Методическая статья

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55187

⸱

27 июня 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании описаны способы опосредованной T7 совместной экспрессии нескольких генов из одной плазмиды в Escherichia coli с использованием плазмидной системы pMGX.

Аннотация

Совместная экспрессия нескольких белков приобретает все большее значение для синтетической биологии, изучает белково-белковые комплексы и характеризует и использует пути биосинтеза. В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7. Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Здесь набор из четырех связанных векторов, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K и pMGX-hisK, с маркером (A и K), устойчивым к ампициллину или канамицину, и либо обладающим, либо отсутствующим N-концевым гексагистидином Тег (его). Подробные протоколы для построения синтетических оперонов с использованием этой векторной системы предоставляются вместе с соответствующими данными, показывая, что система на основе pMGX, содержащая пять генов, может быть легко сконструирована и использована для получения всех пяти кодированных белков в Escherichia coli . Эта системаEm и протокол позволяют исследователям регулярно выражать сложные многокомпонентные модули и пути в E. coli .

Введение

Совместная экспрессия нескольких белков становится все более существенной, особенно в приложениях для синтетической биологии, где должны быть выражены несколько функциональных модулей 1 ; При изучении белково-белковых комплексов, где экспрессия и функция часто требуют совместного экспрессии 2 , 3 ; И в характеристике и использовании путей биосинтеза, где каждый ген в пути должен быть выражен 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Был разработан ряд систем для совместной экспрессии, особенно в организме хозяина Escherichia coli , рабочей лошади для экспрессии лабораторного рекомбинантного белка 9 . Например, несколько плазмид с различными выбираемыми маркерами могут быть использованы для экспрессии отдельных белков с использованием богатства различных экс Векторы растяжения 10 , 11 . Одиночные плазмидные системы для множественной экспрессии белка использовали либо множественные промоторы для контроля экспрессии каждого гена 10 , 12 ; Синтетические опероны, где множественные гены кодируются на одном транскрипте 2 , 13 ; Или, в некоторых случаях, один ген, кодирующий полипептид, который в конечном счете протеолитически обработан, давая желаемые представляющие интерес белки 14 .

figure-introduction-1
Рисунок 1: рабочий процесс pMGX, показывающий построение полицистронного вектора. Система pMGX обеспечивает гибкую и легкую в использовании стратегию для создания синтетических оперонов под контролем индуцибельного промотора T7.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В этой рукописи описывается использование высокоэффективной системы для построения мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцируемой РНК-полимеразы Т7 ( фиг. 1 ). Эта система позволяет одновременно размножать гены из одной плазмиды. Он основан на плазмидной системе, первоначально называемой pKH22, которая была успешно использована для ряда различных приложений 6 , 7 , 8 . Здесь этот набор плазмид расширяется до четырех связанных векторов: pMGX-A, экспрессирующего вектора, лишенного любых C- или N-концевых тегов, и маркера устойчивости к ампициллину; PMGX-hisA, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к ампициллину; PMGX-K, вектор экспрессии lПодбирая любые C- или N-концевые метки и маркер устойчивости к канамицину; И pMGX-hisK, вектор экспрессии, кодирующий N-концевую гексагистидиновую метку и маркер устойчивости к канамицину. В этом исследовании продемонстрирован способ генерации полицистронного вектора, содержащего пять генов с использованием системы pMGX, в частности pMGX-A, наряду с успешным продуцированием каждого отдельного белка в Escherichia coli .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Получение генов интереса

