрящей. Гипертрофические хондроциты сильно выражают коллагена Х типа и матрицы металлопротеиназы-13 (ММР13) и их значительное увеличение объема в направлении продольного роста обеспечивает наибольший вклад в рост костей у млекопитающих 7,8. Кроме того, гипертрофические хондроциты минерализуют окружающую их ECM через выпуск матричных везикул, мембранные ограниченные структуры специализированные для производства аморфного фосфата кальция путем их включения фосфатаз (ткань неспецифический щелочной фосфатазы (TNAP) и PHOSPHO1) и кальция направления белков (аннексины ) 9-11. Этот кальцинированная хрящ захвачена кровеносных сосудов из основного мозга, что приводит к наборе остеокластов и резорбции матрицы. За этим следует миграции остеобластов и выравнивания на поверхности кальцинированных хрящей остатков, где они сложили слой остеоидом который быстро минерализованной. Тканый кости первичной губчатой позже перестроенный в пластинчатой кости вторичной губчатой 12. Эпифизарной результаты синтеза впрекращение эндохондральной окостенения 13.

Эндохондральный окостенение находится под жестким регулированием со стороны многих эндокринных и паракриновых гормонов и факторов роста , с тем чтобы предотвратить нарушенное развитие и / или рост 14 продольной кости. Более глубокое понимание молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе этих процессов Поэтому крайне важно в нашем стремлении клинические достижения по отношению к человеческой выгоде. Предыдущее исследование сходства и различия между ростом пластин разных возрастов, мест и видов значительно улучшили наше понимание физиологических механизмов , окружающих динамику 15,16 пластины роста. Тем не менее, изучение изолированных хондроцитов трудно, так как удаление хондроцитов из их среды может привести к дифференцировке, сопровождается потерей экспрессии ключевых маркеров , таких как Col2a1 17.

Мышь плюсневой орган эксплант, пиoneered профессором Элизабет Бергер и его коллеги в Нидерландах, является весьма физиологическая ех естественных условиях модель для изучения Эндохондральный окостенение и рост кости , как темпы роста костей в культуре имитируют , что видели в естественных условиях 18. Уникально, плюсневой органной культуры позволяет исследовать хондроцитов в различных фазах хондрогенезе и поддерживает клетка-клетка и клетка-матрица взаимодействий, тем самым обеспечивая условия ближе к ситуации в естественных условиях , чем клетки в культуре 19-21. Кроме того, эта модель позволяет для прямого изучения линейного роста костей, которое не возможно в первичных культурах хондроцитов. Она также позволяет для разделения системных и локальных факторов, допускающее поэтому конкретный анализ локальных эффектов на пластине роста.

Культура плюсны позволяет исследовать многочисленных параметров. Ежедневные измерения общей длины и минерализованных областейзачатки могут быть выполнены с помощью стандартного фазово-контрастной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений. Гистологическое, гибридизация и иммуногистохимического окрашивания в легко могут быть выполнены на участках плюсневых, что позволяет для пространственного разрешения обоих клеточных и молекулярных образований, главным преимуществом по сравнению с традиционными методами культивирования клеток. Иммуногистохимический подход включает в себя обнаружение и количественное определение 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) поглощение пролиферирующих хондроцитов 22. Кроме того, дальнейшая обработка плюсневых тканей могут быть выполнены, чтобы позволить вниз по течению анализа экспрессии мРНК (RT-КПЦР), белков и внутриклеточной передачи сигналов (анализ Вестерн-блоттинга) или липидный состав (масс-спектрометрия). Большинство исследований на сегодняшний день использовать культивируемые эмбриональные плюсны, а не плюсны от послеродовых животных. Хотя обе модели могут быть информативными, исследование эмбриональных костей имеет ряд преимуществ: они растут быстрее и может быть EXPLOITED для изучения инициации и прогрессирования процесса минерализация 23-25.

Этот протокол подробно описывает сложную рассечение эмбриональных плюсны от задней конечности эмбриональный день 15 (E15) мышиных эмбрионов. Кроме того, рост и минерализацию анатомически различных плюсневые показан.

Протокол

Процедуры с участием субъектов животных были проведены в соответствии с британских животных (научные процедуры) Закон 1986 года и животные содержались в соответствии с домашнего офиса опубликовала Свод практических правил для жилищного строительства и ухода за животными Bred, входящего в комплект поставки или использоваться для научных целей.

