Методическая статья

Поток Virometry для анализа антигенные спектры вирионов и внеклеточной везикул

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55020

⸱

25 января 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Intercellular Interactions, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department, Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

В этой статье

Краткое содержание

Вирусы или внеклеточные везикулы иммунозахватывали с помощью магнитных наночастиц с длиной волны 15 нм, связанных с антителами, распознающими поверхностные антигены. Захваченные вирионы или везикулы были помечены флуоресцентными антителами против других поверхностных антигенов. Полученные комплексы разделяли в сильном магнитном поле и анализировали с помощью обычных проточных цитометров, запускаемых на флуоресценции.

Аннотация

Клетки выделяют небольшие внеклеточные везикулы (ВВ) в окружающую среду. При инфицировании вирусом клетки также выделяют вирионы, которые имеют тот же размер, что и некоторые из ВВ. Как вирионы, так и ВВ несут белки клеток, которые их произвели, и являются антигенно неоднородными. Несмотря на их разнообразие, как вирусы, так и ВВ характеризовались преимущественно объемным анализом. В данной статье мы описываем оригинальный высокопроизводительный метод, основанный на нанотехнологиях, который позволяет характеризовать антигены на отдельных мелких частицах с помощью обычных проточных цитометров. Вирусы или внеклеточные везикулы иммунозахватывали с помощью магнитных наночастиц (МНЧ) с длиной волны 15 нм, связанных с антителами, распознающими один из поверхностных антигенов. Захваченные вирионы или везикулы инкубировали с флуоресцентными антителами против других поверхностных антигенов. Полученные комплексы отделяли на магнитных колонках от несвязанных антител и анализировали с помощью обычных проточных цитометров, запускаемых на флуоресценции. Этот метод имеет широкое применение и может быть использован для характеристики антигенного состава любых вирус- и невирусных мелких частиц, генерируемых клетками in vivo и in vitro. Здесь мы приводим примеры использования этого метода для оценки распределения маркеров клеток-хозяев на отдельных частицах ВИЧ-1, для изучения созревания отдельных вирионов Денге (DENV) и для исследования внеклеточных везикул, высвобождаемых в кровоток.

Введение

Клетки многоклеточных организмов имеют много индивидуальных особенностей, которые могут быть либо уникальным для конкретной ячейки или, по меньшей мере, принадлежат уникальных групп ячеек. Даже культивированный клонированные клетки показывают индивидуальные характеристики, о чем свидетельствует их разнообразной морфологии. Кроме того, индивидуальность клетке находит свое отражение в продуктах она выделяет. В случае вирусной инфекции, вирусные частицы могут нести белки из клеток, полученных их. Например, для ВИЧ многих белков клетки - хозяина встроены в вирусной оболочке и вирусы , которые создаются различными клетками могут нести эти белки вируса 1, 2 или "подписи клетка".

Даже без инфекции, клетки выделяют в окружающую медиа маленьких внеклеточного везикул (EVS). Биогенез этих пузырьков и их структуры во многих случаях напоминают, что вирусов, особенно ретровирусов. В последние годы стало ясно,что электромобили, которые первоначально считались «тромбоцитами пыль» 3, представляют собой важную физиологическую систему межклеточной коммуникации. Вместе с двумя другими системами межклеточной коммуникации, а именно межклеточных контактных взаимодействий и выпустили растворимых молекул, электромобили координате нормальной физиологии и изменяются при различных патологиях 4, 5 в том числе вирусных инфекций 6, 7.