  1. Дизайн синтетических генов.
    1. Оптимизируйте последовательность генов для экспрессии E. coli .
    2. Удалите любые проблемные сайты рестрикции из последовательности (AvrII, NdeI, EcoRI и XbaI).
    3. Включить сайты рестрикции для клонирования; Рекомендуется сайт 5'-NdeI и сайт 3'-EcoRI. При необходимости можно использовать другие сайты; Относятся к области многоклонирования выбранной плазмиды ( фиг. S1- S4 ). Если необходимо, включите 5 'или 3' кодирующий тег для обнаружения вестерн-блоттинга.
    4. Коммерчески заказывайте сконструированный ген.
    5. Либо тупое клонирование гена в тупой вектор, используя тупой набор клонирования, в соответствии с инструкциями производителя; Проекционные праймеры для амплификации гена (затем перейдите к этапу 1.2.2); Или добавить дополнительные 5 'и 3' концы для прямого клонирования в плазмиду pMGX и перейти к этапу 2. ЗдесьE репрезентативные результаты - от тупого клонирования генов, представляющих интерес.
  2. Амплифицировать желаемый ген (из сконструированного и оптимизированного синтетического гена или из ДНК-матрицы, содержащей нужный ген). 15 .
    1. Дизайн праймеров с сайтами рестрикции для клонирования; Рекомендуется сайт 5'-NdeI и сайт 3'-EcoRI. При необходимости можно использовать другие сайты; Относятся к области многоклонирования выбранной плазмиды ( фиг. S1- S4 ). Если необходимо, укажите либо 5 ', либо 3' кодирующий тег для обнаружения вестерн-блоттинга.
    2. ПЦР амплифицируют нужный ген 15 .
    3. Проанализируйте ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле 16 .
    4. Если существует неспецифическая амплификация, очистите амплифицированный ген путем экстракции гелем. Если нет, используйте набор для очистки фермента.
    5. Количественную оценку ДНК с помощью спектрофотометра путем проверки поглощенияE при 260 нм; Заготовку с буфером для элюирования 17 .

2. Клонирование генов, представляющих интерес, в вектор мультигенной экспрессии, pMGX 18

  1. Ограничение переваривает полученный ген, представляющий интерес, и желаемый вектор, pMGX, с NdeI и EcoRI.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Если получено большое количество рециркулированных плазмид, позвольте реакции NdeI протекать в течение 1 часа перед добавлением EcoRI.
    1. Используйте 40 мкл переварительной реакции, содержащей 0,5-1,5 мкг ДНК и 1 мкл каждого фермента с 4 мкл соответствующего 10-кратного буфера.
    2. Для дайджеста NdeI и EcoRI используйте буфер EcoRI и сначала добавьте эндонуклеазу NdeI. Дайджест в течение 1 ч при 37 ° С. Затем добавьте эндонуклеазу EcoRI и дайте дайджесту продолжить в течение дополнительного часа. NdeI чувствителен к расщеплениям, близким к концу ДНК, поэтому первоначальное переваривание EcoRI может предотвратить эффективное расщепление NdeI.
  2. ЭлектрOphorese рестрикционный дайджест на агарозном геле (для гена 1 kb используют 0,7% агарозный гель при 110 В в течение 55 мин, для выбора процента агарозного геля для разных размеров генов см. Ссылку 16 .
  3. Акцизную вставку и полоски с использованием чистого скальпеля или лезвия бритвы и поместите вырезанный сегмент геля в пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Извлеките ДНК из агарозного геля с использованием набора для экстракции геля в соответствии с протоколом производителя.
  5. Лигируйте интересующий ген в вектор pMGX, используя соотношение 3: 1 вставки в вектор; Установить отрицательную перевязку переваренного pMGX без вставки.
    1. Настроить реакцию лигирования 20 мкл, содержащую 1 мкл ДНК-лигазы Т4, 0,15-0,5 мкг векторной ДНК (~ 5 мкл) и соответствующее количество вставки на основе соотношения вставки к вектору 3: 1 и размера Вставляемый ген; PMGX-магистрали составляют от 5,312 до 5,504 б.п. Включите отрицательную реакцию управления, которая содержит все значения buТ вставляемый ген. Убедитесь, что количество векторной ДНК эквивалентно в отрицательном контрольном лигировании и реакции лигирования вектора плюс вставки.
  6. Трансформировать реакции лигирования в химически компетентные клетки E.coli XL1-Blue и лигированные плазмиды pMGX- yfg1 (содержащий ген, представляющий интерес 1), pMGX- yfg2 (содержащий ген, представляющий интерес 2) ... pMGX- yfgn (содержащий ген, представляющий интерес n). Используйте асептическую технику (внутри шкафа биобезопасности или под пламенем).
    1. Оттереть 100 мкл аликвоты химически компетентной XL1-Blue E. coli на льду в течение 5 мин, а затем добавить 5 мкл реакций лигирования. Инкубируйте 30 минут на льду.
    2. Разогреть клетки в течение 45 с на водяной бане при температуре 42 ° С, а затем добавить 200 мкл холодного LB. Инкубируйте их на льду в течение 2 мин.
    3. Встряхните клетки при 37 ° С, 220 об / мин в течение 1 ч, а затем распределите планшет на 100 мкл на пластине LB-агар, содержащей соответствующий(Ампициллин или канамицин).
  7. Экран клонов для положительных трансформантов.
    1. Сравните количество колоний на отрицательных контрольных и лигирующих пластинах. Требуется коэффициент подсчета колоний более 1: 2. Если на отрицательной контрольной панели имеется большое количество колоний, вернитесь к шагу 2.1 и просмотрите примечание.
    2. Выберите 4-8 отдельных колоний (в зависимости от отрицательного контроля: соотношение лигирования) от каждой реакции лигирования различных генов, вставленных для скрининга (1 n), и заселите 4 мл LB и соответствующую культуру / индивидуальную колонию с антибиотиками в течение ночи. Выращивайте культуры в течение ночи при встряхивании при 37 ° C и 220 об / мин.
    3. Изолируют плазмидную ДНК с использованием набора для выделения плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя.
    4. Настроить 20 мкл NdeI + EcoRI digest-реакции, содержащей 150-500 нг ДНК и 1 мкл каждого фермента с 2 мкл соответствующего 10-бутового буфера. ВЭто случай, добавить NdeI и EcoRI в то же самое время, что интересующий ген будет находиться между сайтами рестрикции. Рекомендуется отрицательный контроль с пустым вектором pMGX. Дайджест в течение 2 ч при 37 ° С на водяной бане.