Примечание: Опыты, проведенные с использованием дикого типа C57BL / 6J мышей хорошо известны и описаны ниже. Эмбриональные Плюсневые из разных штаммов мышей , может также быть выращены в пробирке, хотя темпы их роста и минерализации могут отличаться подробно в настоящем документе.

1. Препарирование Условия и подготовка инструментов

  1. Выполните все средства массовой информации, подготовка тканей вскрытий и культура работы в ламинарном потоке, чтобы обеспечить стерильность сред и эмбриональных зачатков.
  2. Разрешить культуры и рассечение СМИ уравновешиваться в течение не менее 1 ч при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе до использования.
  3. Стерилизовать рассечениеножницы, Дюмон # 5 и # Dumont 4 пинцет наряду с парой сверхтонкого Vannas микро ножницы (8 см прямые, 3 мм лопасти) автоклавированием. После автоклавирования, погружать рассечение оборудование в 70% этаноле перед использованием.

2. Подготовка Вскрытие и медиакультуры

  1. Подготовка рассечение среды
    1. Развести α-минимума , требующегося Media (без нуклеозидов, αMEM) в фосфатном буферном растворе (PBS) (1:13) и ресуспендируют бычьего сывороточного альбумина (BSA) в концентрации 2 мг / м л до того стерилизацией фильтрованием через шприц диаметром 0,22 мкм, 33 мм фильтр.
      Примечание: Препарирование среда может быть сделано, стерилизовали фильтрованием и хранили в аликвотах при -20 ° C до бесконечности.
  2. Подготовка культуральной среды
    1. Культура эмбриональных Плюсневые в 300 мкл культуральной среды (в каждую лунку культурального планшета 24-а). Подготовка культуральной среды путем добавления 0,2% вес / объем BSA; 5 мкг / мл L-ASCOфосфат RBIC кислота; 1 мМ β-глицерофосфата (βGP; опционально - см результаты раздел); 0,05 мг / мл гентамицина и 1,25 мкг амфотерицина к αMEM и фильтр стерилизуют через фильтр шприца диаметром 0,22 мкм, 33 мм.

3. Мышиные Эмбриональные Плюсневой Вскрытие и культура

  1. Cull беременную мышь, укрывательство 15-дневных эмбрионов, шейным дислокации в соответствии с руководящими принципами домашнего офиса в Великобритании
  2. Поместите животное лежа на спине и дезинфицировать кожу путем распыления 70% этанола. Использование рассечение ножницами сделать большой разрез в средней линии, проникая как кожа и брюшины подвергать брюшной полости.
  3. Найдите два рога матки животного в дорсальную область полости тела. Удалите рога матки путем, во-первых освобождая каждую из матки mesometrium путем тщательного надрезов с рассечение ножницами, а затем, наконец, резки рогов матки бесплатно на их основе. Placе рога матки в рассечение среды.
  4. Отделить каждого эмбриона путем разрезания между имплантационных участков вдоль рога матки и удалить эмбрионов из их индивидуальных мешочков с помощью щипцов. Отбраковки эмбрионов путем обезглавливания в соответствии с руководящими принципами домашнего офиса в Великобритании
  5. После дезинфекции кожи путем распыления с 70% -ным этанолом, используют Vannas микро ножницы, чтобы удалить задние конечности из эмбрионов с помощью надреза вокруг проксимальной части бедренной кости. Это обеспечивает также большую часть задней конечности, как это возможно удаляется. Поместите задние конечности в чашку Петри, погруженной в секционном среде перед плюсневой диссекции.
  6. Под микроскопом рассекает, начать удалять кожу вокруг эмбриональных ногу, зажимая и потянув его с помощью # 5 пинцетом, удерживая заднюю конечность с помощью устойчивого # 4 пинцета. Это наиболее эффективно осуществляется захватывая кожу примерно на уровне голени и потянув в сторону фаланг. Использование ножниц на данном этапе, чтобы сократитьочень тонкая кожа не требуется.
  7. Осторожно держать tarsals эмбрионального стопы с № 4 пинцетом и удалить первый и пятый плюсны, зажимая от около tarsals с помощью # 5 пинцетом и выбросить.
  8. С ногой, состоявшейся в том же самом положении, используйте # 5 пинцетом, чтобы разрушить соединительные ткани между тремя оставшимися фаланг и плюсневых костей. Вставьте кончик # 5 пинцетом на стыке между фаланг и плюсневых костей, чтобы удалить фаланги из плюсневых костей.
  9. Наконец, используйте # 5 пинцетом, чтобы разрушить соединительные ткани между tarsals и плюсны. Снова поместить кончик # 5 пинцетом в совместном пространстве между tarsals и плюсны и аккуратно освободить плюсны от tarsals.
  10. Аккуратно подобрать теперь бесплатно плюсны с № 4 пинцетом и поместить в свежей рассечение среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное рассечение должна обеспечивать 6 плюсны из каждого эмбриона.
  11. Когда все необходимые Плюсневые были расчленены, сторожныLLY место Плюсневые индивидуально в предварительно нагретый 24-луночные планшеты, содержащие 300 мкл культуральной среды. Плюсневые культуры при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе в течение до 14 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте СМИ E15 культур по крайней мере до 5 дней культуры , как это сказывается на их минерализация способность 26. Причины этого неясны, но линейный рост и матрица минерализация может зависеть от стимуляции факторов роста, освобожденных из плюсневых костей.

