Методическая статья

Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55157

⸱

19 января 2017 г.

 ,  ,  , 
1Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, IMRIC, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Core Research Facility, IMRIC, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем здесь относительно быстрый и простой подход к картированию времени репликации всего генома млекопитающих, от выделения клеток до базового анализа результатов секвенирования. В соответствии с протоколом будет предоставлена геномная карта репрезентативной программы репликации.

Аннотация

Репликация генома происходит во время S-фазе клеточного цикла в сильно регулируемом процессе, который обеспечивает точность дублирования ДНК. Каждый геномная область реплицируется в отдельное время во время фазы S через одновременной активации нескольких начала репликации. Время репликации (ПКВ) коррелирует со многими геномных и эпигенетических особенностей и связан с частоты мутаций и рака. Осмысливая полную геномную вид программы репликации, в здоровье и болезни является одной из основных целей будущего и вызов.

В данной статье подробно описывается "Copy Number Коэффициент S / G1 для отображения геномную времени репликации" метод (в данном документе под названием: CNR-TOR), простой подход к карте генома широкий ToR клеток млекопитающих. Метод основан на количестве копий различий между S фазы клеток и фазы G1 клеток. Метод CNR-TOR выполняется в 6 этапов: 1. Подготовка клеток и окрашивание пропидиума йодида (PI); 2. Сортин G1 и фазы S клетки с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS); 3. Очистка ДНК; 4. Ультразвуком; 5. Подготовка библиотеки и последовательности; и 6. Биоинформатический анализ. Метод CNR-TOR является быстрый и простой подход, который приводит к репликации подробных карт.

Введение

Млекопитающим репликации ДНК жестко регулируется, чтобы обеспечить точную репликацию каждой хромосомы только один раз в течение клеточного цикла. Репликация происходит в соответствии с жестко регламентированной порядке - несколько больших геномных областей (~ Мб) реплицировать в начале фазы S (начало репликации доменов) , тогда как другие геномные области репликации позже в средней или поздней фазе S (средние и поздние реплицирующихся доменов) 1. Большая часть генома реплицируются в то же время во всех тканях (конститутивные домены ПКВ), в то время как 30% - 50% генома, меняет свое техническое задание между тканями 2, во время дифференцировки 3, 4 , и в меньшей степени , также во время раковой трансформации 5 , Кроме того, некоторые геномные области репликации в асинхронном режиме 6, 7, 8, а именно есть разницав ПКВ между двумя аллелями.

ToR коррелирует со многими геномных и эпигеномном функций , включая уровни транскрипции, содержание GC, хроматина состояние, плотность генов и т.д. 1, 9. ToR также связан с частоты мутаций и типов 10, 11 и , следовательно , неудивительно, что возмущения программы репликации связаны с раком 12, 13. Причинно-следственная связь между ПКВ и структуры хроматина пока не понял. Вполне возможно, что открытая хроматина способствует раннему репликации. Тем не менее, альтернативная модель предполагает , что хроматин собирается во время репликации и различные регуляторы хроматина , присутствующие в начале и в конце S фазы приводят к дифференциальной упаковки ранних и поздних воспроизводящихся областей 1, 14 . Недавно мы показали , что формирует техническое задание содержание GC, влияя на тип мутаций , которые происходят в различных геномных областей 11.

Флуоресцентная гибридизация (FISH) в основной метод для измерения ПКВ на отдельных локусов. Она осуществляется просто путем подсчета процента клеток фазы S , которые обладают одной рыбы сигналы vs. процент дублетов для заданного аллель 15, 16. Альтернативный способ, состоит из последовательностей импульсов мечения ДНК , с помощью BrdU, сортировка клеток в соответствии с их содержанием ДНК в различные моменты времени по S, иммунопреципитации ДНК , содержащей BrdU, и проверять обилие осажденной ДНК с кПЦР 17.

Геномные отображение ТЗ может быть достигнуто двумя способами. Первый способ представляет собой геномную вариант метода, основанного BrdU-IP описанный выше, в котором количественное определение суммыосажденной ДНК в каждой фракции осуществляется одновременно в течение всего генома путем гибридизации с микрочипов или глубокой последовательности. Второй метод, CNR-ToR, основан на измерении числа копий каждой геномной области фазовых клеток S и нормализацию по содержанию ДНК в G1 клетках. В этом способе клетки сортируются по FACS в не-тиражирование (G1 фаза) и тиражирование (фаза S) группы (рисунок 1). Клетки в G1 имеют один и тот же номер копии всех геномных областей и, следовательно, их содержание ДНК должно быть одинаковым. С другой стороны, ДНК, число копий в S зависит от технического задания, так как ранние регионы Дублирование подверглись репликации в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК удваивается, в то время как поздние регионы Дублирование еще не реплицируются в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК будет быть похож на G1 клеток. Следовательно, S соотношение G1 содержания ДНК свидетельствует о ПКВ. Количество ДНК для каждой области генома измеряется либо путем гибридизациимикрочипов или глубокой последовательности 2, 8. будут дополнительно обсуждены преимущества метода CNR-TOR.