Хотя оба выпустили вирусные частицы и внеклеточной везикулы весьма разнообразны, они характеризуются преимущественно навалочных анализа, в которых потеряли свои индивидуальные особенности. Метод сродни проточной цитометрии, которая фенотипы клеток на основе их различных поверхностных антигенов, необходимо, чтобы охарактеризовать отдельные вирусные и вирусоподобные частицы. К сожалению, электромобили или небольшие вирионы не могут быть проанализированы с помощью стандартных цито потокаметоды метрия, потому что они слишком малы, чтобы генерировать сигнал рассеяния света, на котором большинство цитометры полагаются для запуска. Чтобы обойти это ограничение, флуоресценция срабатывания могут быть применены. Тем не менее, если электромобили или вирионы окрашивали флуоресцентными антителами, трудно отличить их от свободных антител и их агрегатов из-за их подобной флуоресценции и сравнимых размеров.

В последнее время мы разработали на основе нанотехнологий метод с высокой пропускной способностью, что позволяет характеризовать антигенов на отдельных мелких частиц с использованием цитометрах регулярного потока 8, 9. Мы используем MNPS до immunocapture частиц , представляющих интерес, как было описано другими группами для различных областей применения 10, 11, 12, 13; однако, наша новая методика позволяет захвата индивидуального SPECIFIC мишени с последующим фенотипирования этих захваченных частиц с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресценции инициирующее, а не рассеяния света, без помех со стороны свободных плавающих антител. Этот метод имеет широкое применение и может быть использовано для характеристики антигенный состав любого viral- и невирусных малой частицы генерируемой клеток в естественных условиях и в пробирке при условии наличия специфических флуоресцирующих антител против поверхностных антигенов. Мы уже применили эту методику для изучения нескольких биологических проблем.

В частности, мы оценивали распределение клеточных маркеров принимающих на отдельных ВИЧ-1 частиц 9, мы исследовали созревание отдельных вирусов Денге (DenV) на основе анализа их поверхностных белков 14 и исследовали EVs выделяется в кровь здоровых добровольцев и больных с острым коронарным синдромом (ОКС). Несмотря на то, основываясь на аналогичном принципе,Применение новой техники потребовало разработки конкретных протоколов, которые описаны ниже.

Протокол

1. Взаимодействие магнитных наночастиц (MNPS)

  1. Используйте коммерческую процедуру сочетания и реагенты для соединения MNPS с антителами (ABS) ( как правило , 1 мг). Используются наночастицы оксида железа с карбоновой кислотой в качестве реакционноспособных групп.
    1. Если антитела в объеме выше, чем 0,5 мл, концентрат с использованием концентратора 100K. Спин при 2000 мкг в течение 3-5 мин.
  2. В конце процедуры, после добавления 10 мкл буфера быстрого охлаждения, передавать MNPS до 75 мм х трубы 12 мм и добавляют 3 мл промывочного буфера / хранения. Поместите пробирку в центральном отверстии магнитного сепаратора и оставляют на ночь при 4 ° С.
  3. Убедитесь, что MNPS есть все собранные на стороне трубки, а затем осторожно пипеткой всю жидкость. Добавьте 3 мл свежего буфера мытья / хранения, и поместить обратно в магните.
  4. После нескольких часов, проверьте, если MNPS собираются на стороне трубки, а затем пипеткой от жидкости. Используйте 2 мл буфера мытья / хранения вресуспендируют MNPS и хранят при температуре 4 ° С.
  5. Убедитесь в том, что Абс соединены с MNPS помечая их соответствующим флуоресцентным фрагментом Fab антитела (например , козий анти-мышь , если используется мышиное моноклональное Ab для захвата , как описано в разделе 2) и работать на проточном цитометре.

2. этикетировочные антитела, подсоединенных к MNPS

  1. Смешайте 60 мкл (3,9 х 10 12 частиц) MNPS (на каждый вариант ) и 5 мкл (200 мкг / мл коммерческого раствора) меченый Fab - фрагменты, специфичные для изотипа захвата Ab в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
  2. Инкубируют при комнатной температуре (КТ) в течение 30 мин при непрерывном перемешивании.
  3. Предварительное смачивание обогатительную 100K 300 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и спина в микроцентрифуге при 1500 х г в течение 5 мин.
  4. Очищают меченые комплексы на 100K колонке. Крутить смеси со стадии 2.2 в микроцентрифуге при 1500 мкг в течение 5 мин, промывают 200 мкл PBS, и восстановить впервоначальный объем.