4. Анализ и манипулирование плюсневой культур

  1. В день вскрытия (день 0) делают начальные продольные измерения с помощью микроскопа с цифровой камерой прилагается и анализа изображений программное обеспечение. Измерьте длину центральной зоны минерализация, когда он появляется через несколько дней культивирования.
  2. Периодически, по мере необходимости, дальнейшие измерения (обычно каждый 2 - й день) до последнего дня культуры , при которой точки тetatarsal кости обрабатываются зависит от требуемых результатов (обсуждается во введении).
  3. Дополнение среда культур плюсневой органов с различными экзогенными факторами , например , факторы роста, гормоны и фармакологические препараты от 0 -й день культуры 22,24. Во всех исследованиях такого рода, требуются управляющие необработанные Плюсневые.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что желательно, чтобы кости управления являются эквивалентом рудимент от контралатеральной ноги, там не было никаких различий в линейном росте или минерализация потенциала культивируемых E15 2 - й, 3 - й и 4 - й Плюсневые (смотри ниже, рисунок 2) ,

Результаты

Цель этого метода в том, чтобы изолировать эмбриональные плюсны и культуру их для изучения продольного роста костей и ЕСМ минерализации. Используя наш протокол, описанный здесь, эмбриональные плюсневых костей были успешно рассеченные, а визуализированы с помощью световой микроскопии. Измерения плюсневых костей, проведенных , как показано на рисунке 1, показали их способность расти в продольной длине и минерализирует их ECM (рисунки 2 и 3). Минерализация матрицы впервые было отмечено в середине диафиза кости зачатка и легко наблюдается с помощью световой микроскопии. Ни один окрашивание не требуется, хотя поглощение кальцеина может предложить улучшенную визуализацию вновь образованного минерала.

Исследования , использующие эмбриональные плюсны на сегодняшний день 22,27,28 объединили расчлененный 2 - й, 3 - й и 4 - й (ЕКСтральных три) Плюсневые, предполагая , что в лабораторных условиях роста и минерализации сопоставима. В естественных условиях развития мышиных плюсны, однако, показывает , что 3 - й и 4 - й цифры имеют признаки минерализации перед всеми остальными плюсны и фаланг 29. Оценка роста и минерализации потенциал индивидуально изолированных и культурной E15 2 - й, 3 - й и 4 - й Плюсневые не было выявлено никаких существенных различий во внешнем виде или степени минерализации после 7 дней культивирования (рисунок 2). Никакой разницы в увеличении процента от исходного уровня обнаружено не было в течение периода культивирования. Как было отмечено никаких различий в минерализацией потенциале стандартный протокол объединения 2 - й 3 - й и 4 - й плюсны представляется действительным для будущих исследований.

