Мы представляем метод выделения и культуры мыши Вольфианская канала (WD). Мы также продемонстрировать подробную процедуру для всей горы иммунным культивируемых / свежеизолированных WDs с флуоресцентно мечеными антителами. Вместе эти методы позволяют исследование развития WD, скручивании и дифференциации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трубное морфогенез является фундаментальным требованием для развития большинства органов млекопитающих, в том числе мужской репродуктивной системы. Придатка, неотъемлемая часть мужского репродуктивного тракта, отвечает за хранение спермы, созревания и транспорта. Взрослый придатка является очень гибкой трубкой, которая развивается от простого и прямого эмбрионального предшественника, известного как Вольфианская канала (WD). Правильная намотка придатка имеет важное значение для мужской фертильности, так как сперма в яичках не могут оплодотворить яйцеклетку. Тем не менее, механизм, ответственный за развитие придатка и скручивании остается неясным, частично из-за отсутствия всей культуры органов и визуализации методов. В данном исследовании мы опишем систему в пробирке культуру и весь протокол иммунофлюоресценции монтирования лучше визуализировать процесс WD навивки и развития, которые также могут быть применены для изучения других трубчатых органов.
Введение
Мужской репродуктивной системы, прежде всего, состоит из семенников, сайт для развития зародышевых клеток и дифференцировки, а также сложной системы протоковой, которая требуется для созревания, транспортировки и хранения спермы. Придатка представляет собой трубчатый орган , который соединяет яичко с семяпровода и в основном участвуют в пост-тестикулярной развития и созревания половых клеток 1. Высоко свернутых придатки взрослых мышей развивается от простого и прямого предшественника трубы, Вольфианская канала (WD) 1. Сложная и обмотанный структура придатка имеет важное значение для спермы , чтобы приобрести способность к оплодотворению женских половых клеток 2. Как такой важный орган для мужской фертильности развивается и получает в форме не очень хорошо понял. Различные сигнальные пути , как было показано, участвуют в развитии WD , таких как сигнального пути Wnt 3,4 и андрогена пути 5 сигнализации. Наша недавняя работа установила требование БАЛсский Wnt сигнализации для WD навивки во время внутриутробного развития 4. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять механизмы, участвующие в послеродовом придатка навивки, клеточной дифференцировки, а также от клетки к клетке связи внутри придатка эпителия и интерстициальных клеток.
Генетически модифицированные мышиные модели были доказаны , чтобы быть мощным инструментом для идентификации / проверки молекулярных механизмов , лежащих в основе развития и заболевания различных органов и систем 6. Несмотря на широкое использование, существуют значительные ограничения генетически модифицированных моделей мышей, в том числе непредсказуемого фенотипа целевых мутантов мыши с относительно предполагаемой функции гена, и не фенотипа у нулевых мутантов в некоторых моделях, влияние генетических и экологических факторов, трудоемкие и трудоемкий процесс разработки моделей мыши. Таким образом, интерпретация значимости полученных результатов только с использованием генетически модифицированныйспециалисты - мышиные модели не всегда просто 6. Эти ограничения могут быть преодолены путем использования в системе культуры пробирке орган , который дает нам возможность манипулировать несколько сигнальных путей в режиме реального времени в контролируемых условиях культивирования. Система органной культуры играет важную роль в понимании физиологии и патологии целых органов 7. Кроме того, визуализация целых органов , окрашенных с флуорофором меченых антител позволяет визуализировать маркеры , представляющие интерес в трехмерном контексте, как она существует в естественных условиях, обеспечивая тем самым лучшее понимание формы этого органа, структуры и функции 8.
Здесь мы описали методы для выделения мышиных эмбриональных гонад гребней, культуры в пробирке и всей горе иммунофлюоресценции визуализации WDs, которые могут быть применены , чтобы ответить на различные вопросы , касающиеся морфогенеза трубчатых органов , таких как WDs. В этом протоколе, мыизолированных мышиных эмбриональных урогенитальные гребни с 15,5 дней после коитуса (DPC) беременных дамб и культивировали их в течение 3 дней с последующим иммунным для эпителиального клеточного маркера (цитокератин 8, CK8), маркера пролиферации клеток (фосфо-гистона 3, PH3) и активным βcatenin.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за животными и экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами Animal Care и комитетом по этике Университета Ньюкасла и подтвердил в Закон о Новом Южном Уэльсе животных исследований, Новый Южный Уэльс животных исследовательского регулирования, а также австралийский код для ухода и использование животных в научных целях. Все процедуры, проведенные на мышах были одобрены Animal Care и комитетом по этике Университета Ньюкасла.