3. С помощью меченых Ab-МНП комплексов для захвата частиц интереса (вирусы или EVS)

  1. Инкубируйте предварительно меченных MNPS 60 мкл (3,9 × 10 12 частиц) с ВИЧ (60 мкл) или препарата EV (100 мкл).
    1. Подготовка препаратов EV с использованием различных методов. Здесь, очищают на EVs градиенты сахарозы, собирают их из бедной тромбоцитами плазмы с использованием осадков экзосом реагентов или изолировать непосредственно из плазмы 8.
      Примечание: Оптимальные отношения должны быть определены для каждого эксперимента и зависят от концентрации вируса / EV в препарате. МНП-Ab фракция должна быть ~ 10 6 в избытке по сравнению с концентрацией вируса / EV фракции.
  2. Выдержите 40 мин при температуре 37 ° С с осторожном перемешивании на наличие вирусов или 1 часа при температуре 4 ° С для EVS.
  3. Добавить 2,5% IgG мыши / человека IgG, чтобы блокировать связывание Fc, мягко вихрь, инкубировать 3-5 мин при комнатной температуре.
  4. Добавить рекомендованные производителем или титруют концентраций каждого Абс обнаружения и инкубировать дополнительные 20 мин при комнатной температуре.

4. Разделение MNP-захваченного Вирионы (или электромобили) от несвязанных антител с использованием магнитных колонок

  1. Подготовка магнитной разделительной колонны для использования, поместив его в сепаратор магнита.
  2. Предварительно смочить колонку с 500 мкл промывочного буфера (2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS). Дайте промывочный буфер, чтобы протекать через колонку.
  3. Добавьте MNP-вирус / MNP-EV комплексов в колонну и позволить всей жидкости протекать через. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в колонку, что позволяет весь объем проходить через него.
  4. Повторите промывание с большим количеством промывочного буфера в 2 раза.
  5. Удалить столбец из магнита и места в 12 мм х 75 мм трубки для сбора нераспределенной MNP-вируса / MNP-EV комплексов. Пусть колонна стоять в трубе от магнита в течение 3 мин. Добавить 200 мкл PBS и пустьгранулы текут вниз под действием силы тяжести, добавьте еще 200 мкл PBS, и зафиксировать с 200 мкл 4% параформальдегида после элюирования.
    Примечание: параформальдегид является канцерогеном и должны быть обработаны в вытяжном шкафу и следует надевать перчатки.
  6. Для количественной оценки одиночные вирионы / электромобили используют объемные параметры на высокой пропускной способности Sampler (HTS) или непосредственно перед приобретением добавляют хорошо перемешанную проточной цитометрии количества шариков.

5. Анализ MNPS-захваченных вирусов / электромобили с проточной цитометрии

  1. Разминка цитометр потока в течение 30 мин.
  2. Выполнить бисер контроля качества.
  3. Установить порог на флуоресценцию либо MNPS или меченых вирусами / EVS. Используйте 0,22 мкм фильтрованного PBS для порога, чтобы уменьшить фоновый "шум". не указан порог путем изменения напряжения ФЭУ на уровне, где фильтруется PBS дает не, или очень мало, события.
  4. Выполнить образцов на низкой. (Используйте дополнительный 0,04 мкм встроенный фильтр для оболочки жидкости в серии позадистандартный фильтр 0,2 мкм оболочки для дальнейшего устранения ложных событий).

