ADSC листов Трансплантация для предотвращения стриктуры после продолжительного пищеводного эндоскопическую подслизистую Вскрытие

Краткое содержание

Это исследование сообщает об успешном метод эндоскопического жировой ткани стромальные клетки (ADSC) -sheet трансплантации для профилактики пищеводного стриктуры после продолжительного эндоскопическую подслизистую диссекции (ОУР) в качестве модели свиней.

Аннотация

В прошлые годы, конструкция сотового листа стимулировало широкий интерес к регенеративной медицине, особенно для реконструктивных процедур по хирургии. Развитие разнообразных технологий, сочетающих полученных из жировой ткани стромальных клеток (ADSCs) с различными биоматериалов привело к строительству многочисленных видов тканевой инженерии заменителей, таких как кости, хряща и жировой ткани от грызуна, свиньи или человека ADSCs. Расширенная пищеводного эндоскопической подслизистой диссекции (ОУР) отвечает за формирование стриктура пищевода. профилактика Стриктура остается сложной, без каких-либо эффективных процедур. Предыдущие исследования сообщили об эффективности трансплантации клеток слизистой оболочки листов в собачьей модели и в организме человека. ADSCs приписываются противовоспалительные свойства, местные иммунные эффекты Модулируемая индукции неоваскуляризации и дифференциации способностей в мезенхимальных и не-мезенхимальных родословных. Это оригинальное исследование описывает эндоскопическую траnsplantation из тканевой инженерии конструкции ADSC, чтобы предотвратить стриктура пищевода в свином модели. ADSC конструкция состояла из двух аллогенных ADSC листов слоистых друг на друга на опорной бумаги мембраны. В ADSCs метили с PKH67 флуорофора, чтобы позволить зонд на основе конфокальной лазерной эндомикроскопии (PCle) мониторинг. В день трансплантации, проводили в 5-ти см и геми-окружная ОУР как известно, индуцирует стриктура пищевода. Животные были немедленно эндоскопически пересаживают с 4 ADSC конструкций. Полная адгезия ADSC конструктов было получено через 10 мин нежного применения. Животных забивали на 28-й день все животные были успешно пересаженной. Трансплантация была подтверждена на 3-й день с положительной оценкой PCle. По сравнению с трансплантированных животных, у контрольных животных развились тяжелые стриктуры, с большим развитием фиброзной ткани, более частой алиментарной неприятности, и снижение веса. В нашей модели, трансплантация allogeniс ADSCs, организованные в виде листов двойных клеток, после продолжительного ОУР был успешным, и в значительной степени связано с более низкой скоростью стриктуры пищевода.

Введение

Управление поверхностных опухолей пищевода изменилась с развитием новых эндоскопических методов. В настоящее время эндоскопическая резекция является первой линии терапии. В самом деле, это связано с более низкими показателями заболеваемости и смертности , чем хирургии с онкологическими равными результатами ^{1, 2, 3.} Эндоскопическая резекция слизистой оболочки (EMR) и эндоскопическая подслизистая резекция (ОУР) являются наиболее широко используемые методы. В случае длительного поверхностных опухолей, является предпочтительным ESD. По сравнению с ЭМИ, ESD позволяет единым блоком резекции, независимо от размера и формы поражения ^{4, 5, 6.} Основная задержка осложнением ОУР является формирование стриктура пищевода, которое обычно происходит от одной до двух недель после резекции. Последние опубликованные исследования показали, что образование стриктур коррелирует сразмер резекции. Японский эндоскопическое общество рекомендует избегать ESD размером более ¾ окружности пищевода, потому что они связаны с развитием стриктуры более чем в 90% случаев и несут ответственность за серьезных проблем кормления и серьезным ухудшением качества жизни.

Предотвращение стриктура пищевода остается сложной. Механизмы, участвующие в формировании стриктуры лишь частично известны. Стриктуры образований похоже, является результатом объединения двух различных механизмов: (1) про-воспалительный клеточный набора и (2) чрезмерное развитие фиброза ^7. Было предложено несколько профилактических процедур. Тем не менее, результаты оказались неудовлетворительными, с мало пользы и серьезных побочных эффектов ^{8, 9.} В последнее время японская команда, Охки и др. , Предложил пересадить сотовый лист однослойный аутологичных клеток слизистой оболочки полости рта в esophageal шрам. Трансплантация была проведена сразу после ОУР ^{10, 11.} Они продемонстрировали эффективность этого инновационного подхода, во-первых, в собачьей модели, а затем у больных.

Полученных из жировой ткани стромальные клетки (ADSCs) перспективны в регенеративной медицине. Их применение в нескольких областях показал интересные результаты, особенно в процессе заживления ран. ADSC терапия имеет ряд преимуществ, потому что клетки легко изолированы и связаны с противовоспалительными свойствами, локальные эффекты иммуномодуляторов, индукция неоваскуляризации и дифференцировку возможностями в мезенхимальных и не-мезенхимальных линий ^{12, 13, 14.}

В предыдущем исследовании, наша команда продемонстрировала эффективность двойной трансплантации эндоскопической ADSC листов для стриктура пищевода предention после продолжительного ОУР в свином модели ^15. В этой статье представлены отчеты о строительстве ADSC листов и эндоскопической техники трансплантации.