Традиционно, исследователи добавили βGP к средствам массовой информациииспользуемая для культивирования эмбриональных плюсны для содействия ЕСМ минерализацию. Тем не менее, в исследованиях на культуре клеток, было показано , что если TNAP фермент добавляют в остеогенных средах , содержащих βGP, эктопической гидроксиапатит отложений минерала до сих пор имеет место даже в отсутствие клеток 30. Для изучения влияния различных субстратов минерализацией и агонистов на способность плюсневой минерализацией, мы культивировали E15 плюсны в культуральной среде, содержащей ряд добавок, а также изображения и измерения длины были записаны ежедневно. Результаты показали, что E15 плюсневых костей все еще растут и их минерализуют ECM в отсутствие βGP. E15 плюсневой кости , культивируемые в аскорбиновой кислоты только средства массовой информации показали сравнимые увеличение длины и минерализации костей плюсны культивировали в присутствии βGP (рисунок 3).

Мы также показали, что лентивирусов могут быть использованы для трансфекции экзогенной ДНК в культивированных metatarsals. Здесь мы успешно трансфицированы плюсневых костей на 0 -й день культуры (т.е. день рассечения) с 2 х 10 6 зеленый флуоресцентный белок (GFP) вирусных частиц на плюсневой. Чтобы включить вирус трансдукции, полибрен одновременно добавляли к культурам в масштабе 1: 500. Культуры были оставлены в течение 7 дней, без каких-либо изменений, медиа, как требуется для E15 плюсневой минерализации произойти, прежде чем инкубировали с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) пятно в течение 5 мин, а затем непосредственно визуализированы с помощью конфокальной микроскопии ( Рисунок 4). Наше доказательство концепции экспериментов ясно показывают эффективную трансдукцию. Тем не менее было бы целесообразно изучить разделы по всей полноте плюсневой кости, чтобы оценить их трансфекции и эффективной манипуляции генов.

figure-results-1
Рисунок 1: Стандартная методика используется для измерения тон Длина и минерализация зоны эмбриональных плюсны. (A) Общее количество измерений по длине E15 плюсны в день 0 культуры (день рассечение) , взятый через центр плюсневой. (B) Измерение общей продольной длины плюсневой после семи дней в культуре. Обратите внимание на небольшую кривизну в плюсневой. (C) Измерение длины минерализация зоны после семи дней в культуре. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Рост и минерализация Мощность анатомически Distinct E15 плюсны изображений и измерение 2 - го, 3 - го и 4 - го Плюсневые от задней конечности мышей E15 W.в исполнении. (A) Последовательные изображения 2 - го, 3 - го и 4 - го плюсны в течение всего периода культивирования. (Б) Процентное увеличение в длине от 0 -й день в каждый день культивирования. (С) Минеральное Длина 2 - го, 3 - го и 4 - го плюсны в течение периода культивирования , выраженное в процентах от общей длины плюсневой. Данные в представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM), (N = 6). (D) , C57BL / 6J длины плюсны в каждый день культивирования. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (n = 6). Черный бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Рост и минерализацию Емкость дикого типаЕ15 Плюсны культивированных в различных средах Остеогенной. (А) Последовательные образы плюсневые культивируемых только аскорбиновой кислоты, 1 мМ βGP, 3 мМ фосфохолин, 1,5 мМ хлорида кальция или 3 мМ хлорида кальция , содержащего носитель. (B) Процентное увеличение длины от 0 день плюсны культивировали с различными добавками. (С) Минеральное длина плюсны , культивированных в различных средах , выраженное в процентах от общей длины плюсневой. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM), (N = 6). Черный бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Трансфекция E15 плюсны с GFP вируса Pстатьи. плюсневой кости (А) E15 трансфицировали вирусных частиц GFP для подтверждения концепции. (В) Кости окрашивали DAPI для визуализации ДНК. (C) Двойные изображения показали успешную трансфекцию вируса GFP по всей совокупности из плюсневых костей. Белые полосы = 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Культура мышиных эмбриональных плюсневые обеспечивает высокую физиологическую модель эндохондральной роста и минерализации. Ранние исследования подтверждено, что E15 Плюсневые мыши пройти нормальную структуру скелета роста и дифференцировки. Хрящ (хондроциты) и кости (остеобластов и остеокластов) клетки и их соответствующие коллагеновые матрицы не отличаются от наблюдаемых в естественных условиях. Тем не менее, существуют некоторые известные ограничения этой модели. Скорость остеокластов дифференциации нарушается как рост кости (но не хрящей дифференциации). Рост костей примерно на 50% медленнее , чем это наблюдалось в естественных условиях , и может быть из - за недостатков в системных факторов , которые влияют на выработку местных факторов (например, ИФР-1, КМБ и т.д.) 31. Кроме того, оно хорошо известно, что кость чувствительна к его механической среды, и это также относится к культивируемых плюсны, которые реагируют на Changes в механической нагрузке 32,33. Таким образом, в ненагруженных условиях, как описано в данном протоколе, минерализации и минеральных резорбции может быть поставлена ​​под угрозу. Тем не менее, модель плюсневой дает возможность непосредственно измерить линейный рост костей , что невозможно с помощью 2D и 3D в лабораторных системах культивирования.