1. Время Спаривание
- Пара 6 - 8 недель мужские и женские мышей незадолго до конца дневного цикла.
- Проверьте самок на наличие вагинальных пробок рано утром (или до 8:00 утра), каждый день. День пробки рассматривается как 0,5 ДПЗ.
- Перенести женщина с вагинальным пробкой в новую клетку (без мужского пола) и маркировать дату пробки.
2. Выделение мышиных эмбриональных гонадная хребтами
- Изолировать мыши эмбрионаIC гонад гребни от 15,5 DPC беременных самок , как описано в 9, с некоторыми изменениями , как описано ниже.
- Провести рассечение до полудня, как время беременные женщины считаются войти в следующий день беременности во второй половине дня.
- Жертвоприношение 15,5 DPC беременных самок с помощью цервикальной дислокации (или в соответствии с утвержденным протоколом институционального комитета по этике животного происхождения).
- Держите мышь на спине на бумаге впитывающей ткани и спрей вентральной стороне живота с 70% этанола.
- Поднимите нижнюю кожи живота (брюшная сторона) с пинцетом и сделать боковой надрез с помощью хирургических ножниц, простирающейся от урогенитального отверстия до конца к грудной клетке. Потяните кожу в сторону головы животного, чтобы обнажить живот.
- Вырезать мышцы живота с хирургическими ножницами, чтобы разоблачить брюшной полости. Возьмите Gravid матки с щипцами непосредственно над шейкой матки и сделать разрез. Теперь поднимите матка, держась за то мочевого пузыря и сокращение матки широкой связки с последующим надрезы на uterotubal переходах, чтобы отделить матку от перитонеального привязанности.
- Перенести матка в трубку 50 мл, содержащий ледяной HBSS (Hank сбалансированный солевой раствор). Промыть беременной маткой осторожно ледяной HBSS, чтобы удалить лишнюю кровь.
- Держите матку в чашку Петри, содержащую ледяную HBSS и держать на льду. Обрежьте стенки матки и вынимают эмбрионов. Держите эмбрионов в свежей чашке Петри с HBSS на льду.
- Возьмите чистую бумагу стерильной салфеткой и поставить его на новый Петри. Спрей 70% этанола на папиросную бумагу. Держите эмбрионов на этой бумаге ткани на боковой стороне и вырезать его из нижней части живота с помощью стерильного лезвия в направлении , как показано пунктирной линией на рисунке 1.
- Закрепить эмбриона на стерильной губки основания, закрепив позвоночный столб.
- Поместите его под рассекает стереомикроскопа и аккуратно разрезают вдоль вентральной срединной линии, Удалить печень и кишечник. Система мыши урогенитальный (почек, мочеточников, семенников, WD и семяпровода) теперь должны быть видны.
- Вырежьте семенника и WD, и держать в свежую чашку Петри с HBSS, на льду. Для того, чтобы вынуть WD и семенников, нарезать семяпровода близко к ее прикрепления к уретре и перерезал крепление нижней части WD от рулька.
- Бассейн семенники и WDs из эмбрионов одной и той же группы (эта цифра может меняться в соответствии с экспериментальным планом).
3. Культура эмбриональной гонадной хребтами (Рисунок 2)
- Готовят среду для культивирования эмбриональных гонадных гребни, дополнив DMEM / F12 с добавлением 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки), 1% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глутамина. Нагреть носитель до 37 ° С в водяной бане.
- Добавьте 300 мкл среды на лунку 24-луночный культуральный планшет.
- Возьмите свежую чашку Петри и положить небольшую каплю стерильного HBSS на нем. Поместите поликарбонатную мембрану травления (0,881; м) на этой капле HBSS с его светя поверхностью, обращенной к HBSS.
