Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55063

⸱

15 января 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого исследования заключалась в разработке технологий, которые позволяют для успешного гена трансдукции в первичной естественной убийца (НК) клетки. Декстран опосредованной лентивирусные трансдукции человека или мыши первичной NK клеток приводит к более высокую эффективность выражения гена. Этот метод гена трансдукции значительно улучшит NK клеток генетические манипуляции.

Аннотация

Эффективное трансдукции специфических генов в естественных убийца (НК) клетки был серьезной проблемой. Успешное transductions имеют решающее значение для определения роли гена интереса в разработке, дифференциация и функции НК-клеток. Последние достижения, связанные с химерных антигена рецепторов (машин) в Рак иммунотерапия подчеркнет необходимость эффективным способом доставить экзогенных генов эффекторные лимфоциты. Эффективность лентивирусные опосредованной гена transductions в первичной человека или мыши НК-клетки остаются значительно низкими, который является основным сдерживающим фактором. Последние достижения, с использованием катионных полимеров, таких как Полибрен, показывают эффективность трансдукции улучшение ген в Т-клеток. Однако эти продукты не удалось улучшить эффективность трансдукции НК-клеток. Это работа показывает, что декстрана, разветвленные глюкан полисахарид, значительно повышает эффективность трансдукции человека и первичных НК-клеток мыши. Эта методология высокую воспроизводимость трансдукции предоставляет компетентным инструмент для преобразования человека первичной НК-клеток, которые можно значительно улучшить клинические гена доставки приложений и, таким образом, NK на основе ячеек Рак иммунотерапия.

Введение

Природные убийца (НК) клетки являются основными лимфоцитарный населения врожденной иммунной системы1. НК-клетки функционируют как защитники первой линии иммунного ответа против опухоли и инфекции2,3,4. НК-клетки также играть центральную роль в развитии терпимости через секрецию цитокинов мощным и chemokines5. Благодаря мощным способности и ликвидации опухолевых клеток в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания для оценки доноров производные человеческих клеток NK как адоптивной иммунотерапии рака6,7. В отличие от Т-клеток биология развития НК-клеток имеет пока быть хорошо изученных8. Этот недостаток знаний является частично из-за отсутствия эффективных методов, которые обеспечивают генов интерес к мыши или первичной NK клеток человека. По этим причинам большинство НК клеток исследования были проведены в клеточных линий, а не в Главные ячейки. Таким образом необходимость надежного и эффективного протокола передавать первичной НК-клеток с генами интерес имеет решающее значение.

Общая цель этого исследования заключалась в разработке последовательного и надежный метод, по которому первичного человека или мышиных НК-клеток может преобразованы с lenti - или ретровирусы.

Были выполнены более ранних исследований, которые пытались решить эту проблему, главным образом с помощью переходных преобразования первичного НК-клеток. Это включает плазмида трансфекции9,10, вирус Эпштейна - Барр (EBV) / ретровирусной гибрид вектор11, коровью векторные12,13и Ad5/F35 химерных векторов аденовирусных14. Несмотря на скромные эффективность этих методов преходящий характер трансдукции делает их непригодными для долгосрочного использования генетически модифицированных НК-клеток. Несколько недавних исследований использовали ретровиральных векторов передавать НК-клеток, требуется проведение нескольких циклов инфекции для достижения приемлемого уровня ген выражение11,15. В отличие от ретровиральных векторов лентивирусные векторы можно использовать клетки хозяина ядерного импорта техники для перемещать вирусный комплекс предварительных интеграции в ядре. Это является основным сдерживающим фактором в репликации вируса в-деления клеток, которые включают основной НК-клеток.