В данной статье описывается метод CNR-TOR для геномного картирования ToR , как описано на рисунке 2. В статье рассматриваются мелкие детали всего процесса от момента сбора клеток до базового анализа результатов и создания геномных ToR карт. Протокол, описанный в этой статье была успешно выполнена на различных типах клеток, выращенных в культуре. Дальнейшее совершенствование этого протокола может привести к отображению ПКВ в естественных условиях и в редких типов клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: TOR может быть измерена только на растущих, несинхронизированных клетках. Эта процедура должна начинаться с по крайней мере , 1 - 2 х 10 6 быстро растущих клеток, которые обычно приводят к ~ 1 × 10 5 клеток в фазе S (шаг ограничение скорости). Рекомендуется проводить каждый эксперимент с использованием двух или трех повторах. Весь процесс CNR-TOR может быть завершена в течение одной недели - через два дня должен быть посвящен всем шагам до подготовки библиотеки, от одного до двух дней, необходимых для секвенирования и дополнительный день необходимо для первоначального анализа данных.

1. Сбор клеток из культуры

Примечание: Протокол написан для клеток , растущих в культуре в 10 см пластинах (содержащих примерно 2 - 5 × 10 6 клеток), но может быть легко отрегулирована на другие платформы.

  1. Для клеток, выращенных в суспензии, перейти к фиксации (раздел 2).
  2. Для прилипшие клетки, аспирация и мыть плел с 3 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+.
  3. Выбросите PBS и инкубируют клетки в течение 5 мин при 37 ° С в 1 мл трипсина-коммерческого ЭДТА, пока клетки отделяться.
    Примечание: Продолжительность обработки трипсином должна быть отрегулирована для каждого типа клеток.
  4. Добавьте 3 мл культуральной носитель для нейтрализации трипсина и собирают клетки в 15 мл коническую пробирку или 5 мл полистирола трубки. Держите на льду.

2. Закрепление

Примечание: В этой части все шаги должны быть сделано при 4 ° С.

  1. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  2. Отберите и мыть клетки дважды 1 мл холодного PBS.
  3. Ресуспендируют клеток в 250 мкл (общий) холодной PBS.
  4. В то время как осторожно встряхивая пробирку, медленно по каплям добавляют 800 мкл 20 ° C 100% этанола. Это приводит к конечной концентрации этанола 70 - 80%.
    Примечание: Высокий этанол чистота рекомендуется на этом этапе.
  5. Инкубируйте клетки на льду Foг 30 мин.
    Примечание: На этом этапе клетки могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или в течение нескольких месяцев при -20 ° C.

3. PI Окрашивание

  1. Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  2. Аспирируйте супернатант тщательно и мыть клетки дважды 1 мл холодного PBS.
  3. Отберите и ресуспендирования каждый образец со следующей смеси: 1 мл PBS, 5 мкл 10 мг / мл РНКазы А, йодид пропидия 50 мкл 1 мг / мл (PI; перемешать флакон перед использованием). Отрегулируйте концентрацию до ~ 2 · 10 6 клеток / мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить света - PI чувствителен к свету.
  4. Фильтруют через 35 мкм меш в 5 мл полистирола трубки и близко парафильмом.
  5. Выдержите при комнатной температуре в темноте в течение 15 - 30 мин.
    Примечание: Клетки теперь готовы для анализа FACS. При необходимости, Окрашенные клетки могут храниться в течение не менее 24 ч при температуре 4 ° С в темноте.