- Использование чистых щипцов положить два WDs и гонады на мембране (на ее шероховатой поверхности, обращенной вверх) и снимите максимальное количество HBSS с использованием стерильных салфеток / фильтровальной бумаги. Не прикасайтесь к ткани с впитывающей бумагой; в противном случае это приведет к повреждению ткани.
- Убедитесь в том, что ни WDs, ни гонады соприкасаются друг с другом. В противном случае, они будут держаться вместе во время последующей инкубации.
- Перенесите мембрану с тканями в лунку 24-луночного планшета, содержащую 300 мкл культуральной среды и культуры их на воздушной среды интерфейс. Слишком много культуральной среды на мембраны приводит к кистозной роста WDs.
- Инкубируйте планшет при 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% СО 2.
- Изменение культуральной среды каждый день. Для изменения среды с помощью пипетки, удалите среду из скважины сначала и затем добавить 300 мкл подогретой свежей среды.
Заметка:Для изучения влияния различных сигнальных путей на WD морфогенеза, химические активаторы и / или ингибиторы при требуемой концентрации могут быть добавлены в культуральную среду. - Культура ткани в течение 3 дней. В течение 3 дней, разворачивают WDs , собранные из 15,5 DPC эмбриона превращаются в весьма запутанные трубок (рис 3б). Добавление ингибитора Wnt, IWR1, приводит к торможению WD навивки (рис 3C).
- Для сбора урожая эти ткани взять чашку Петри с ледяной PBS. Перенесите мембрану с культивируемых гонадах и WD в чашку Петри. Мембрана будет плавать на PBS. Нажмите мембрану, чтобы потопить его в PBS и вынимают гонады и WD.
- Закрепить ткани 4% параформальдегида (PFA) O / N при 4 ° С или в течение 1 ч при комнатной температуре. В случае необходимости, принимать яркие полевые образы WDs перед тем фиксации.
4. Всего горе Иммунофлуоресценции
- Промывают фиксированные ткани 3x с PBS-T (PBS + 1%Тритон Х-100) с медленным качанием, 10 мин каждый, при комнатной температуре.
- Обезвоживает ткани в градуированных серии этаноле (25%, 50%, 75% и 100%), 10 мин каждый, при 4 ° С, с медленным качалке (~ 30 оборотов в минуту). На этом этапе, ткани могут храниться при температуре 4 ° С в 75% этаноле.
- Чтобы изменить этанол, держать ткани нетронутыми в течение 2 мин и пусть ткани осесть. Достаньте как можно больше супернатант насколько это возможно, а затем добавить следующую более высокую концентрацию этанола. Во избежание повреждения тканей, кончик пипетки не должен касаться ткани на любой стадии.
- После обезвоживания, регидратацию тканей в серии градуированных этанола (100%, 75%, 50% и 25%), 10 мин каждый, при 4 ° С, с медленным качанием.
- Промыть тканей с PBS-T (PBS + 0,1% Тритон Х-100), 4x, 20 мин каждый, при комнатной температуре при осторожном качалке (~ 30 оборотов в минуту).
- Блок ткани в течение 1 ч при комнатной температуре блокирующим буфером (PBS + 1% БСА + 0,2% обезжиренного сухого молока порошок + 0,3% Тритон Х-100).
- AfteR блокирование, передача тканей к раствору первичного антитела (разбавленный в блокирующем буфере) и инкубировать O / N при температуре 4 ° С при осторожном качалке (~ 30 оборотов в минуту). Разведения первичных антител описаны в таблице материалов.
- На следующий день, мыть ткани с PBS-MT (PBS + 2% обезжиренного порошка сухого молока + 0,5% твин-20), 4x, 30 мин каждый, при комнатной температуре, с нежным качалке (~ 30 оборотов в минуту).
- После этого этапа промывки, добавляют вторичные антитела в разведении 1: 250 (этот шаг нуждается в оптимизации для отдельных антител) в блокирующем буфере и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном покачиванием.
- Отныне держать ткани, покрытые алюминиевой фольгой для предотвращения воздействия света, как вторичные антитела метили светочувствительных флуорофоров.
- Мытье ткани в 3 раза с PBS-T (PBS + 0,1% твин-20), 30 мин каждый, с нежным покачиванием.
- Подготовка слайдов для монтажа окрашенных тканей.