Протокол

Все животные были обработаны в соответствии с Комитетом по этике исследований животных (Руководящие принципы Министерства сельского хозяйства на французском языке). Протокол получил одобрение местным комитетом по этике, уполномоченного на экспериментам животных на Парижской Декарта университета (регистрационный номер Mesr 2035,02; факультет медицины Париж Декарт, Париж, Франция).

1. ADSC культура и маркировка

1. Получить подтвержденные ADSCs из частного учреждения. Культура аллогенных ADSCs при 37 ° С и 5% CO ₂ с альфа - минимально необходимой среды, состоящей из 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков (пенициллин и стрептомицин).
2. Получают около 24 х 10 ⁶ ADSCs на одно животное с использованием стандартных процедур расширения клеток (37 ° C и 5% CO _2). Урожай ADSCs с использованием стандартного раствора трипсина (10 мл для T150 блюдо). Выполнить подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
3. Выполните ячейку маркировки день перед трансплантацией использованием PKH67 окрашивания прocedure описано ниже.
   Примечание: Целью процедуры окрашивания, чтобы отслеживать клеток после трансплантации.
   1. Для того , чтобы этикетка 2 х 10 ⁶ ADSCs, подготовить Раствор А (2 х 10 ⁶ клеток 100 мкл разбавляющего C) и раствор B (4 мкл PKH67 с 1 мл разбавител C).
   2. Выдержите Растворы А и В в течение 2 мин. Затем добавьте 100 мкл эмбриональной телячьей сыворотки в течение 1 мин.
   3. Ополосните раствор 300 мкл цитратной RPMI (298,5 мкл среды RPMI и 1,5 мкл цитрат) и центрифуге при 1500 х г в течение 5 мин. Повторите эту операцию 2 раза. Поддерживать меченые клетки и не защищают их от света до листовой конструкции.

2. Дважды ADSC листов Construct

1. За день до пересадки, подготовить 12-луночного температуры реагирующих клеток культуры блюдо с 4 мл на лунку среды для культивирования клеток, описанных выше, до того PKH маркировки. Семенной блюдо с 1,5 × 10 ⁶ PKH-этикетокг клеток на лунку и инкубировать в течение 12 ч (37 ° С и 5% CO _2).
2. В день трансплантации, отсоединение клеток листа сливающийся путем инкубирования блюдо при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Аккуратно аспирата один ADSC лист с пипеткой и слой его на гидрофобной бумаги (диаметром 1,5 см). Используйте эту бумагу в качестве поддерживающей мембраны.
4. Возьмитесь другой ADSC лист и аккуратно поместить его поверх другого, чтобы получить конструкцию двойного слоя.
5. Повторите эти процедуры для получения столько ADSC листов конструкции по мере необходимости (4 на одно животное).

3. пищеводного эндоскопическую подслизистую Рассечение (ESD)

1. В день трансплантации, предварительно самолечением животных с 10 мг / кг кетамина внутримышечного и побудить их с 8 мг / кг внутривенного пропофол. Затем выполните интубации трахеи и поддержания анестезии с изофлуран 2,5% ингаляции.
2. После того, как животное находится под общим наркозом, выполняют ОУР с gastroscОПЕ, A видеоскоп, и блок электрохирургия.
   1. Используйте эндоскопическую нож и мягкой коагуляции для получения Hemi-окружная спинные метки в пределах от 40 см до 45 см от зубной дуги.
   2. Вводят глицериновый раствор, содержащий краситель индигокармин в подслизистый слой для отделения слоя через слизистую оболочку от мышечного слоя.
   3. Используйте эндоскопическую нож с режимом endocut I, чтобы получить окружные надрезы.
   4. Используйте эндоскопическую нож с режимом принудительной коагуляции для выполнения подслизистого рассечения, двигаясь от проксимального разреза к дальнему разреза.
3. В конце процедуры ESD, наблюдать геми-окружная, 5 см длиной пищеводного рубец, раскрывающую мышечный слой.

4. Эндоскопические Трансплантация

1. Сразу же после того, как ОУР, эндоскопически пересаживать животных с 4-мя двойными конструкциями ADSC листов.
   1. Возьмитесь в ADSC листов конструкции с эндоскопическими щипцами изащитить его во время транспортировки на участок раны с использованием большого, прозрачного эндоскопическое колпачок.
   2. Нанесите на всю поверхность конструкции ADSC листа на основание язвы.
   3. Осторожно применять конструкцию ADSC листов в течение 10 мин, чтобы получить полную и стабильную приживление. Для применения, используйте эндоскопических щипцов или эндоскопическое колпачок и нанести всю поверхность ADSC построить на пищеводного подслизистого слоя.
2. Повторите эту процедуру четыре раза для каждого животного, чтобы получить четыре пересажены и прилипшие конструкции двойных клеток листов.
   Примечание: Цель состоит в том, чтобы покрыть Аппроксимативно половину раненых области.

