Методическая статья

Экотоксикологический метод с морскими бактериями

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55211

⸱

26 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Environmental Protection and Research (ISPRA), Rome (Italy), 2Department of Biology, Tor Vergata University, Rome (Italy), 3Department of Biology and Evolution of Marine Organisms, Stazione Zoologica, Anton Dohrn, Naples (Italy)

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе описан новый протокол для оценки экотоксичности загрязнителей, в том числе возникающих загрязнителей, таких как наноматериалы, с использованием морской бактерии Vibrio anguillarum . Этот метод позволяет определить LC 50 , или смертность, концентрацию, которая вызывает 50% -ное снижение культуры культивирования бактерий после 6-часовой экспозиции.

Аннотация

Бактерии являются важным компонентом экосистемы, и изменения микробного сообщества могут оказать существенное влияние на биогеохимический цикл и пищевые сети. Тесты на токсичность, основанные на микроорганизмах, широко используются, потому что они относительно быстры, воспроизводимы, дешевы и не связаны с этическими проблемами. Здесь мы описываем экотоксикологический метод оценки биологической реакции морской бактерии Vibrio anguillarum. Этот метод оценивает острую токсичность химических соединений, включая новые загрязнители, такие как наночастицы, а также образцы окружающей среды. Конечной точкой является снижение бактериальной культурности ( то есть способности к репликации и образованию колоний) из-за воздействия токсиканта. Это сокращение обычно называется смертностью. Тест позволяет определить LC 50 , концентрацию, которая вызывает 50% -ное снижение активности бактерий, активно реплицирующихся и формирующих колонии, после6-часовой экспозиции. Культуральные бактерии подсчитываются с точки зрения колониеобразующих единиц (КОЕ), и «смертность» оценивается и сравнивается с контролем. В этой работе была оценена токсичность сульфата меди (CuSO 4 ). Наблюдалось четкое соотношение доза-реакция, среднее ЛК 50 составляло 1,13 мг / л, после трех независимых испытаний. Этот протокол, по сравнению с существующими методами с микроорганизмами, применим в более широком диапазоне солености и не имеет ограничений для цветных / мутных образцов. Он использует солевой раствор в качестве среды воздействия, избегая любых возможных помех среды роста с исследуемыми загрязняющими веществами. Расчет LC 50 облегчает сравнение с другими биоанализами, обычно применяемыми для экотоксикологических оценок морской среды.

Введение

Экотоксикологические биоанализы оценивают токсичность химических веществ или образцов окружающей среды со стандартными биологическими моделями, интегрируя воздействие физических, химических и биологических факторов стресса на экосистемы. Из-за сложности экосистем экотоксикологические оценки риска должны учитывать батарею биоиспытаний, в которой участвуют организмы с разных трофических уровней. Токсичность анализов на лабораторных животных может быть дорогостоящей, трудоемкой и этически сомнительной. Стремление ограничить испытания на животных и разработать альтернативные подходы ( например, на бактериях и беспозвоночных животных) в настоящее время является основной проблемой, о чем сообщается в рамках действующего европейского законодательства, в том числе Директивы ЕС о защите животных, седьмой поправке к Директива ЕС о косметике и REACH.

Ракообразные, рыба и водоросли в основном используются для измерения токсичности в морской среде 1 . Бактерии являются важным компонентомТ экосистемы, а изменения в микробных сообществах могут оказать существенное влияние на биогеохимический цикл и другие критические экосистемные услуги. Испытания на токсичность, основанные на микроорганизмах, набирают популярность, потому что они относительно быстры, воспроизводимы и дешевы и не вызывают этических проблем 2 . Цель этой работы - описать экотоксикологический протокол для оценки реакции морской бактерии Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) при контакте с загрязнителями окружающей среды.

