Мы представляем метод выделения и культуры мыши Вольфианская канала (WD). Мы также продемонстрировать подробную процедуру для всей горы иммунным культивируемых / свежеизолированных WDs с флуоресцентно мечеными антителами. Вместе эти методы позволяют исследование развития WD, скручивании и дифференциации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трубное морфогенез является фундаментальным требованием для развития большинства органов млекопитающих, в том числе мужской репродуктивной системы. Придатка, неотъемлемая часть мужского репродуктивного тракта, отвечает за хранение спермы, созревания и транспорта. Взрослый придатка является очень гибкой трубкой, которая развивается от простого и прямого эмбрионального предшественника, известного как Вольфианская канала (WD). Правильная намотка придатка имеет важное значение для мужской фертильности, так как сперма в яичках не могут оплодотворить яйцеклетку. Тем не менее, механизм, ответственный за развитие придатка и скручивании остается неясным, частично из-за отсутствия всей культуры органов и визуализации методов. В данном исследовании мы опишем систему в пробирке культуру и весь протокол иммунофлюоресценции монтирования лучше визуализировать процесс WD навивки и развития, которые также могут быть применены для изучения других трубчатых органов.
Введение
Мужской репродуктивной системы, прежде всего, состоит из семенников, сайт для развития зародышевых клеток и дифференцировки, а также сложной системы протоковой, которая требуется для созревания, транспортировки и хранения спермы. Придатка представляет собой трубчатый орган , который соединяет яичко с семяпровода и в основном участвуют в пост-тестикулярной развития и созревания половых клеток 1. Высоко свернутых придатки взрослых мышей развивается от простого и прямого предшественника трубы, Вольфианская канала (WD) 1. Сложная и обмотанный структура придатка имеет важное значение для спермы , чтобы приобрести способность к оплодотворению женских ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за животными и экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами Animal Care и комитетом по этике Университета Ньюкасла и подтвердил в Закон о Новом Южном Уэльсе животных исследований, Новый Южный Уэльс животных исследовательского регулирования, а также австралийский код для ухода и использование животных в научных целях. Все процедуры, проведенные на мышах были одобрены Animal Care и комитетом по этике Университета Ньюкасла.
1. Время Спаривание
- Пара 6 - 8 недель мужские и женские мышей незадолго до конца дневного цикла.
- Проверьте самок на наличие вагинальных пробок рано утром (и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В процессе развития, WD претерпевает значительные изменения, в котором простая и прямая трубка превращается в очень сложной и обмотанный воздуховод. С помощью методов, описанных выше, WDs подвергаются подобному преобразованию в условиях культивирования. Здесь мы показали результаты из WDs культивировали в течение 3 дней (Рисунок 3). Рассекать молекулярных механизмов, участвующих в WD формообразования, питательная среда может быть дополнена с ингибиторами и активаторами, предназначенных для различных сиг.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Система культуры орган имеет много преимуществ по сравнению с традиционной системой клеточной культуры. Эта система сохраняет первоначальные структурные отношения и взаимодействия между различными типами клеток. Он имитирует в естественных условиях систем и дает более точную информацию , чем исследования клеточных культур , где фактор ниша отсутствует. Использование систем органной культуры даже имеют преимущества по сравнению с использованием целого животного. Они включают в себя более высокую стоимость исполь.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить членов группы онкологической гинекологии для критического чтения этой рукописи. Эта работа частично поддержана финансирование из Медицинского исследовательского совета Научно-исследовательского совета Австралийского национального здравоохранения и, и онкологического института NSW (PST). МК является получателем университета Ньюкасла постдипломного проведение исследовательских работ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 24-луночные планшеты | Corning, США | 3524 | можно приобрести у других продавцов |
| Hank' s Сбалансированный солевой раствор (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, США | SH30031.02 | можно приобрести у других поставщиков |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle: Питательная смесь F-12 (DMEM/F12) | Sigma, США | D8437 | Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Interpath, Австралия | SH30034,02 | 10% FBS используется в культуральной среде |
| L-глутамин | GE Healthcare Life Sciences, США | SH30034,01 | 1% концентрация используется |
| Пенициллин/стрептомицин | Gibco, США | 15070-063 | 1% концентрация используется |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Ватман, США | 110409 | мембрана (0,8 &; m) |
| IWR1 | Sigma, США | 10161-5мг | 100 &микро; Концентрация M используется |
| Параформальдегид (PFA) | Electron Microscopy Sciences, США | 15710 | 16% акций, 4% в PBS для использования. ТОКСИЧНЫЙ - надевайте перчатки и не < бр/> выбрасывать в раковину |
| Этанол | Thermo Scientific Fisher, США | 214-20л PL | Absolute, составьте 25, 50 и 75% с milliQ водой. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, США | 2509-500мл | Очень вязкий, осторожный при дозировании |
| Triton X-100 | Sigma, США | T8787-50мл | Очень вязкий, осторожный при дозировании |
| ди-натрия гидрофосфата | Thermo Scientific Fisher, США | 621-500мг | можно приобрести у других продавцов |
| Дигидрофосфат | натрия Ajax Finechem, США | 4745-500г | можно приобрести у других производителей |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, США | 465-500г | можно приобрести у других производителей |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, США (DHSB) | TROMA-I | 1:250 в блокирующем буфере |
| active β Катенин | Технология сотовой сигнализации, США | D13A1 | 1:200 в блокирующем буфере |
| фосфо-гистоне 3 | Millipore, MA, США | 06-570 | 1:200 в блокирующем буфере |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, США | 111-545-047 | 1:250 в блокирующем буфере |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, США | 112-585-072 | 1:250 в блокирующем буфере |
| Глицерин | Thermo Fisher Scientific, США | 242-500мл | можно приобрести у других продавцов |
| n-Пропилгалат | Sigma, США | 2370-2 | |
| -(4-амидинофенил)-1H -индол-6-карбоксамидин (DAPI) | Sigma, США | D9564-10mg | Использование для окрашивания нуклеиновых кислот (ДНК) |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Thermo Fisher Scientific, США | 2225-500 мл | |
| Защитные колпачки для растворителей (24 x 50 мм) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Ссылки
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