Взаимодействие между различными клетк поверхности рецепторы и вирусных частиц позволяют вирусный поглощения в клетку. Первоначальные обязательства между вирусной конверт белков и их рецепторов родственных узлов может быть ограничена из-за потенциальными отрицательными зарядами, существующие между этими двумя. Многие методы трансдукции объясняется что добавление катионных полимеров, таких как Полибрен (Pb), протамина сульфат (PS) или декстрана, могут дать положительный заряд с рецепторами клеточной поверхности и тем самым увеличить привязки вирусных конверт белки. Это увеличит эффективность слияние и поглощение вирусных частиц на клетки16. Хотя сообщалось, что Pb или PS может улучшить передачу генов в клетки T17, их применение не никакого эффекта в электромеханической эффективности первичного НК-клеток. Кроме того сравнительный анализ этих реагентов с использованием первичных НК-клетки не была выполнена. В этом исследовании сравнивали электромеханической эффективности трех катионных полимеров. Результаты показывают, что среди этих трех катионных полимеров, только декстрана значительно повышает эффективные вирусный трансдукции как мышь, так и первичной NK клеток человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные протоколы следовать гуманным и этического лечения животных и были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в пределах центра биомедицинских исследований (BRC) из медицинского колледжа штата Висконсин (ЗМК), Милуоки, WI. Использования в мононуклеарных клеток периферической крови человека (получения) был одобрен институционального обзора (КИБ) крови научно-исследовательского института из крови центр штата Висконсин, Милуоки, Висконсин.

1. мышей, клеточных линий и векторы

  1. Получите мышей C57BL/6 от коммерческих поставщиков. Сохранить мыши колонии в условиях возбудителя бесплатно и использовать мышь женского и мужского пола в возрасте от 6 до 12 недель. Получите обезличенных человека получения от IRB утвержденных источников.
  2. Анестезировать животных со смесью 20-30% v/v изофлюрановая в пропилен гликоль (1, 2-пропандиола, USP класс) чтобы анестезировать мышей. Применять мазь ветеринара для глаз для предотвращения сухости, в то время как мыши находятся под наркозом.
  3. Чтобы усыпить животных, выполните шейки матки дислокации после индукции анестезии.
    1. Останови мышей, твердо держа основание хвоста с одной рукой. Место крепкие палки тип пера или пальца и первым пальцем другой руки против задней части шеи, в основании черепа.
    2. Производить дислокации, вставьте руку, сдерживающих голова животного вперед и надавите потянув назад с рукой, держа хвост базы. Проверьте эффективность дислокации, чувство для разделения ткани шейки матки.
  4. Держать животных в клетке камеру, по крайней мере 5 минут и удалите их, только когда дыхательную активность отсутствует или когда есть отсутствие обнаружению пакета пульса.
  5. Получить клетках K562 и МЦ-1 от коммерческих поставщиков и поддерживать их в RPMI1640 среде, содержащей 10% тепло инактивированная FBS. Проверьте эти клеточные линии периодически, чтобы исключить возможность заражения микоплазмы.

2. Подготовка и титрование лентивирусные векторы

  1. Культуры 5 × 106 293T клеток на ночь в колбе2 см T75, содержащий решение 20 мл RPMI1640 среды с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, пируват натрия 1 мм, 5%, 7,5% раствора бикарбоната натрия и 0,001% Β-меркаптоэтанол. Место колбу в инкубаторе 37 ° C, infused с 5,2% CO2.
  2. Урожай 293T клетки, с помощью трипсина (0.025%)/EDTA (1 мм) в фосфат амортизированное saline (PBS). Добавьте 5 мл трипсина/ЭДТА в PBS и инкубировать и фляги для 10 минут при 37 ° C инкубатор разрешить отряд 293T клеток из T75 см2 фляги.
    1. Собирать отдельные клетки и мыть их дважды в PBS для удаления любых следов трипсина и ЭДТА. Подсчет количества ячеек с Горяева и настроить мобильный номер один миллион клеток / мл.
  3. Transfect 293T клетки18 с 3,95 мкг psPAX2, 1.32 мкг pMD2G и 5.26 мкг ОРЗЗ GFP-Пуро (порожденных собственными силами в BRI клонирования EF1alpha промоутер от pWPI вместо ЦМВ промоутер в pLenti ЦМВ-GFP-Puro)19.
    1. Подготовка 1 мл 150 мм NaCl плюс 63 мкл polyethylenimine 0,6 мг/мл (пей; 25 000 kD, линейная). Хорошо перемешайте и затем добавить плазмиды и перемешать. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре, а затем добавить его в клетки.
    2. 16 h после трансфекции, заменить трансфекции среднего со свежими средний плюс 4,5 мм натрия бутират. Урожай супернатанта, содержащий вирус 48 ч после transfection и сконцентрировать центрифугированием ночи на 5000 × g. Смотрите таблицу материалов.
  4. Определить вирусную титры, с помощью 293T клетки, выполнив серийных разведений и анализа потока цитометрии 72 ч после трансдукции20. Используйте выражение зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) в качестве меры для количественного определения вирусных титры.