3. Вставка гена 2 в вектор pMGX, содержащий ген 1, pMGX- yfg1

  1. Редкий дайджест pMGX- yfg1 с AvrII и лечить кишечной фосфатазой теленка (CIP).
    1. Используйте 40 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5-1,5 мкг векторной ДНК (~ 5-10 мкл выделенной ДНК) и 1 мкл AvrII с 4 мкл соответствующего 10-кратного буфера. Дайджест в течение 1,5 ч при 37 ° С, а затем добавляют 1,5 мкл CIP. Оставьте его при 37 ° C еще 30 минут.
  2. Редкий дайджест pMGX- yfg2 с AvrII и XbaI для освобождения интересующего гена.
    1. Использовать 40 мкл переварительной реакции, содержащей 0,5-1,5 мкг ДНК и 1 мк; L каждого фермента с 4 мкл соответствующего 10-буфера. Дайджест в течение 2 ч при 37 ° С.
  3. Электрофоретические рестрикционные переваривания на соответствующем проценте (0,7%) агарозного геля и акциз полостей вставки и вектора с использованием чистого лезвия скальпеля / бритвы (см. Шаги 2.2-2.3).
  4. Извлеките ДНК с использованием набора для экстракции геля в соответствии с протоколом производителя и определите количественно ДНК 17 .
  5. Ligate ген 2 в pMGX- yfg1 с использованием соотношения 3: 1 вставки в вектор. Настройте отрицательное лигирование переваренного pMGX- yfg1 без дополнительной вставки. Настройте, как описано выше на шаге 2.5.
  6. Трансформируйте 5 мкл реакций лигирования в химически компетентные клетки E. coli XL1-Blue, лигированные плазмиды pMGX- yfg1,2 (содержащие ген 1 и 2) и отрицательный контроль pMGX- yfg1 , как показано на этапе 2.6.
  7. Сравните количество колоний на отрицательном контроле и лигирующих пластинах. Коэффициент подсчета колоний gТребуется повторный набор, чем 1: 2. Если на отрицательной контрольной панели имеется большое количество колоний, вернитесь к шагу 3.1 и просмотрите обработку CIP.
  8. Выберите 4-8 отдельных колоний (в зависимости от отрицательного контроля: коэффициент лигирования) от реакции лигирования и инокулируйте 4 мл LB плюс соответствующий антибиотик на каждую колонию и растите в течение ночи при 37 ° C и 220 об / мин.
  9. Изолируют плазмидную ДНК с использованием набора для выделения плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя и количественно определяют ДНК 17 .
  10. Экран эффективного введения второго гена путем выполнения рестрикционного переваривания pMGX- yfg1,2 с помощью EcoRI.
    1. Используйте 20 мкл переварительной реакции, содержащей 150-500 нг ДНК и 1 мкл фермента EcoRI с 2 мкл буфера EcoRI 10x. Дайджест в течение 2 ч при 37 ° С.
  11. Электрофорез - рестрикционный переваривание на соответствующем процентном агарозном геле; Найдите группу, которая соответствуетС размером гена 2 (см. Шаг 2.2). Ген может вставлять в вектор в нежелательной, обращенной ориентации.

