Методическая статья

Анализ сегрегации хромосом, ацетилирование гистонов и морфология веретена в ооцитах лошадей

DOI:

10.3791/55242

⸱

11 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцитов лошадей. В частности, в настоящей работе показано, как собирать незрелые и зрелые ооциты лошади с помощью ультразвукового наводящего пипетки (OPU) и как исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена, глобальное ацетилирование гистонов и экспрессию мРНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Область вспомогательного размножения была разработана для лечения бесплодия у женщин, домашних животных и исчезающих видов. У лошадей вспомогательное воспроизведение также позволяет производить эмбрионы от высоких исполнителей без прерывания их спортивной карьеры и способствует увеличению числа жеребят у кобыл высокой генетической ценности. Настоящая рукопись описывает процедуры, используемые для сбора незрелых и зрелых ооцитов из яичников лошадей с использованием пипетки яйцеклеток (OPU). Эти ооциты затем использовали для исследования частоты анеуплоидии путем адаптации протокола, ранее разработанного на мышах. В частности, хромосомы и центромеры ооцитов метафазы II (MII) флуоресцентно маркировали и подсчитывали на последовательные фокальные планы после сканирования конфокального лазерного микроскопа. Этот анализ выявил более высокую частоту анеуплоидии, когда незрелые ооциты были собраны из фолликулов и созревали in vitro по сравнению сIn vivo. Иммунное окрашивание тубулина и ацетилированная форма гистона-4 в определенных остатках лизина также выявило различия в морфологии мейотического веретена и в глобальной структуре ацетилирования гистонов. Наконец, экспрессия мРНК, кодирующих гистондеацетилазы (HDACs) и ацетилтрансфераз (HATs), исследовалась с помощью обратной транскрипции и количественной ПЦР (q-ПЦР). Отличия в относительной экспрессии транскриптов не наблюдались между созревшими in vitro и ооцитами in vivo . В соответствии с общим молчанием транскрипционной активности во время созревания ооцитов анализ суммарного количества транскриптов может выявить только стабильность или деградацию мРНК. Таким образом, эти выводы показывают, что могут быть затронуты другие правила перевода и посттрансляции.

В целом, настоящее исследование описывает экспериментальный подход к морфологическим и биохимическим характеристикам ооцита лошади,Типа, который чрезвычайно сложно изучить из-за низкой доступности образцов. Тем не менее, он может расширить наши знания о репродуктивной биологии и бесплодии у моновируляционных видов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для лечения бесплодия у женщин, животных-компаньонов и исчезающих видов разработано множество методов вспомогательной репродукции. Одной из наиболее распространенных процедур в клинических условиях является извлечение ооцитов из метафазы II (MII) из фолликулов яичников с помощью ультразвуковой трансвагинальной аспирации, пикап яичника (OPU) 1 . Эти ооциты затем оплодотворяются in vitro (IVF), с полученным эмбрионом (ами), имплантированным в матку-реципиенту. MII-стадии (зрелые) ооциты извлекаются после введения экзогенных гонадотропинов. Однако это лечение ассоциируется у некоторых пациентов с развитием синдрома гиперстимуляции яичников (OHSS) 2 .

Пользуясь внутренней способностью полностью выращенных незрелых ооцитов (GV-стадия) спонтанно возобновлять мейоз после выделения из их фолликулов, можно получить зрелые ооциты без введенияГонадотропин 3 . Эта процедура называется созреванием ооцита in vitro (IVM) и представляет собой менее ориентированный на наркотики, менее дорогой и более дружелюбный к пациенту подход к вспомогательным репродуктивным технологиям. Однако успех развития эмбрионов с ооцитами, выращенными in vitro, как правило, ниже, чем у ооцитов созревших in vivo 4 , 5 . Возможное объяснение состоит в том, что созревающие in vitro ооциты в большей степени подвержены ошибкам в сегрегации хромосом, а возникающая анеуплоидия нарушает нормальное эмбриональное развитие 6 .

Понимание молекулярной основы хромосомной неправильной сегрегации во время IVM в конечном счете раскрыло бы полный потенциал этого метода. В этом ключе экспериментальный подход, используемый для исследования морфологических и биохимических особенностей in vitro -зрелых ооцитов, по сравнению с in vivo maturОоциты описаны здесь 7 , 8 . В частности, процедуры OPU незрелых и зрелых ооцитов и IVM незрелых ооцитов иллюстрируются с использованием взрослых лошадей и лошадей с естественной едой в качестве экспериментальной модели. Затем проводят иммунофлюоресценцию и анализ изображения, чтобы исследовать сегрегацию хромосом, морфологию веретена и глобальную картину ацетилирования гистонов на этих гаметах. Наконец, описан протокол обратной транскрипции и количественной ПЦР для анализа экспрессии мРНК.