Мы обеспечили полное описание протокола , участвующего в рассечение и культуре E15 мышиных плюсны и действительно, в первый раз, подтверждают обоснованность объединения 2 - й, 3 - й и 4 - й плюсневых костей для экспериментов.

Плюсны от E17 / E18, как правило , используются для изучения механизмов роста костей в связи с их огромным потенциалом роста ех естественных условиях в течение длительного периода времени (т.е. за 14 дней в культуре). Они хорошо создана модель для исследования роли факторов роста на эмбриональном продольной кости роста.Кроме того, рассечение и культура послеродовых плюсны обычно используется , чтобы очертить механизмы , окружающие послеродовую роста костей , как следует понимать , что послеродовые рост костей плода и рост костей регулируются по- разному 21. Рост костей наблюдается в культивированных послеродовых плюсны, однако значительно меньше , чем это наблюдалось в эмбриональных зачатков 25,34, что ограничивает их потенциал в длительных исследований и выделяя более системное воздействие на рост костей на этой стадии постнатального. В самом деле, 3 - дневных постнатальных плюсневые кости от мышей , как правило , последний этап , который может быть использован для получения измеримой 34 роста.

Здесь мы описываем наш протокол для выделения эмбриональных плюсневых костей на E15. Отсутствие hydroxyapaptite минерала в плюсневых костей E15 означает, что они обеспечивают непревзойденную модель для исследования не только механизмы, окружающие продольный рост костей, но и инициацииминерализации скелета. Минерализованные матрица терминала гипертрофической зоны хондроцитов обеспечивает эшафот для вторжения в остеобласты сложить кости специфические матрицы (остеоида) , который затем минерализуется, и в этом качестве этой начальной минерализации имеет жизненно важное значение для формирования успешной и функциональной кости 35. Действительно, ряд недавних отчетов с использованием E15 плюсны подтвердили свою уникальную способность к исследованию процесса минерализации 28,36,37. Кроме того, исследователи описали использование E15 плюсны в качестве модели ангиогенеза 38, подчеркивает потенциал эмбриональных плюсны как модель за пределами установки костного роста / минерализацией.

Протокол мы описываем требует только стандартного лабораторного оборудования , включая ламинаре, рассекает микроскоп для выполнения рассечение, и инкубатор СО 2 для культуры отсеченных зачатков. Кроме того, очень простой кульратура среды , содержащей αMEM, бычий сывороточный альбумин, антибиотики, антимикотики и L-аскорбиновую кислоту (кофактором в синтезе гидроксипролина и гидроксилизила, две незаменимые аминокислоты для производства коллагена 39) позволяет избежать использования неопределенных добавок, таких как сывороток животных , Традиционно, исследователи добавили βGP к средствам массовой информации, используемых для культивирования эмбриональных плюсны, но, как показали наши результаты, использование дополнительного источника фосфата не требуется для успешной минерализации в этой системе культуры. Это важное открытие в нашем стремлении к пониманию механизмов, лежащих в основе ЕСМ минерализацию.

Плюсны ранее были инфицированы аденовирусов , содержащих доминантно-негативной формы Smad2 , чтобы исследовать роль трансформирующий фактор роста & beta ; в регуляции развития длинных костей 40. Здесь мы также показывают успешное трансфекции дикого типа костей Е15 плюсневых с вирусом GFP частиц, что указывает на тметоды шляпы лентивирусов может быть легко принят, чтобы манипулировать экспрессии генов в плюсневых культурах. Аналогичным образом, система плюсневой культуры орган является отличной моделью, в которой для сравнения рост костей у генетически измененных мышей, чтобы лучше понять роль конкретного гена в процессе роста кости. Наши предыдущие исследования использовали систему органной культуры плюсневой, чтобы определить роль супрессора цитокин сигнализации-2 (SOCS2) в эндохондральной роста костей. Использование плюсневой кости от мышей , дефицитных по SOCS2, мы показали , что гормон роста способен имитировать их продольное независимо роста инсулиноподобного фактора роста (IGF-1), в отличие от плюсневых костей дикого типа , которые не поддаются лечению гормона роста 34, 41. Это подчеркивает, в какой степени плюсневых культуры можно манипулировать для изучения влияния различных генов и / или экзогенных факторов на эндохондральной роста костей.