V. anguillarum - грамотрицательная , короткая, кривовидная стержневая бактерия (0,5 x 1,5 мкм) с полярным жгутиком. Обычно в солоноватой или соленой воде он галотолерантен с оптимальной соленостью около 20 и оптимальной температурой от 25 до 30 ° C 3 . Он был выбран в качестве модели организма из-за его вездесущности и важных экологических функций в океанеВо всем мире 4 . Известно, что некоторые серотипы V. anguillarum вызывают вибриоз у различных морских или солоноватых видов рыб 5,6 . Для этого на некоторых этапах эксперимента требуется стандартная микробиологическая практика, но не требуется специального оборудования или мер предосторожности. В предлагаемом протоколе испытаний на токсичность в качестве конечной точки используется бактериальная культурность ( то есть способность к репликации и образованию колоний), что позволяет определить LC 50 , концентрацию, которая вызывает 50% -ное сокращение бактерий, активно реплицирующихся и образующих колонии, после 6-часовой экспозиции. В Vibrio , как и в других микробах, это сокращение, которое мы обычно указываем как смертность, частично может быть вызвано индивидами в жизнеспособной, но не культивируемой (VBNC) фазе 7 . В этом исследовании мы применили этот метод для измерения токсического действия сульфата меди (CuSO 4), Эталонного токсиканта.

Этот метод был разработан для обеспечения подходящего теста на основе микроорганизмов для экотоксичной оценки загрязняющих веществ / химических соединений, включая возникающие загрязнители, такие как наноматериалы. Новизна этого протокола по сравнению с существующими методами, используемыми для микроорганизмов, в основном связана с средой воздействия и конечной точкой. Фактически экспозиция проводится в солевом растворе, избегая любых возможных помех среды роста с исследуемыми загрязняющими веществами, которые могут влиять на биологический ответ 8 . Конечной точкой является снижение бактериальной культурности, которую можно легко сравнить с другими острыми конечными точками, используемыми для экотоксикологического скрининга в морских / солоноватых средах на основе выживаемости / смертности. Кроме того, протокол использует методику микросчетов от жидкости к пластине, уже используемую на E. coli 9 , уменьшающиеся объемы и, таким образом, экспериментальный effOrt (подробнее см. Шаги 3.3 и 3.4 протокола).

Протокол

1. Подготовка реагентов / материалов

  1. Приготовьте (около 300) стерильные пробирки по 1,5 мл для серийного разведения бактериальных суспензий, а также 15 мл стерильных пробирок в качестве тест-контейнеров, помеченных концентрациями теста.
  2. Приготовить 2% раствор NaCl в качестве среды для воздействия и стерилизовать его. Альтернативно, используйте стерилизованную синтетическую или натуральную морскую воду с соленостью от 5 до 40.
  3. Приготовьте среду для выращивания триптического соевого агара (TSA) с 2% NaCl в соответствии с указаниями на этикетке и с учетом количества NaCl, уже присутствующего в среде.
  4. Налейте TSA (холодный, но все еще жидкий) в 90-миллиметровые чашки Петри, предварительно помеченные тестовой концентрацией и временем экспозиции, повторяющимся числом и коэффициентом разбавления; 19 мл является подходящим объемом.
  5. Приготовить среду для выращивания триптического соевого бульона (TSB) в соответствии с указаниями на этикетке. Добавьте соответствующее количество NaCl, чтобы получить ту же соленость, что и среда воздействия.
  6. ПодготовитьМаточного раствора CuSO 4 с двойной дистиллированной водой и стерилизуют (необходимую) аликвоту с использованием шприцевого фильтра 0,22 мкм. В случае образцов окружающей среды подготовьте соответствующий интервал разведений образца и простерилизуйте их, используя фильтр шприца 0,22 мкм.
  7. Подготовьте тестовые растворы в пробирках по 15 мл, помеченных концентрациями для испытаний. Заполните отрицательный контроль 5 мл среды воздействия (2% NaCl). Заполните другие пробирки соответствующим количеством среды для воздействия и основным раствором CuSO 4, чтобы получить контрольные концентрации в 5 мл конечного объема.