4. Добавление третьего гена в вектор pMGX, содержащий гены 1 и 2, pMGX- yfg1,2

  1. Редкий дайджест pMGX- yfg1,2 с AvrII и обработать CIP, как показано на шаге 3.1.
  2. Регрессионный дайджест pMGX- yfg3 с AvrII и XbaI, как показано на шаге 3.2.
  3. Электрофорез - рестрикционные переваривания на соответствующем проценте агарозного геля и акцизной вставки и векторных полос с использованием чистого лезвия скальпеля / бритвы; См. Шаги 2.2-2.3.
  4. Экстрагируют ДНК из агарозного геля с использованием набора для экстракции гелем и количественно определяют ДНК 17 .
  5. Ligate ген 3 в pMGX- yfg1,2 с использованием соотношения вставки-в-вектор 3: 1 и установить отрицательное лигирование переваренного pMGX- yfg1,2 без дополнительной вставки, как показано на этапе 3.5.
  6. Трансформировать 5 мкл реакций лигирования в XL1-Blue химически компетентные клетки E. coli , лигированная плазмида pMGX- yfg1,2,3 (содержащие гены, представляющие интерес 1, 2 и 3), и отрицательный контроль pMGX- yfg1,2 , как видно на этапе 2.6.
  7. Сравните количество колоний на отрицательном контроле и лигирующих пластинах. Если на отрицательной контрольной панели имеется большое количество колоний, вернитесь к шагу 4.1 и просмотрите обработку CIP.
  8. Выберите 4-8 отдельных колоний (в зависимости от отрицательного контроля: коэффициент лигирования) от реакции лигирования и инокулируйте 4 мл LB плюс соответствующий антибиотик на отдельную колонию; Растут в течение ночи при 37 ° С и 220 об / мин.
  9. Изолируйте плазмидную ДНК с использованием набора для выделения плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя.
  10. Экран эффективного введения третьего гена путем выполнения рестрикционного переваривания pMGX- yfg1,2,3 с EcoRI, как видно на этапе 3.10.
  11. Электрофорез - рестрикционный переваривание на соответствующем процентном агарозном геле; смотретьДля полос, которые соответствуют размерам гена 2 и гена 3 (см. Шаг 2.2). Примечание: ген 3 может вставлять в вектор в нежелательной, обращенной ориентации. Если гены 2 и 3 имеют одинаковый размер, для скрининга должен быть выбран другой подходящий сайт дайджеста.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Повторите по мере необходимости для каждого нового гена.

5. Получение протеинов, представляющих интерес, с использованием мультигенной системы экспрессии и оценки продукции путем Вестерн-блоттинга