4. Сортировка

  1. Сортировка клеток с использованием машины FACS. НасЕ 561 нм лазер дифференцироваться клетки в зависимости от их интенсивности ПИ. Другие лазеры вблизи максимума возбуждения на 535 нм, как 488 нм или 532 могут использоваться в зависимости от конфигурации FACS машины.
  2. Для получения оптимальных результатов используйте наименьшее сопло рекомендованного для конкретного размера ячейки (для большинства клеток 85 мкм). Приоритетность режимы чистоты по сравнению с выходом. Используйте постоянный медленный поток, как правило, до 300-500 событий / с, при давлении оболочки 45 фунтов на квадратный дюйм.
  3. Использование стробирования, различать мертвые клетки и субклеточных мусора (FCS низкие и высокие SSC), откладывая FCS против SSC. Из жизнеспособных клеток дискриминировать дублеты путем построения графика SSC-Ширина (W) против SSC-высота (H) , а затем FSC-W против FSC-H участка и по PI- W против PI-H (дублеты будет иметь тот же H-значение но больше W-значение). Для получения жизнеспособных одиночных клеток начертить гистограмму интенсивности ПИ-зона (А), которая представляет содержание ДНК в клетках.
  4. Сортировка клеток в фазах G1 и S, как показано на рисунке 1, Gating для S должны быть широкими и вторгаться в G1 и G2 фаз, в то время как G1 стробирования должна быть узкой и как можно дальше от S, насколько это возможно.

figure-protocol-1
Рисунок определение фазы цикла 1. Ячейка на основе интенсивности ПИ. Гистограмма, показывающая распределение содержания клеточной ДНК (измеряется PI-площадь) мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) населения. Содержание ДНК используется для сортировки население на две подгруппы населения I) G1 клетки (содержание 2н ДНК) и II) S фазы клетки (2N - 4N содержание ДНК), используя отмеченные регионы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Примечание: Цель коллекции G1 клеток для учета погрешностей в эффективности между различными секвенирования геномных областей. Альтернативное приложениеРоач является использование G1 клеток, захваченных из того же самого типа клеток. Такой подход дает более чистые результаты (так как это сводит к минимуму загрязнение фазы S), но это может ввести предвзятости, вытекающие из генетических различий между арестованными клеток и измеренных клеток.

  1. Сортировка в холодных условиях и сбора отсортированных клеток в 1,5 / 2 мл пробирки. Хранить трубы на льду следующие сорта.
    Примечание: Для того , чтобы улучшить восстановление ДНК, то лучше использовать низким связыванием трубы или использовать трубы с покрытием с 4 - 5% БСА в течение 1 - 3 ч при 4 ° С 18.

5. ДНК Очистка

  1. Для каждого образца (G1 и S) очищают ДНК с использованием набора для очистки ДНК.
    Примечание: При использовании коммерческого набора, элюции 400 мкл буфера для элюции в 2 мл пробирку для высокого выхода, в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Проверьте концентрацию ДНК с помощью флуорометр.
    Примечание: Из 100000 клеток млекопитающих, собранных FACS, следует получить ~ 1 мкг ДНК.т этот этап ДНК может сохраняться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение длительного хранения.

6. Ультразвуком

  1. Перенос ДНК в 1,7 мл пробирку, который совместим с магнитной подставкой, используемой.
  2. Концентрат ДНК с использованием 2х SPRI бусин в соответствии с инструкциями производителя, используя магнитную стойку, и элюирования в 50 мкл буфера для элюции.
  3. Shear ДНК с сфокусированного ультразвукового дезинтегратора до среднего размера целевого пика 250 пар оснований. Используйте следующие параметры для образца ДНК в 50 мкл: 50 Вт, 20% коэффициент заполнения, 200 циклов в порыве, 20 ° C, 120 сек.
  4. Проверьте размер фрагментированной ДНК с помощью электрофореза. Рекомендуемый размер дистрибутива составляет 200 - 700 пар оснований с максимумом при ~ 250 пар оснований.
    Примечание: На этом этапе ДНК может сохраняться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение длительного хранения.

7. Библиотека Подготовка и секвенирование

Примечание: Многие наборы для подготовки библиотеки и различающиесялор секвенирование платформы должны работать так же, как те, которые используются нами и упомянутые в разделе материалов. На самом деле в прошлом, ToR карты были получены с использованием очень похожий метод с микрочипов платформ 2.

  1. Подготовка библиотеки с использованием любого набора коммерческой подготовки библиотеки.
  2. По окончании подготовки библиотеки, выберите размер с помощью магнитных шариков 300 - 800 пар оснований.
  3. После подготовки библиотек, измерения концентрации ДНК с помощью флуорометр.
  4. Измерьте размер ДНК с помощью электрофореза.
  5. Выполните последовательность на любой платформе.
    Примечание: Секвенирование по меньшей мере, 10 М читает на пробу рекомендуется. Эта глубина эквивалентно прочитанного приблизительно каждые 300 пар оснований (за ~ 3 Гб размер геномов), и является достаточным для измерения ToR при разрешении 50 - 100 кб. Увеличение глубины приведет к уменьшению размера окна и, таким образом, позволит увеличить разрешение с более высокой достоверностью. Соединенный конец последовательности не является необходимым вэтот протокол, поскольку информация только покрытия собирается. Это, однако, может помочь в решении местоположения прочтений, которые содержат повторяющиеся последовательности.