6. Оценка эффективности улавливания

  1. Захват флуоресцентно меченных EVs или ВИЧ с MNP-Абс, как описано в 3.1, 3.2. (Электромобили могут быть помечены либо с помощью мембранного красителя или через своего груза 15; ВИЧ может быть помечено либо через красителем 16 гена закодированные, или с мембраной красителя 12, 17).
  2. Готовят магнитную разделительную колонку, как описано в (4,1-4,2).
  3. Добавьте МНП-вирус / MNP-EV комплексов в колонну и позволить всей жидкости течь через (поток через дробь). Собирают поток через фракции в трубке.
  4. Продолжить фракции задерживается на колонке, как описано в (4,4-4,5).
  5. Повторите процедуру захвата на поток через фракции от 6,3 с последующим разделением (4.1-4.5).
  6. Анализ остаточных фракций от первого окpture и второго захвата, запустив их на цитометр, который установлен на запуск по флуоресцентной метки из электромобили или ВИЧ. Для оценки эффективности, сравнить количество событий в обеих фракциях.

7. Адаптация Протокола для решения конкретных задач

Примечание: В то время как протокол может быть применен к анализу ВИЧ и электромобили, как описано выше, для анализа DENV следующие изменения должны быть введены:

  1. Выдержите вирионов 1 мкМ DiI в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации очистить окрашенную вируса центрифугированием в градиенте плотности среды (10%, 20%, 25% и 35%) при 240000 х г в течение 1,5 ч при температуре 4 ° С, без тормоза. Собирают фракции от 20% до 25% градиента плотности слоев среды 14.
  2. Выдержите DiI меченый DenV 1 х 10 7 (60 мкл) с концентрацией рекомендованы производителем или титруют их обнаружения Ab в присутствии 2,5% IgG мыши в течение 20 мин при комнатной температуре.
  3. Incubели смесь с предварительно меченных по 60 мкл (3,9 × 10 12 частиц) МНП захвата Ab комплексов в течение 40 мин при температуре 37 ° С при осторожном перемешивании.
  4. Раздельные результате комплексы от несвязанного Abs на магнитных колонках, как описано выше, и анализируют на проточном цитометре.

Результаты

Селективный захват клеточных антигенов ВИЧ-1 вирионов

С "virometry потока" теперь можно визуализировать клеточные антигены на отдельных вирусных частиц. В качестве примера, мы сосредоточили внимание на двух клеточных антигенов, переносимых ВИЧ-1, LFA-1 и HLA-DR. Ранее эти два антигены были выявлены у ВИЧ-1 препаратов , анализируемых в объеме 1. Мы подготовили MNPS в сочетании с одним из антител против белка Env ВИЧ, VRC01, и захватил с этими MNPS ВИЧ-1 вирионов (ВИЧ-1 или ВИЧ - LAI.04-1 SF162 , произведенных в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК)). Кроме того, мы окрашивали эти вирионов 2G12, другим антителом анти-Env. Поток virometry показал высокую гетерогенность ВИЧ-1 вирионов о присутствии LFA-1 и HLA-DR. В среднем на 16,7 ± 2,0% (n = 6) и 8,6 ± 0,3% (N = 3) ВИЧ-1 LAI.04 вирионов , проведенных LFA-1 и HLA-DR,соответственно. Только 4,8 ± 0,6% (N = 3) из всех вирионов были положительными для обоих антигенов. С другой ВИЧ-1 , штамм ВИЧ-1 SF162, эти антигены присутствуют на 20,0 ± 4,4% (n = 6) и 10,8 ± 1,3% (N = 6) вирионов, соответственно, в то время как оба антигена были выполнены на 6,5 ± 0,4% (рисунок 1).

Распределение клеточных белков зависит от клеток, которые реплицируются вирус. ВИЧ-инфицированные клетки Jurkat, произведенные вирионы антигенно отличаются от тех, производится зараженных МНПК. Вирионов ВИЧ-1 LAI 0,4 производимого Jurkat клеток проводили на 1,6 ± 1,4% (n = 3) и 1,6 ± 0,7% (N = 4) , LFA-1 и HLA-DR , соответственно. Для получения 1 ВИЧ-SF162 вирионов , производимых в Jurkat клетках, эти показатели были 7,2 ± 2,5% (N = 3) и 5,6 ± 2,7% (п = 4). Таким образом, антигенный состав ( по крайней мере , для HLA-DR и LFA-1) была различной для ВИЧ-1 LAI.04 производится двумя различными сотеТипы (р <0,02).