  1. Трансформируйте положительный клон, содержащий все интересующие гены, в химически компетентную продуцирующую белок E. coli , такую ​​как BL21- (λDE3).
    1. Оттереть 100 мкл аликвоты химически компетентного BL21- (λDE3) E. coli на льду в течение 5 мин и затем добавить 1 мкл положительной клонированной плазмидной ДНК; Инкубировать в течение 30 мин на льду.
    2. Нагрейте клетки в течение 45 с на водяной бане при температуре 42 ° C, а затем добавьте 200 мкл холодного LB. Инкубируйте на льду в течение 2 мин.
    3. Встряхните клетки при 37 ° С и 220 об / мин в течение 1 ч, а затем распределите планшет на 100 мкл на пластину с LB-агаром, содержащую подходящий селектируемый маркер (либо ампициллин, либо канамицин).
  2. Выразите белок индукцией изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG).
    1. Выделите изолированную колонию с пластины преобразования B21- (λDE3) и заселите 4 мл LB плюс соответствующий антибиотик; Растирать в течение ночи, встряхивая при 37 ° С и 220 об / мин.
    2. Инокулируйте 100 мл LB плюс соответствующую культуру антибиотика, используя 1 мл ночной культуры.
    3. Растите при 37 ° C со встряхиванием со скоростью 220 об / мин до OD 600 0,6.
    4. Индуцировать культуру с помощью 100 мкМ IPTG и расти в течение 15 ч при 25 ° С и 220 об / мин.
    5. Удаляют 1 мл культуры и центрифугируют ее при 13000 мкг в течение 1 мин; Отбросьте супернатант.
  3. Лизы клеток с использованием раствора лизиса в соответствии с инструкциями производителяИ заготовку вестерн-блотта растворимого клеточного лизата, чтобы определить, были ли успешно созданы все белки 19 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании целью было совместное экспрессирование пяти белков из одной плазмиды. Исправленные пять кодонов синтетические фрагменты гена, кодирующие либо N-, либо C-концевые гексагистидиновые метки, были куплены коммерчески. Синтетические гены амплифицировали с помощью ПЦР и индивидуально клонировали в ПЦР-тупой вектор и секвенировали. Для получения полицистронной плазмиды пять генов, представляющих интерес, сначала клонировали в подходящую плазмиду pMGX, pMGX-A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Совместная экспрессия множественных генов приобретает все большее значение, особенно при характеристике и восстановлении сложных многогенных метаболических путей 3 , 4 , 5 . Система pMGX делает мультигенную совместную экспрессию в рутине 6 , 7 , 8 E. coli и доступна для различных исследователей. В этом исследовании было показа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>ферментыщелочная
фосфатаза, кишечник телятника (CIP)New England BiolabsM0290S
AvrIINew England BiolabsR0174S
EcoRINew England BiolabsR0101S
NdeINew England BiolabsR0111S
XbaIНовый England BiolabsR0145S
Herculase II Fusion DNA PolymeraseAgilent Technologies600677
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Reagents
1 kb Лестница ДНКNew England BiolabsN3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Беспятниновые белковые гелиBio-Rad456-8095
50xTAE Fisher Thermo ScientificBP1332-4
АгарFisher Thermo ScientificBP1423-500
АгарозаFisher Thermo ScientificBP160-500
АмпицилинСигма-АльрихA9518-5G
BL21 (DE3) химически компептентные клеткиКомпептентные клетки, приготовленные в собственном
производстве Реагент для экстракции бактериального белка B-PERFisher Thermo ScientificPI78243
смесь dNTPAgilent TechnologiesПоставляется с набором
для экстракции гелем полимеразыOmegaD2500-02E.Z.N.A Gel Extraction, поставляется VWR Cat 3: CA101318-972
ГлицинFisher Thermo ScientificBP381-1
His Tag Антитела [HRP], mAb, мышьGenScriptA00612
Иммобилон Западный хемилюминесцентный HRP СубстратEMD MilliporeWBKLS0100
IPTGSigma-Alrich15502-10G
LBFisher Thermo ScientificBP1426-500
МетанолFisher Thermo ScientificA411-20
Пастеризованное быстрорастворимое сухое обезжиренное молокоМестный продуктовый магазинБезымянное молоко продуктового магазина адекватное
Нитроцеллюлозная мембранаAmersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)10600007Мембрана PT 0,45 &; м 200 мм x 4 м, предоставлено VWR Cat #: CA10061-086
Набор для выделения плазмидной ДНКOmegaD6943-02E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, предоставлен VWR Cat #: CA101318-898
pMGXBoddy LabЗапрос от Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
PrimersInterintegrated DNA Technologies Разработкапраймеров по мере необходимости для желаемого гена
Synthetic GeneLife TechnologiesПроектируйте и оптимизируйте по мере необходимости
Толстая клякса Фильтровальная бумагаBio-Rad1703932
Tris baseBioShopTRS001.1
Tween-20Sigma-AlrichP9416-50ML
XL1-Blue химически компетентные клеткиComeptent cell приготовленный в доме
Name Company>Номер в каталогеКомментарии
>Оборудование
BioSpectrometerEppendorfRK-83600-07
Коробка с гелем - PAGEBio-Rad1658005Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis
Cell Gel ImagerAlpha InnotechAlphaImager EC
Инкубатор-духовкаFisher Thermo Scientific11-690-650DIsotemp
Инкубатор-шейкерFisher Thermo ScientificSHKE6000-7MaxQ 6000
Personna RazorsFisher Thermo ScientificS04615
Power PackBio-RadS65533QFB300
TransilluminatorVWR InternationalM-10E,6W
ТермоциллерEppendorfZ316091Mastercycler Personal, поставляется Sigma
UV Face-Shield18-999-4542
Водяная баняFisher Thermo Scientific15-460-2SQ
Западный передаточный аппаратBio-Rad1703935мини-транс-блот-клетка

Ссылки

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

E coli

Похожие статьи