Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis

Summary

Мы установили способ очистки coregulatory взаимодействия белков с использованием системы LC-MS / MS.

Abstract

Транскрипционные корегуляторы жизненно важны для эффективной транскрипционной регуляции структуры ядерного хроматина. Корегуляторы играют различные роли в регулировании транскрипции. К ним относятся прямое взаимодействие с факторами транскрипции, ковалентная модификация гистонов и других белков, а также случайное изменение конформации хроматина. Соответственно, создание относительно быстрых методов идентификации белков, которые взаимодействуют в этой сети, имеет решающее значение для улучшения нашего понимания основных регуляторных механизмов. LC-MS/MS-опосредованная идентификация партнера по связыванию белка — это валидированный метод, используемый для анализа белок-белковых взаимодействий. Путем иммунопреципитации ранее идентифицированного члена белкового комплекса с антителом (иногда с антителом к меченому белку) можно идентифицировать его неизвестные белковые взаимодействия с помощью масс-спектрометрического анализа. В данной работе мы представляем метод получения белка для LC-MS/MS-опосредованной высокопроизводительной идентификации белковых взаимодействий с участием ядерных кофакторов и их партнеров по связыванию. Этот метод позволяет лучше понять механизмы транскрипционной регуляции целевых ядерных факторов.

Introduction

Белок-белковые взаимодействия играют важную роль во многих биологических функций. Таким образом, эти взаимодействия участвуют в сигнальной трансдукции; транспортирование белка через клеточные мембраны; клеточный метаболизм; и несколько ядерных процессов, включая репликацию ДНК, ремонт повреждений ДНК, рекомбинации и транскрипции ^{1, 2, 3, 4.} Идентификация белков, участвующих в этих взаимодействиях Поэтому крайне важно, чтобы углубления нашего понимания этих клеточных процессов.

Иммунопреципитации (IP) является утвержденным метод, используемый для анализа белок-белковых взаимодействий. Для того , чтобы облегчить идентификацию коинтегри- иммунопреципитации белков, масс - спектрометрия часто используется ^{5, 6, 7, 8,9.} Нацеливаясь известный член белкового комплекса с антителом, можно выделить белковый комплекс и впоследствии определить его неизвестные компоненты с помощью масс-спектрометрического анализа. ARIP4 (андроген рецептор-взаимодействующий 4), транскрипционный coregulator, взаимодействует с белками ядерных рецепторов, чтобы активировать или репрессировать своих целевых промоторов в контекстно-зависимой манере ^{9, 10.} Для того, чтобы лучше понять транскрипционные регуляторные механизмы, регулирующие эти ядерные факторы, мы описываем комплексный метод для очистки и идентификации ARIP4 взаимодействующих белков, используя систему LC-MS / MS.

Protocol

1. Трансфекция

1. Семенной клеток НЕК293 в культуральные планшеты 100-мм (2 х 10 ⁶ клеток / чашку). Культуры клеток в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ед / мл пенициллина. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 5% CO ₂ и 37 ° С.
2. На следующий день трансфекции клеток с 10 мкг FLAG-меченый ARIP4 плазмиды с использованием 40 мкл реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя ^11.

2. Белок экстракции

1. Около 36 ч после трансфекции, промыть клетки с ледяным PBS и урожай клеток с помощью скребка. Передача клеток в 1,5 mltube и центрифугируйте при 8000 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5х объем гранул 0,4 М KCl буфера (буфер с высоким содержанием соли: 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,4 М KCl,, 5 мМ MgCl _2, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 10 мМ B-mercaptethanol, 1x ингибитор протеазы коктейль). Поворотом смесь в течение 20 мин при 4 ° С.
2. Центрифуга трубки на 17700 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
3. Передача супернатант (поклеточного экстракт) на новую 2-мл пробирку и добавляют 3 - кратный начальный объем 0 М KCl буфера (Буфер для разведения: 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 5 мМ MgCl _2, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 1x ингибитор протеазы коктейль).
4. Выполните еще один центрифугировани (17700 х г в течение 10 мин при 4 ° С) и передать надосадочной жидкости (экстракта цельных клеток) в новую 2 мл пробирку.