8. Анализ

Примечание: анализ данных на основе метода , используемого А. Корен и соавт. 19.

  1. Карта секвенирования данные соответствующему генома с использованием bowtie2 или из любого надежного чтения короткий выравнивателя. Определить изменения размера, равного охвата хромосомные окна в виде сегментов, охватываемых 200 считывает в G1 фракции и рассчитывать фазы S читает в тех же окнах.
  2. Рассчитать отношение S / G1 для каждого окна. Это должно создать карту с большими колебаниями в соотношении S / G1 вдоль генома (рисунок 3). Хороший контроль за достоверность измерений ToR, чтобы сравнить эту карту с соотношением G1 / G1 (от двух отдельных измерений G1), которая должна быть гораздо более пологой.
  3. Нормализация Данные 0 означают и 1 SD путем вычитания из каждого VALUE среднее значение всех окон (за исключением Х-хромосомы) и разделив результат на стандартное отклонение S / G1 всех окон. Это делается для того, чтобы преобразовать в г баллов и возможность сравнения между различными экспериментами.
  4. Удалите все щелевые участки, перечисленные в геноме браузера УСК, а также каждого оставшегося фрагмента между зазором, содержащего менее 15 окон данных.
  5. Гладкая оставшиеся фрагменты с кубической сглаживающего сплайна через функцию csaps Matlab с параметром 10 - 16 и интерполировать в заданных точках через каждые 100 кб.
    Примечание: Параметры сглаживания и интерполяции должны быть скорректированы на основе глубины данных. Другие подходящие способы и функции сглаживающих существуют и могут быть использованы.
  6. После того, как визуально подтверждения достоверности каждой репликации, объединить все операции чтения и вычислить более глубокий профиль разрешения, выполняя тот же процесс, описанный выше, по этим данным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Типичная карта ToR показана на рисунке 3 для эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). На этом рисунке показано, процесс анализа, так как он показывает как точки, которые являются нормализованное отношение / G1, S для отдельных окон (этап 8.3), а также линии, возникающее в результате сглаживания кубическими и интерполяции (этап 8.5).

Такие карты захвата организации программы репликации, которая представляет собой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CNR-TOR может быть выполнена в принципе на любой эукариотической популяции пролиферирующих клеток , которые могут быть разделены на FACS к S и G1 фазы (обзор Ринда Н. и Гилберта DM 20). Метод, описанный здесь, был скорректирован к клеткам млекопитающих с размером генома ~ 3 Gb, таких как человека и мыши. Небольшие изменения в протоколе CNR-TOR (на стадии подготовки клеток и глубины секвенирования) необходимы для того, чтобы адаптировать его к другим эукариот. Особое внимание следует уделять сбору...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Мы благодарим ория Варди за помощь в создании фигуры. Работа в группе была поддержана Израильского научного фонда (грант № 567/10) и Европейского исследовательского совета Начиная Грант (# 281306).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PBSBI (Биологическая промышленность)02-023-1A
Трипсин-ЭДТАBI (Биологическая промышленность)03-052-1B
15 мл коническая трубкаCorning430790
5 мл Полистирол круглая нижняя трубка с крышкой клеточного фильтра BD-Falcon352235
этанолGadot64-17-5
РНКаза-А 10 мг/млSigmaR4875
Пропидиома йодид 1 мг/млSigmaP4170
ПарапленкаПарапленкаPM-996
1,5 мл ДНК LoBind Eppendorf tubes Eppendorf22431021
BSASigmaA7906
1,7 мл MaxyClear tube Магнитные шарики AxygenMCT-175-C
- Agencourt AMPure XP Beckman CoulterA63881
Ультразвуковой аппаратCovarisM-серии  -530092
50 &m; L microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 ммCovaris520096
Кубит ФлуориметрInvitrogen
Qubit dsDNA Высокочувствительный (HS) Набор для анализаInvitrogenQ32854
Электрофорез 2200 Ленточная станциясистемы AgilentD1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq системаIlluminaSY-415-1001
Набор DNEASY для очистки ДНКQiagen69504
PureProteom Магнитная подставкаMilliporeLSKMAGS08
Anti-BrdU/FITCDAKOF7210
FACS сортировщикBDFACSARIA III
FACS программное обеспечениеBDFACSDiva v 8.0.1

Ссылки

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011(2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319(2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004(2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502(2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400(2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SG1

Похожие статьи