2. Подготовка бактериального посевного материала

  1. За 12-18 ч до испытания готовят жидкую свежую культуру Vibrio anguillarum . Используя стерильную петлю, выберите одну хорошо изолированную колонию из ночной культуры на твердой среде (TSA). Инокулируют пробирку, наполненную 10 мл TSB, и инкубируют бактериальную культуру при 25 ° C в течение 12-18 часов.
  2. Через 12-18 ч оценивают бактериальную концентрацию инокулюма спектрофотометрически. Вихревой инокулят и измеряют оптическую плотность при длине волны 600 нм, используя БСЭ как бланк.
  3. Чтобы получить известную бактериальную концентрацию, разбавьте 2 мл перемешанного вортексом инокулята, добавив количество TSB, рассчитанное по этой формуле:
    TSB мл = [(OD / 0,14) * 2] -2.
  4. Убедитесь, что оптическая плотность разбавленного инокулята составляет 0,140 (± 0,005), что соответствует 0,5 балла по нефелометрическому стандарту МакФарланда.
  5. Центрифуга разбавленный инокулят в течение 10 мин при 3000 g . Устранить надосадочную жидкость и повторно суспендировать микробный осадок в 1 мл 2% раствора NaCl (среда для воздействия).

3. Тестирование экспозиции

  1. Добавьте 150 мкл повторно суспендированного бактериального инокулята в каждую пробирку, включая контроль. Инкубируйте суспензии V. anguillarum в течение 6 ч при 25 ° С в темноте и в непрерывном режимеЧтобы избежать седиментации.
  2. В начале (T 0 ) и в конце (T 6 ) времени экспозиции проводят бактериальный подсчет во всех подвергнутых воздействию бактериальных суспензиях с использованием методов подсчета колоний (CFU).
  3. Готовят серийные разведения каждой выставленной бактериальной суспензии в трех повторностях, применяя десятикратный коэффициент разведения (до 10 -5 ). Добавьте 100 мкл каждой бактериальной суспензии в соответствующую пробирку, уже заполненную 900 мкл среды воздействия (2% NaCl). Продолжайте серийное разведение, встряхивая на каждой стадии для повторного суспендирования бактерий.
  4. Планшет 10 мкл 10 -4 и 10 -5 разведений на чашках Петри TSA в соответствующем сегменте. Быстро дайте каплям скользить по маленькому кругу, вращая пластину. Инкубируйте планшеты при 25 ° С в течение 48 часов.

4. Подсчет CFU

  1. Через 48 часов подсчитывают колонии, выращенные на чашках Петри; Пластины, несущие bМежду 5 и 50 колониями оптимальны для точного подсчета.
  2. Рассчитайте количество жизнеспособных бактерий на мл каждой открытой бактериальной суспензии, применив следующие формулы:
    10 -4 CFU / мл = n ° CFU × 100 × 10000
    10 -5 → КОЕ / мл = n ° КОЕ х 100 х 100 000
  3. Используйте среднее значение числа, полученного в параллельных повторах, для оценки смертности по сравнению с контролем. Рассчитайте смертность в процентах по следующей формуле:
    M% = 100 - [(N / C) * 100]
    ПРИМЕЧАНИЕ: где N = количество КОЕ / мл, выращенных после воздействия токсиканта; C = количество CFU, выращенного в контрольной среде.
  4. Рассчитайте LC 50 ( то есть концентрацию токсиканта, которая уменьшает количество активно реплицирующихся бактерий на 50% на мл, КОЕ / мл) с нелинейным регрессионным анализом с использованием соответствующего статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Выполните односторонний анализ дисперсии (ANOVA) follЧто обусловлено случайными t-критериями post-hoc для оценки существенных различий между обработками.