3. иммунопреципитация

1. Во время центрифугирования (2.4), моют 50 мкл анти-FLAG бусинок с PBS, 0,1 М глицин-гидрохлорида, а затем 1 М Трис-гидрохлорида, с последующим промыванием дважды с помощью 0,1М KCl буфера (низкосолевой буфер: 20 мМ трис HCl (рН 8,0), 0,1 м KCl, 5 мМ MgCl2, 10% глицерина, 0,1% NP-40, 10 мМ б-меркаптоэтанол, 1x ингибитор протеазы коктейль). Центрифугирование для этого в процессе промывки проводят при 2000 х г в течение 1 мин при температуре 4 ° С.
2. Смешайте 50 мкл FLAG бусинок с экстрактами целых клеток и осторожно повернуть смесь в течение 4 ч при температуре 2-4 ° С (1% экстракта цельноклеточной со стадии 2.4, также следует хранить при -80 ° С для последующего использования в качестве входных данных).
3. Передача образца в микро ротационную колонку (сила тяжести капли). Держите Проточный в 1,5 мл пробирку, заморозить ее с помощью жидкого азота, и хранить его при температуре -80 ° С (проверьте уровни белка обоих входных и проточные, используя Вестерн-блот-анализ).
4. Добавить 1 мл 0,1 М KCl буфера (буфера с низким содержанием соли), чтобы вымыть флаге шарики (сила тяжести капли).
5. Повторите шаг 3.4 по крайней мере, еще четыре раза (в общей сложности пять стирок).

4. Элюирование

1. Поместите колонку в 1,5 мл пробирку и центрифугируют ее при 2000 х г в течение 1 мин; шарики высохнут.
2. Закрывают дноколонка.
3. Добавить 50 мкл (равный объему флаговых гранул) 0,1 М глицин-HCl (рН 2,5).
4. Слегка встряхните смесь в течение 10 мин при комнатной температуре.
5. Поместите колонку в новую 1,5 мл пробирку и центрифугируют ее при 2000 х г в течение 1 мин.
6. Элюированные раствор нейтрализуют 10 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0); хорошо перемешать с помощью пипетки или с помощью вихревой машины.

5. Алкилирование и трипсином

1. Добавляют 50 мкл 100 мМ NH ₄ HCO _3, 10 мкл CH ₃ CN, и 2 мкл дитиотреитола к смеси (112 мкл общего объема).
2. Инкубируйте образца в течение 30 мин при 56 ° C.
3. Поместите образец при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Добавляют 10 мкл 333 мМ иодацетамида к образцу и инкубировать в темноте в течение 30 мин при 37 ° С.
5. Добавьте 10 мкл трипсина (33 нг / мкл) в смеси и инкубировать ее в течение ночи при 37 ° С.

6. ЖХ-МС / МС-анализа

1. После ночи трипсином, транспортировки готового продукта к LC-MS / MS объекта или сторонних масс - спектрометрического лаборатории для анализа ^12.

Results

Мы определили сильный ARIP4 сигнал, около 160 кДа, а также те из макете контроля образца и ряда других неизвестных белков (рисунок 1). Анализ ЖХ-МС / МС идентифицировали обе ARIP4 сложные пептиды , и потенциальные пептидные кофакторов внутри фракции флаговых шариков (таблица 1). P62 (Sequestosome1), известный ARIP4 кофактором ¹¹ был идентифицирован в анализе (таблица 1), что подтверждает эффективность этой системы...

Discussion

Эффективное трансфекция имеет важное значение для получения успешного результата с этим протоколом. Соответственно, мы рекомендуем использовать вестерн-блот анализ для определения Иммунопреципитированные FLAG-меченого уровни белка. Этот шаг позволяет пользователям проверить, что их интерес белок правильно гиперэкспрессия и, кроме того, что IP была выполнена успешно. FLAG-меченый уровни белка также должны быть проверены до масс-спектрометрического анализа.

Макет образец должен быть использова...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Липофектамин 2000 Реагент для трансфекции	Thermo Fisher Scientific	11668019
Коктейль ингибиторов протеазы (без ЭДТА) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Колонки	BIO-RAD	732-6204