3. Очистка и расширение мышиных первичных НК-клеток

  1. Очищают мышиных первичных клеток NK21. Вкратце передайте одноклеточных селезенки суспензий через столбцы шерсть нейлон истощения адэрентных популяций, состоящий из лимфоцитов и макрофагов.
  2. Культура, население не сторонник этого eluted из столбца шерсть нейлон, содержащий мышиных НК-клеток с 1000 ед/мл интерлейкина -2 (IL) в RPMI1640 среде с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, 1 мм пируват натрия, 5% бикарбоната натрия 7,5% решение и 0,001% β-меркаптоэтанол (RPMI1640 полный средний).
  3. Изменения среды из колбы на 4 день этой культуры, чтобы удалить не сторонник T и NKT клетки; клетки, которые по-прежнему соблюдать колбы в основном НК-клеток. Добавьте 20 мл свежего RPMI1640 полного среднего и 1000 ед/мл IL-2 пополнить колбы.
  4. Проверить чистоту мышиных NK клеточных культур на 7 день подачей cytometry с NK клеток специфических маркеров20 с использованием препаратов с более чем 95% CD3–NK1.1+ населения.

4. Очистка и расширение первичного NK клеток человека

  1. Изолируйте репликацию, градиент плотности от Баффи пальто здоровых добровольцах. Вкратце, тщательно слой 35 мл половину разбавляют (HBSS) клеток более 15 мл градиент плотности в 50-мл канонические трубку. Центрифуга на 400 × г за 30 мин при 20 ° C в размахивая ведро ротора без тормозов.
  2. Используйте комплекты коммерческих антител-отбора на основе негативных для очистки человека первичной НК-клеток по данным производителя протокол.
  3. После изоляции определите чистоту препаратов NK клеток с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Пятно NK клеток препараты с 2 мкг/мл анти CD3 и 2 антитела анти CD56 мкг/мл при температуре 4 ° C для 20 минут вымыть клетки дважды с PBS NK клеточных популяций определяется отсутствие CD3 и присутствие CD56 на поверхности клеток.
  4. Инкубации клеток подготовки с антителами к 20 мин при температуре 4 ° C, мыть с PBS и анализировать в проточный цитометр. Использовать препараты NK клеток с более чем 85% чистоты для трансдукции гена assays20.

5. трансдукции мышиных и человека первичной НК-клеток с человека

  1. Приостановить мыши или первичной НК клеток человека в пластине 24-Ну на 0.5/мл5× 10 средних присутствии GFP человека супернатант в 5, 10 и 20 кратности инфекции (МВД) и в присутствии Pb (8 мкг/мл), PS (8 мкг/мл) или декстрана (8 мкг/мл).
  2. Центрифуга пластины на 1000 g × 60 мин.
  3. Без декантирующие супернатанта, культура клетки на ночь (16-18 ч) в инкубаторе 37 ° C, infused с 5,2% CO2.
  4. Вымойте с 10 мл PBS и Ресуспензируйте в 2 мл полной питательной среды RPMI1640 присутствии Ил-2 (300 ед/мл).
  5. Протестировать человека и мыши первичного НК клеточный цитотоксичность против K562 и МЦ-1, соответственно, выполняя 51хрома (Cr)-релиз анализов в разнообразных коэффициентов эффекторных целевой ячейки22.
    1. Вкратце дают один миллион целевой ячейки 50 Μки radiolabeled натрия хромат 51Cr. Во время 4-h инкубации они поглощение 51Cr в клеточных белков. В конце инкубации Вымойте клетки для удаления любых неприсоединенной подписи.
    2. Вычислить конкретные опухоли лизис клеток, количество абсолютной, спонтанный и экспериментальный выпуск 51Cr из клеток-мишеней.
      Примечание: Расчет доли конкретных лизис из pentaplicate экспериментов было сделано с помощью следующего уравнения: конкретные лизис % = ((51Cr означает экспериментальный релиз - 51Cr среднее Самопроизвольный отпуск) / (51Cr означает Максимальная релиз - 51Cr означает Самопроизвольный отпуск)) х 100, где «51Cr среднее Самопроизвольный отпуск» 51Cr, освобожден из клеток-мишеней в отсутствие НК-клеток и «51Cr среднее максимальное освобождение» 51Cr выпустили из клетки-мишени после лизиса 2 N соляной кислотой (HCl).
  6. Урожай transduced НК-клеток на 7 день, осторожно нажав колбы.
    1. Активируйте заготовленных клеток с титруемая концентрации МАБ пластины прыгните анти NKG2D (A10), покрытие 96-луночных, высоко белка абсорбент пенополистирольные плиты с 2,5 мкг/мл концентрация анти NKG2D МАБ на ночь.
    2. Мыть каждый хорошо с 100 мкл PBS три раза перед добавлением первичных НК-клеток.
  7. Собирайте supernatants культуры с помощью многоканальных дозаторов между 16 и 18 h после активации для количественного определения цитокинов, таких как ИФН γ. Генерировать стандартные кривые, с использованием рекомбинантного цитокинов, предоставлены комплекты иммуноферментного анализа (ИФА).
  8. Проверить жизнеспособность клеток NK с помощью annexin-V/7-амино дактиномицин D (7-AAD) пятная23 и определить процент отмершие клетки среди преобразованные НК-клеток с помощью проточный цитометр.
    1. Выполнять этот assay, урожай, мышиных и человека NK клеток через четыре дня после трансдукции, мыть два раза с 10 мл холодного PBS на 500 g × 5 минут и инкубировать с Annexin V (PE) / 7-AAD комплект.
  9. Используйте соответствующий поток цитометрии программное обеспечение для анализа данных. Выберите жить клеток населения и проанализировать выражение гена GFP (FITC канал) как мера вирусных трансдукции24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Декстран индуцирует эффективного гена передачи лентивирусные вектора в первичных человеческих и мышиных НК-клеток