Результаты

Результаты трех независимых испытаний по выявлению V. anguillarum для четырех концентраций CuSO 4 демонстрируют четкую зависимость доза-эффект и значительное уменьшение количества бактерий, активно реплицирующихся и формирующих колонии с возрастающей концентрацией эталонного токсиканта ( рис. 1 , ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Количество КОЕ / мл значительно снижается на 1,25 мг / л (пост-тест Tukey, p <0,05) по сравнению с контролем (CNTR). Любые культивируемые бактерии были обнаружены при самой высокой концентрации. Различий по токсичности CuSO 4 не обнаружено в широком диапазоне солености среды воздействия ( т.е. 5, 20 или 35 г / л NaCl, данные не показаны). Репрезентативный результат статистического анализа, показывающий нелинейную регрессию, представлен в Дополнительном рисунке 1 . Величины LC 50 , рассчитанные для трех независимых испытаний (<Сильные> Таблица 1) подчеркивают осуществимость и воспроизводимость этого метода.

figure-results-1
Рисунок 1: Vibrio anguillarum, подвергнутый воздействию CuSO 4. Среднее число КОЕ / мл (КОЕ = колониеобразующая единица), подвергнутое различной концентрации CuSO 4 в течение 6 часов. Значения представляют среднее (± SD) трех независимых испытаний. Сокращения бактерий, активно реплицирующихся и формирующих колонии по отношению к контролю (CNTR), приводятся в желтых коробках (в процентах). Значительные различия с контролем, основанным на тесте Tukey, указаны звездочками (* = p <0,05; ** = p <0,01). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Таблица 1: Значения летальной концентрации (LC 50 ) для Vibrio anguillarum, подвергнутых воздействию CuSO 4 . Сообщается о результатах трех независимых испытаний и средств (± SD).


Дополнительный рисунок 1: Нелинейный регрессионный анализ. Репрезентативный результат нелинейного регрессионного анализа (модель Logit-Hill), выполненный по результатам теста. Нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Обсуждение

Эта работа описывает новый биоанализ с морской бактерией V. anguillarum, который был успешно применен для оценки токсического воздействия CuSO 4 , эталонного токсиканта, демонстрирующего четкое соотношение доза-реакция. Морская бактерия V. anguillarum была выбрана в качестве модельного организма, поскольку она является галотолерантной, вездесущей и репрезентативной для морских экосистем.

Испытание может быть проведено в широком диапазоне значений солености (5-40) и может использовать солевые растворы и синтетические или естественные морские воды в качестве среды воздействия, при условии, что микроорганизмы могут легко выжить в течение всего испытания. Это позволяет анализировать различные виды проб, включая солоноватые и морские среды.

Во время фазы экспозиции не требуется никакой питательной среды, избегающей ее взаимодействия с загрязняющими веществами 8 и ее возможного влияния на биологический ответ. ThПротокол e надежный, быстрый, экономически эффективный и относительно простой. Процедура микросчетов «жидкость-пластина» 9 дает преимущество использования малых (выборочных) объемов, хотя это подразумевает высокую степень точности и прочности. Результаты трех независимых испытаний и повторов для каждой обработки показывают высокую повторяемость этого метода. Использование бактерий в качестве биологической модели, а также адаптируемость методики благоприятствуют экологической и экологической значимости этой процедуры. Другими важными техническими проблемами являются точность при подготовке бактериального посевного материала и стерильность, требуемая на некоторых этапах процедуры.

Предлагаемый тест является более быстрым (6 ч) по сравнению с другими морскими экотоксикологическими исследованиями (24-96 ч) и не вызывает этических проблем, возникающих в результате использования высших организмов. Кроме того, данные по эталонному токсиканту показывают значения LC 50 , сравнимые с данными, полученными при остром t На других морских видах 10 , 11 , демонстрируя хорошую чувствительность. Среди бактериальных биоанализов наиболее распространенным и хорошо стандартизированным является тест ингибирования люминесценции V. fischeri 12 . Этот биоанализ происходит очень быстро (15-30 мин) и действителен для тестирования твердофазных образцов, но на него могут влиять цветные и мутные образцы, которые мешают измерениям люминесценции. Соленость является ограничивающим фактором в использовании вышеупомянутого теста, при этом 2% NaCl требуется 13 . Напротив, предложенное здесь испытание с V. anguillarum дает доступные результаты при широком диапазоне значений солености, не имеет ограничений в отношении мутных или окрашенных образцов и требует менее дорогого оборудования по сравнению с анализаторами люминесценции. Сравнение результатов нашего исследования с результатами, полученными в литературе для V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 показывает сопоставимые значения EC 50 , дополнительно поддерживающие эффективность этого биологического анализа.