Поток virometry применительно к оценке вируса денге

DENV Созревание связано с экспрессией белка PRM на вирионы. Мы применили virometry потока оценить, какая доля DENV производимого в ВНК-1 и в клетках LoVo образует зрелые вирусы. Вирионы окрашивали красителем липидной DiI. Анализ отдельных захваченных вирионов показал PRM на 48,2 ± 5,3% (n = 8) DENVs. В противоположность этому, 84,5 ± 3,4% (N = 4) из DENV продуцируемый в клетках LoVo проведенных PRM. Остальные вирионов соответственно 51,8 ± 5,3% (N = 8) и 15,5 ± 3,4% (N = 4) были отрицательными PRM (рисунок 2). Таким образом, поток virometry может быть использован, чтобы отличить полностью зрелый индивидуальный DenV из незрелых (или частично зрелых) DenV вирионов.

Внеклеточного везикул высвобождается в кровоток здоровогодобровольцев и больных с острым коронарным синдромом (ОКС)

Для того чтобы исследовать различные подмножества EV у пациентов с ОКС и здоровых людей, мы захватили EVs из бедной тромбоцитами плазмы (РРР) люминесцентными MNPS связью с антителами против CD31, CD41a или CD63. Электромобили , захваченные CD31-MNPS окрашивали для CD41a и CD63, электромобили , захваченные CD41a-MNPS окрашивали на CD31 и CD63, и электромобили , захваченные CD63-MNPS окрашивали на CD31 и CD41a (рисунок 3).

Количество электромобили захвачен CD31-MNPS и положительный результат для одного или двух антител обнаружения у больных с ОКС было 3359 [2328; 5,472] электромобили / мкл по сравнению с 1,272 [714; 2,157] электромобили / мкл у здоровых добровольцев (р = 0,001). Общая сумма электромобили захвачена CD63 у пациентов с ОКС по сравнению со здоровыми добровольцами был 3541 [1318; 5,173] электромобили / мкл против 806 [488; 2,112] электромобили / мкл (р = 0,007). Были 4752 [3238; 7,173] электромобили / мкл в плазме крови больных с ОКС, захваченных CD41a-MNPS, в то время как в плазме крови здоровых добровольцев этот показатель был значительно ниже, 2,623 [1,927; 4188] электромобили / мкл (р = 0,015). В целом, наши результаты указывают на то, что, в то время как EV суммы были в основном увеличены у пациентов с ОКС, величина прироста была различна в разных подгруппах ЕВС.