NK клеток человека были изолированы и очищенной от КСДОР (с чистотой более 85%) и инкубированы всю ночь с Рус-2 300 ед/мл. Эти первичной клетки были затем преобразованы с GFP человека на разнообразный кратности инфекции (MOI; 3, 10 и 20 МЕ в ячейке) в 24-ну пластины при наличии 8 мкг/мл Pb, PS или декстрана. Клетки были...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование показывает что использование декстрана как агент Катионный полимер повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человека первичной НК-клеток. Кроме того другие катионные агентов, таких как Pb или PS, имеют не дает ощутимого эффекта на поставку вирусных векторов в первичных NK клеток человека. Ранее было продемонстрировано, что Pb может увеличить трансдукции генов в клетки человека Т17. Эти результаты, однако, показывают, что Pb ни PS имеют аналогичные КПД на человека...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы утверждают не финансовый конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Lucia Саммарко и ее Лулу лимонада стенд для вдохновения, мотивации и поддержки. Эта работа частично поддержали NIH R01 AI102893 и CA179363 по с.м R01 NCI (.); NHLBI-HL087951 (С.Р.); НИЗ CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Алекса Лимонад Стенд Фонд (с.м.); HRHM программа Фонда Макк (с.м.; С.Р.; M.S.T); Фонд семьи Николая (с.м.); Семья Gardetto (с.м.); Ученые Hyundai программа (САС); Надежда Hyundai на колесах (с.р.); МАКК фонд (САС и с.м.); Детская научно-исследовательский институт, MCW (с.р.); и Кэти Фогерти Даффи премии (M.J.R.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ДекстранСигма-Олдрич90-64-91-9
полибрен (Pb)Сигма-ОлдричTR-1003
сульфат протамина (PS)Сигма-Олдричp3369
ТрипсинCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Фетальная бычья сывороткаATALANTAS11150
ПенициллинCorning30-001-CI
B-меркаптоэтанолSIGMAM3148
пируват натрияCorningMT25000CI
интерферон гамма (ИФН-&гамма; )eBioscience14-7311-85
Раствор для окрашивания пропидиумаBD51-66211E
Липофектамин 3000Thermo FisherL3000015
ИзофлуранPHOENIXNDC 57319-559-05
Набор для отбора отрицательных NK-клетокСтволовые клетки19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
МышиJakson664
293T клеткиATCCCRL-3216
T75 колбыCornnig430641U
наборы для отрицательной селекции на основе антителСтволовые клетки19055
51Анализ на высвобождение хрома (Cr)perkin elmer'sNEZ030
Наборы ИФАEbioscience00-4201-56
Бутират натрияSigma5887-5G
Линейный полиэтилениминполинауки23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

Ссылки

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95(2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94(2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529(2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.