Этот биоанализ оценивает снижение бактериальной культуры, обычно называемое смертностью, вместо скорости роста популяции или ингибирования ферментативной активности, которые используются в тестах, доступных в настоящее время для микроорганизмов. Расчет LC 50 позволяет сравнить с другими биоанализами, обычно применяемыми для экотоксикологической оценки морской среды, которые часто имеют выживаемость / смертность в качестве конечной точки. Срочно требуется провести интеркалибровку, чтобы оценить / подтвердить надежность и воспроизводимость этого теста и поддержать его стандартизацию и использование в нормативных протоколах.

Возрастающее использование наноматериалов и их потенциальное высвобождение в окружающую среду подразумевают необходимость оценки риска 17 . Однако, clas(Эко) токсикологические подходы к этим появляющимся загрязняющим веществам, по-видимому, не дают приемлемых результатов и могут потребовать некоторых приспособлений 18 . Характеристики этого нового биоанализа позволяют легко и полезно применять его для оценки токсичности наночастиц. Фактически, возможность проведения анализа при различных концентрациях солей даст представление о поведении наночастиц при различных ионных силах, переменных параметров окружающей среды, которые могут значительно влиять на токсичность 19 . Кроме того, использование экоматериалов и питательных веществ не рекомендуется для оценки экотоксичности наночастиц, поскольку органические вещества могут облегчать их поглощение за счет увеличения токсического воздействия 20 или могут вызывать агрегацию, снижая биодоступную фракцию и, следовательно, их токсичность 21 .

В заключение, биоанализ на Vibrio anguillarum является apИнструмент для оценки риска классических и возникающих загрязнителей, а также для оценки состояния морской и солоноватой среды.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована исследовательским проектом: «NanoBioTech ambiente e salute» ( «Нано-биотехнология: окружающая среда и здоровье», Проект 2: Окружающая среда.) Инструменты и методы экотоксикологических исследований Мониторинг наночастиц " ), предоставленный LM от Regione Lazio-Consorzio Hypatia. В рамках ранее цитированного проекта АР финансировалось за счет докторантуры гранта Университета Тор Вергата / Регион Лацио-Консорцио Ипатия. Соглашение с университетом ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) позволило взаимное использование объектов и обмен исследователями.

Авторы выражают благодарность профессору Марии Кристине Таллер, нашему ангелу-хранителю за все виды микробной деятельности, за интерес к микробному миру и за решительную помощь в совершенствовании наших исследований по этому вопросу. Авторы с благодарностью отмечают Андреа Торнамбе и ЭриKa Magaletti за ценное сотрудничество с лабораторией ISPRA по экологии и экотоксикологии фитопланктона.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Vibrio anguillarum (штамм AL 102, серотип O1)Получен из лабораторной коллекции NOIFMA (Норвегия)
Триптический соевый агар Liofilchem610052Дегидратированная питательная среда
Триптический соевый бульон Питательная средаLiofilchem610053Дегидратированная питательная среда
CuSO4· 5H2OSigma-Aldrich209198
NaCl Sigma-AldrichS-3014
Наименование оборудования<strong>CompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии/Описание
Biosafety Laminar Flow Hood ЭСКО
 Fratelli GalliMod. 2100
Название программного обеспеченияCompanyКаталожный номер<strong>Комментарии/Описание
Программное обеспечение для тестирования дозы Агентства по охране окружающей среды США2.4.0 2012
Инкубатор Эталонная доза г.

Ссылки

  1. Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
  2. Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
  3. Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
  4. Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
  5. Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
  6. Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
  7. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
  8. Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
  9. Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
  10. Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
  11. Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
  12. Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
  13. Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030(2003).
  14. Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
  15. Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
  16. Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
  17. Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
  18. Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
  19. Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
  20. Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
  21. Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

Тестирование острой токсичностиколониеобразующие единицыопределение ЛК50сульфат медисерийное разведениефизиологический растворжизнеспособность бактерий
Экотоксикологический метод с морскими бактериями
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.