figure-results-1
Рисунок 1: Избирательное введение клеточных антигенов в ВИЧ-1 вирионов реплицироваться в различных типах клеток. ВИЧ (ВИЧ-1 или ВИЧ - LAI.04-1 SF162) вирионы , выпущенные МНПК или Jurkat клетки были захвачены с VRC01-MNPS и окрашивают второй анти-gp120 антитела 2G12 , и со специфическими антителами против HLA-DR и LFA-1. Окрашенные препараты подвергали анализу для потока HLA-DR (белые столбики) и LFA-1 (черный баRS). Средства ± SEM от трех до шести экспериментов 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Созревание состояние DenV вирионов. DenV производится в ВНК-21 клетки (А, В) или в клетках LoVo (C, D) были помечены липидного красителя DiI и после центрифугирования в градиенте плотности среды, окрашивали для PRM белка с 2H2 антителами (A, C) или с контролем изотипа IgG2a (B, D). Меченые вирионы затем были захвачены с 3H5-1-MNPS и подвергали анализу потока 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогоцифра.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ электромобили от пациентов с ОКС и здоровых людей . Плазменные электромобили были захвачены с CD31-MNPS, CD63-MNPS или CD41a-MNPS и окрашивали антителами против CD41a и CD63, CD31 и против CD41a и против CD31 и CD63 соответственно. Захваченные электромобили, окрашивали по крайней мере, один из СБА обнаружения, визуализировали и перечислены в анализе потока. Данные представлены в виде точечного участка с медианным и межквартильного диапазоне (IQR). Зеленые символы: здоровых добровольцев (контроль), коричневые символы: ACS пациентов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Evaluatiна фракции потока событий, которые представляют собой отдельные вирионы. (А) ВИЧ-1. Подвеска вирионов была разделена на две части и окрашивали либо с Оказалась (левая панель) или DiO (средняя панель). После перемешивания суспензии, которая содержала два дифференцированно запятнанные вирионов, был захвачен с VRC01-MNPS и подвергали потока virometry (правая панель). Заполнители (Двухцветные события) составляли менее 10% от общего числа событий. (B - D) DENV. Подвеска DiI-окрашенными вирионов серийно разводили в два раза от 1: 2 до 1: 256 и приобрел с HTS на проточном цитометре (B). DiI-DENVs метили антителами 2Н2 (С) или DII-DENVs были захвачены с 3H5-1-MNPS (D). Препараты С и D были затем серийно разводили в два раза от 1: 2 до 1: 256 и приобрел с HTS 14. Вирионы, кажется, не агрегировать, так как во всех случаяхпредставляет собой линейную зависимость между коэффициентом разбавления и количества событий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Обнаружение одиночных частиц в проточном цитометре. DiI окрашенных DENV суспензию последовательно разбавляли в два раза от 1: 2 до 1: 2,048 и приобретенные с использованием HTS на проточном цитометре. (А) Количество обнаруженных вирусов в зависимости от коэффициента разбавления. (Б) медиана интенсивности флуоресценции (MFI) из DiI маркированы DenV 14. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 6: Оценка доли вирионов и внеклеточной везикул , захваченных с MNPS , соединенными с специфическими антителами. Меченые вирионы ВИЧ-1 или электромобили были захвачены с MNPS в сочетании со специфическими антителами и подвергнутых потоку virometry. После разделения на магнитных колонках, проточные (не сохранены) фракции анализировали на присутствие вирионов или электромобили, представляющие интерес, которые были пропущены в первом запуске. (A) Меченые вирионы ВИЧ-1 Bal были захвачены с 2G12-MNPS (левая панель). Проточный фракцию пойманы и подвергнуты потоку virometry (правая панель). В первом цикле были захвачены около 95% вирионов интереса. (B) Меченые электромобили были захвачены с анти-CD81 MNPS и изолированные на магнитных колонках (левая панель). Проточный фракцию повторно захватили и анализировались (правая панель). Во-первыхцикл около 99% везикул интереса были захвачены 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Обычные цитометры потока остаются основным инструментом для анализа клеток на основе их физико-химических характеристик на индивидуальном уровне 18. Основные принципы проточной цитометрии не были изменены с момента его разработки: клетка, которая проходит через лазерный луч и рассеивает свет представляет собой событие, которое запускает запись флуоресцентного спектров, излучаемых клеток переплете флуоресцентных антител. Более мелкие частицы менее 300 нм , не могут быть обнаружены с помощью бокового разброса цитометра , как они рассеивают больше света под большими углами , при которых наиболее проточный цитометр не собирают свет 18. Техника, описанная здесь, позволяет идентифицировать и анализ нескольких антигенов на многочисленных отдельных вирусов или электромобили с помощью обычных цитометров с флуоресцентной срабатывания.