5. Послеоперационный Оценка и последующая деятельность

1. Для каждого животного, обеспечить пост-ESD обезболивание с внутримышечной инъекции 0,2 мг / кг морфина три раза в день в течение первого дня и с 28-дневной анти-кислотной обработки эзомепразола (40 мг / сут). Выполните антибиотикопрофилактику с amoxicillв (1 г / сут) в течение 7 дней. Авторизоваться жидкости на 1-й день и твердые вещества на следующий день.
2. Последующие с животными в течение 28 дней. Получите ежедневные клинические оценки с использованием Mellow Пинкасова дисфагии ¹⁶ и измерения изменение веса.
3. Мультимодальные оценка стриктуры: под общим наркозом, в определенные дни месяца 3, 14 и 28, выполняют мультимодальный оценку возникновения стриктуры.
   1. Провести эндоскопическое оценку с помощью описания шрама, измерение стриктур и обнаружение поддержки бумаги мембраны. Измерьте стриктуры с помощью гастроскоп, чтобы пересечь через стриктурой (диаметр гастроскоп составляет 8 мм). Обратите внимание на шрам, обращая внимание на воспалительный аспект (через слизистую оболочку эритемы, отека слизистой и слизистым спонтанное кровотечение) и отсутствие или наличие опоры для бумаги мембраны внутри рубца.
   2. Применить PCle зеленый зонд через оператора гастроскоп канала непосредственно в рубцовую кровать. Поиск спонтанныйи организованный зеленый сигнал, совместимый с PKH67-меченого ADSC листов конструкта приживления.
   3. Выполните 2 ортогональных числа случаев Барит эзофагографии с радиологической обруча (спереди и левосторонней числа случаев). Хранить сжатые частоту для оценки стриктуры (степень стриктуры (%) = [1- (длина короткой оси при стенозе / длина нормальной оси при стенозе) х 100)]) ^{17, 18.}
4. Жертвоприношение животных.
   1. На 28-й день, в конце периода наблюдения, выполнять жертвоприношения животных. В то время как животное все еще находится под общей анестезией, вводят 100 мг / кг внутривенно фенобарбитал. Обеспечить смерть животных с использованием клиническое обследование на отсутствие сердцебиения и дыхания движения.
   2. После воздействия стернотомии и органов, удалить пищевод от каждого жертвенного животного (10% фиксации буферном растворе формалина, парафин и 4 мкм толщиной секций). Пятно слайдыгематоксилином и шафран ^15. Оцифровки слайды для компьютерного анализа и сравнения групп животных ^15.

Результаты

Культура ADSCs и процедуры для получения ADSC листа показан на рисунке 1. На рисунке 2 показано построение трансплантата, состоящий из двух листов ADSC слоистых друг на друга на своей мембране опоры для бумаги. ADSCs ранее были помечены флуорофора PKH67 , чтобы в естественных условиях мониторинга трансплантата с PCle. На рисунке 3 показаны различные этапы расширенной пищеводной эндоскопическую подслизистую диссекции, что приводи...

Обсуждение

В этой модели свиньи, трансплантация ADSC-лист был технически успешным, и естественных условиях оценка PCle в разрешенных для мониторинга приживления клеток. Клинические, эндоскопические, рентгенологические и гистологические оценки продемонстрировали эффективность эндоскопического ADSC листа при пищеводного профилактики стриктур после продолжительного ОУР.

Эндоскопическое Трансплантация ADSC глицерина раствора, содержащего лист кармин краситель индиго представляет собой нов...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Прозрачный эндоскопический колпачок Q180 совместимый с	гастроскопом Olympus Optical Co
GIF-Q180	Olympus Optical Co
Видеоскопическая система Exera II	Olympus Optical Co
Инъекционная игла 18 G	Olympus Optical Co
Электрохирургический аппарат ERBE ICC 350	ERBE Technology
Indigo carmin 1%	Life Эндоскопический
гибридный нож	Life
Minisonde Z pCLE зеленый зонд	Mauna Kea Technology		Вы должны научиться пользоваться зондом. Манипуляция может быть сложной.
Фетальная бычья сыворотка	Sigma Aldrich	12105C
Трипсин	Sigma Aldrich	T146
Alpha минимальная эфирная среда	Thermo Fisher	22561-021
Фосфатно-солевой буфер	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 набор красителей	Sigma Aldrich	Mini67-KT
12-луночный температурно-чувствительный элемент чашка для культуры	Upcell Thermo Scientific	174900	Почувствуйте влажность с 4 мл стандартной среды культуры за 30 минут до посева клеток
Эзомепразол 40 мг	Biogaran
Moprhine sulfate 50 мг/мл	Lavoisier
Amoxicilline 1 г	Biogaran
Ketamine 250 мг/5 мл	Panpharma
Propofol 10 мг/мл	Fresenius
Hydrophobic paper	Carrefour