- Для этого, вырезать стекло крышка слипына тонкие полоски с алмазной ручкой и наклеить две полоски друг над другом на предметном стекле с использованием эмали для ногтей. Сделайте две границы и место тканей между этими двумя границами.
- Добавить DAPI, содержащий монтажную среду и положить на крышку скольжения. Нанесите лак эмаль по углам покровного стекла, чтобы прикрепить его к слайду.
Примечание: Тканей теперь готовы к визуализации. Храните эти слайды при -20 ° С.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В процессе развития, WD претерпевает значительные изменения, в котором простая и прямая трубка превращается в очень сложной и обмотанный воздуховод. С помощью методов, описанных выше, WDs подвергаются подобному преобразованию в условиях культивирования. Здесь мы показали результаты из WDs культивировали в течение 3 дней (Рисунок 3). Рассекать молекулярных механизмов, участвующих в WD формообразования, питательная среда может быть дополнена с ингибиторами и активаторами, предназначенных для различных сиг...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Система культуры орган имеет много преимуществ по сравнению с традиционной системой клеточной культуры. Эта система сохраняет первоначальные структурные отношения и взаимодействия между различными типами клеток. Он имитирует в естественных условиях систем и дает более точную информацию , чем исследования клеточных культур , где фактор ниша отсутствует. Использование систем органной культуры даже имеют преимущества по сравнению с использованием целого животного. Они включают в себя более высокую стоимость исполь...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить членов группы онкологической гинекологии для критического чтения этой рукописи. Эта работа частично поддержана финансирование из Медицинского исследовательского совета Научно-исследовательского совета Австралийского национального здравоохранения и, и онкологического института NSW (PST). МК является получателем университета Ньюкасла постдипломного проведение исследовательских работ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 24-луночные планшеты | Corning, США | 3524 | можно приобрести у других продавцов |
| Hank' s Сбалансированный солевой раствор (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, США | SH30031.02 | можно приобрести у других поставщиков |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle: Питательная смесь F-12 (DMEM/F12) | Sigma, США | D8437 | Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Interpath, Австралия | SH30034,02 | 10% FBS используется в культуральной среде |
| L-глутамин | GE Healthcare Life Sciences, США | SH30034,01 | 1% концентрация используется |
| Пенициллин/стрептомицин | Gibco, США | 15070-063 | 1% концентрация используется |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Ватман, США | 110409 | мембрана (0,8 &; m) |
| IWR1 | Sigma, США | 10161-5мг | 100 &микро; Концентрация M используется |
| Параформальдегид (PFA) | Electron Microscopy Sciences, США | 15710 | 16% акций, 4% в PBS для использования. ТОКСИЧНЫЙ - надевайте перчатки и не < бр/> выбрасывать в раковину |
| Этанол | Thermo Scientific Fisher, США | 214-20л PL | Absolute, составьте 25, 50 и 75% с milliQ водой. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, США | 2509-500мл | Очень вязкий, осторожный при дозировании |
| Triton X-100 | Sigma, США | T8787-50мл | Очень вязкий, осторожный при дозировании |
| ди-натрия гидрофосфата | Thermo Scientific Fisher, США | 621-500мг | можно приобрести у других продавцов |
| Дигидрофосфат | натрия Ajax Finechem, США | 4745-500г | можно приобрести у других производителей |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, США | 465-500г | можно приобрести у других производителей |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, США (DHSB) | TROMA-I | 1:250 в блокирующем буфере |
| active β Катенин | Технология сотовой сигнализации, США | D13A1 | 1:200 в блокирующем буфере |
| фосфо-гистоне 3 | Millipore, MA, США | 06-570 | 1:200 в блокирующем буфере |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, США | 111-545-047 | 1:250 в блокирующем буфере |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, США | 112-585-072 | 1:250 в блокирующем буфере |
| Глицерин | Thermo Fisher Scientific, США | 242-500мл | можно приобрести у других продавцов |
| n-Пропилгалат | Sigma, США | 2370-2 | |
| -(4-амидинофенил)-1H -индол-6-карбоксамидин (DAPI) | Sigma, США | D9564-10mg | Использование для окрашивания нуклеиновых кислот (ДНК) |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Thermo Fisher Scientific, США | 2225-500 мл | |
| Защитные колпачки для растворителей (24 x 50 мм) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Ссылки
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343(2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