Критические шаги в протоколе, являются связывание антител к MNPS. Наши эксперименты были perforMed с использованием 15 нм наночастиц оксида железа с карбоновой кислотой в качестве реакционно-способную группу, как описано выше 9. По словам производителя, каждый 15 нм MNP может связываться максимум 20 антител; мы связываем примерно 10 антител на 15-нм МНП. Эта оценка основана на количестве антител до и после связывания и числом шариков / мл, как измерено с помощью наночастицами характеризации и проклейки приборов. В принципе, соединение может привести к агрегации частиц и нежелательно. Для того, чтобы проверить, что агрегация не происходит с нашим протоколом, мы проверили это с наночастицами характеризации и проклейки приборов. Этот прибор измеряет гидродинамический диаметр для частиц, который включает покрытия и антител слоев, а не только ядро ​​15 нм. Мы обнаружили, что большинство соединенных бусинок расположены на одном пике (средний пик при 64,7 ± 4,2 нм с 90% всех событий ниже 73 ± 7,3 нм). Смешивание Ab-МНП сотрудничестваmplexes с вирионов или электромобили в правильной пропорции важно, чтобы MNPS в концентрации на несколько порядков выше, чем EVs / вирионов. Это очень важно для того, чтобы одиночные электромобили / вирионы анализируются. Избегайте совпадения событий, запустив цитометр при низком расходе. Убедитесь в том, чтобы вызвать приобретение на флуоресценцию и использовать объемные элементы управления для измерения концентрации захваченных лиц.

Тем не менее, MNPS может агрегировать или EVs вирионов поперечным сшиванием или связыванием двух или более вирионов к тому же наночастицами. Чтобы проверить это, тест на агрегацию , как описано на рисунке 4 , должно быть выполнено. Даже индивидуально захваченные вирионы или электромобили могут одновременно войти в лазерный луч потока цитометр. Это приведет к созданию ложной позитивности для двух различных антигенов. Чтобы избежать этого, цитометр потока должен быть установлен, как это описано и препараты должны быть разбавлены. Можно проверить, является ли происходит совпадение с помощью того жеСтратегия, как описано в предыдущем пункте. Кроме того , отсутствие совпадения может быть проверена путем анализа серийных разведений препарата и доказательства того, что число событий линейно уменьшается с разбавлением в то время как средняя интенсивность флуоресценции флуоресцентно витражного антигена остается постоянным во всех разведениях (рисунок 5). Другая проблема заключается в том, что слишком мало вирусов / электромобили могут быть захвачены. Это может быть из-за истинного дефицита вирусов / электромобили, которые несут антигены, через которые они захвачены конкретным MNPS. С другой стороны , эффективность захвата мала по разным причинам (например, неэффективное связывание антител к MNPS, отклонение от соотношения MNPS вирионов / электромобили , разработанные для данного протокола и т.д.). Для того, чтобы избежать последней возможности эффективность захвата должна быть специально оценены. Как правило, эффективность должна быть около 90% , как на рисунке 6.

Различные антитела могут создавать помехи из-застерические друг с другом или с антителами, соединенными с MNPS. Для того, чтобы убедиться, что этого не произошло обратного захвата протокол должен быть проверен (как описано в разделе 7. В кратком изложении, вирионов или электромобили должны быть сначала окрашивают флуоресцентным Абс обнаружения, а затем захвачен Ab-MNP комплексов с последующим отделением от свободных плавающих на Абс магнитные колонки.

Flow virometry имеет значительные преимущества по сравнению с существующими методами анализа антигенного состава вирионов или электромобили. Плановые биохимические методы сообщают об общем присутствии определенных белков в препаратах, но не дают никакой информации о гетерогенности вирионов или электромобили. Это включает в себя immunocapture вирионов или электромобили на больших коммерчески доступных частиц. Такие частицы, как правило, от нескольких микрон в диаметре, и каждый из них может захватить сотни или тысячи вирионов или электромобили. Таким образом, любые последующие средние анализа от свойств вирионов / электромобилизахвачен одной частицей. В противоположность этому, поток virometry использует MNPS 10-15 нм в диаметре и с описанным протоколом по меньшей мере, 90% от событий, представляют собой единую вириона или одного EV.