Таким образом, мы имеем Detaiпривел к способу успешного извлечения и культуры эмбриональных плюсневых костей, которые можно манипулировать и исследовали с использованием различных анализов. Эта бывшая модель поддерживает естественных условиях клетка-клетка и клетка-матрица взаимодействий, а также содержит хондроцитов в различных фазах хондрогенезе, тем самым обеспечивая более физиологическому модель , чем клетки в монослое или 3D культуры. Поэтому плюсневой культуры органов представляют собой уникальную модель для исследования молекулярных механизмов, ответственных за эндохондральной окостенения, и имеют важное значение для более глубокого понимания как костной физиологии и патофизиологии

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны Исследовательскому совету по биотехнологии и биологическим наукам (BBSRC) за финансирование DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Program Grant Funding BB/J004316/1). Мы также выражаем признательность Arthritis Research UK за финансирование KAS (20413). Мы благодарим мисс Элейн Сирайт за ее помощь в проведении описанных экспериментов, доктора Нила Маккензи за его помощь в проведении лентивирусных методов, а также мистера Даррена Смита и мистера Алекса Робертсона (Roslin Institute BRF) за их помощь в исследованиях на животных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ножницы для препарированияWorld Precision Instruments14393Автоклав стерилизовать перед использованием
Пинцет Dumont #5 ПинцетWorld Precision Instruments500342Автоклав стерилизовать перед использованием
Пинцет Dumont #4World Precision Instruments500339Автоклав стерилизовать перед использованием
Ножницы SuperFine VannasPrecision Instruments
Абсолютный этанолFisher ScientificE/0650DF/17Разбавленный до 70% об/в в dH2
Oα-MEM без нуклеозидовThermo Fischer Scientific 
Сывороточный альбумин крупного рогатого скотаSigma AldrichA3059
Шприцевые фильтры (0,22 μ m)Миллипор MerckSLGP033RS
Фосфохолин хлорид кальциевая соль тетрагидратSigma AldrichP0378Добавить непосредственно в среду перед экспериментом
L-аскорбиновая кислота-2-фосфатSigma AldrichA8960Восполнить бульон в дозе 5 мг/мл и аликвоту при -20 °°; C
Дигидрат хлорида кальцияSigma AldrichC5080Восполнение запаса при 150 мМ и аликвота при -20 °°; C
β-глицерофосфат динатриевой соли гидратSigma AldrichG9422Восполняйте запасы при 1 мМ и аликвоте при -20 °°; C
ГентамицинТермо Фишер Научный 
Амфотерицин BThermo Fischer Scientific 
24-луночные планшеты, обработанные клеточными культурами Nunc,Thermo Fischer Scientific 
ПолибренSigma AldrichH9268
DAPIThermo Fischer Scientific Д3571
World 50177822561021 диаметром 33 мм 1571004915290018142475

Ссылки

  1. Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
  2. Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
  3. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
  4. Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
  5. de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
  6. Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , Elsevier Academic Press. (2005).
  7. Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
  8. Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
  9. Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812(2011).
  10. Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
  11. Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
  12. Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. , 22-32 (1978).
  13. Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
  14. Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
  15. Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
  16. Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
  17. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
  18. Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
  19. Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
  20. Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
  21. Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
  22. Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
  23. Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
  24. MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
  25. Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
  26. Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
  27. Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
  28. Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
  29. Kaufman, M. The atlas of mouse development. , 3, Academic Press. (1992).
  30. Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
  31. Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
  32. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
  33. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
  34. Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
  35. Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
  36. Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
  37. Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
  38. Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
  39. Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
  40. Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
  41. Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Культура плюсневых костейэмбрионы мышейрост костейпротокол диссекциикультура клетоканализ минерализациивестерн-блоттингиммуногистохимияRTQPCR
Культура мышиных эмбриональных плюсны: физиологическую модель Эндохондральный окостенение
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.