Основным ограничением является то, что все население вирионов или электромобили в препарате не могут быть проанализированы, но только те, которые будут захвачены. Таким образом, выбор антигена, через который вирионы или электромобили захватываются становится критической. Кроме того, в отличие от потока цитометрии числа различных антигенов (количество флуоресцентными антителами против различных антигенов) ограничена малой поверхности вирионов или электромобили. И, наконец, различные антитела могут стерически мешать снова друг с другом из-за малой поверхности (по сравнению с клетками).

Текущий протокол может быть адаптирован для анализа любого вируса или EV любого происхождения, при условии, что специфические антитела, посредством которых они могут быть захвачены доступны. Анализ антигенов на индивидуального разрешения вирионовы исследователей обратиться к патогенез различных фракций вирусных популяций. Кроме того, идентификация отдельных электромобили в плазме может сделать возможным проследить происхождение электромобили к конкретным клеткам и сообщать о нормальных или патологических состояниях этих клеток и органов, в которых они проживают.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа AA, SZ, WF, J-C. G, и LM был поддержан программой NICHD Intramural Program. Работа МВ поддержана грантом Правительства Российской Федерации #14.B25.31.0016.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<прочные>материалы
карбоксиловые магнитные наборы для конъюгации наночастиц оксида железаOcean NanotechICK-15-005
Amicon Ultra-4 Центробежный фильтрующий блок с мембраной Ultracel-100MilliporeUFC810024
5 мл Круглое дно Пробирка из полипропилена, без крышкиFalcon352002
обработанной DEPC водаКачество Биологическая 351-068-131
Магнитный сепаратор SuperMAG-01Ocean NanotechSuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Мышь IgG1  Набор для маркировкиThermo Fisher ScientificZ25055
Центробежные устройства для наносепа с мембраной Омега 100kPall CorpOD100C34
EDTA 0,5 МCorning Cellgro46-034-CI
Сыворотка крупного рогатого скота Раствор альбуминаSigma-AldrichA9576-50ML
PBSGibco10010-23
Параформальдегид, класс EM, ОчищенныйEMS15710
123 штуки eBeads eBioscience01-1234-42
Бусины CytoCountDakoS2366
AccuCheck Подсчет бусинInvitrogenPCB100
Настройка и настройка цитометра Набор бусин для слежения (CST)BD Bioscience642412
раствор для маркировки клеток Vybrant DiIThermo Fisher ScientificV22885
Name<>CompanyНомер в каталогеComments
Equipment
&микро; Рубрика MACS Miltenyi Biotec130-042-701
OctoMACS Сепаратор магнитMiltenyi Biotec130-042-108
NanodropThermoFishernone
NanoSight NS300Malvernnone
BD LSRII проточный цитометрBD Biosciencenone
NameCompany>Каталожный номерКомментарии
>Программное обеспечение
Flowjo программное обеспечениеFlowjo
BD FACSДива программное обеспечениеBD
strong

Ссылки

  1. Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19 (8), 346-351 (1998).
  2. Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65(2012).
  3. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13 (3), 269-288 (1967).
  4. Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21 (3), 157-171 (2007).
  5. Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145 (6), 962-970 (2003).
  6. Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17 (1), 33-42 (2003).
  7. Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190 (12), 6351-6359 (2013).
  8. Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11 (3), 489-498 (2015).
  9. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123 (9), 3716-3727 (2013).
  10. Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (1), 774-781 (2015).
  11. Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3 (2), 85-92 (2013).
  12. Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31 (8), 1374-1385 (2013).
  13. Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11215-11223 (2015).
  14. Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
  15. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029(2015).
  16. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159 (3), 441-452 (2002).
  17. Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79 (3), 1533-1542 (2005).
  18. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).

Перепечатки и разрешения

Теги

1
Поток Virometry для анализа антигенные спектры вирионов и внеклеточной везикул
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.