По сравнению с моделями животных-грызунов лошади не допускают генетических манипуляций, их труднее манипулировать и требуют дорогого ухода. Однако эта модель приобретает значительный интерес для изучения созревания ооцитов 9 , 10 из-за сходства с физиологией яичников у людей 11 , 12 </ SUP>. Более того, разработка надежных протоколов IVM-IVF у лошади имеет существенный экономический интерес, так как это позволило бы увеличить число жеребят у кобыл высокой генетической ценности.

Одним из ограничений проведения экспериментов на ооцитах, особенно в моновируляционных видах, является ограниченная доступность образцов. Этот предел был преодолен путем корректировки подхода, ранее разработанного на мышах, к ооцитам лошадей 13 , 14 , чтобы проводить подсчет хромосом, который минимизирует потерю образца (см. Обсуждение для сравнения с другими доступными методами). Кроме того, протокол трифлуоресцентного окрашивания был оптимизирован для проведения множественных анализов в одном образце, а q-PCR-анализ проводился только для пулов с 2 ооцитами.

В целом, настоящее исследование описывает экспериментальный подход, направленный на морфологически и биохимически чаРактеризировать ооцит лошади, тип клетки, который чрезвычайно сложно изучить из-за низкой доступности образцов. Тем не менее, он может расширить наши знания о репродуктивной биологии и бесплодии моновируляционных видов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных CEEA Val de Loire номер 19 и выполнялись в соответствии с Руководящими принципами ухода и использования лабораторных животных.

1. Сбор ооцитов и созревание in vitro

  1. Питание яйцеклетки
    1. Ежедневно оценивают ультразвуком диаметр яичниковых фолликулов в когорте взрослых кобыл. При появлении фолликула ≥33 мм (доминантный фолликул), вставьте кобылу 1500 IU хорионического гонадотропина человека (hCG) в верхнюю часть яремной вены (iv).
      1. Перед выполнением инъекции протрите область спиртом, найдите яремную борозду и поместите большой палец на 2-3 см под место инъекции, чтобы побудить вену встать. Вставьте иглу почти параллельно шейке и аспирируйте, чтобы убедиться, что игла находится в вене (кровь попадет в шприц). На этом этапе введите; ХГЧ будет вызывать мНатурации ооцита в доминантном фолликуле.
    2. Спустя 35 ч после инъекции ХГЧ, успокаивают кобылу детомидином (15 мкг / кг, внутривенно), буторфаноловым тартратом (10 мкг / кг, внутривенно) и бутилскополамином бромом (0,2-0,3 мг / кг, 15 мл / мор., Iv).
    3. Подключите иглу к ультразвуковому зонду. Вставьте ультразвуковой зонд вагинально и удерживайте яичник трансректально, чтобы смотреть на ультразвуковой зонд. Поручите одному оператору маневрировать иглой, а другой, чтобы удерживать яичник на месте, с фолликулом, обращенным к ультразвуковому зонду . Начните с яичника с доминирующим фолликулом.
    4. Проколите стенку влагалища и стенку доминантного фолликула иглой (ультразвуковые зонды для OPU оснащены каналом для иглы, присоединенной к системе всасывания); Theneedle будет виден в эхографическом изображении.
    5. Аспирируйте фолликулярную жидкость в 50-мл конической трубке, соединенной с системой всасывания. Налейте содержимое конической формыПробирки в большую чашку Петри и поиск комплекса кумулюс-ооцит (КОК) с помощью стереомикроскопа.
    6. Так как КОК не всегда извлекается фолликулярной жидкостью, промывайте фолликул с модифицированным Дульбекко фосфатно-солевым буфером (DPBS), содержащим 5 МЕ / мл гепарината 37 ° C. Исследуйте DPBS для присутствия COC, как описано ранее для фолликулярной жидкости на этапе 1.1.5. Сбрасывайте несколько раз, пока не будет извлечен COC.
    7. Как только КОК из доминантного фолликула извлекается, прокалывается и смывается фолликулы ≥5 и ≤25 мм, как описано для доминантного фолликула на этапах 1.1.3-1.1.4; Фолликулы ≥5 и ≤25 не экспрессируют лютеинизирующий гормон / рецептор choriogonadotropin (LHCGR), и поэтому их ооциты не созревают в ответ на hCG и будут собраны на стадии GV (незрелые). Храните КОК только несколькими полными слоями кучевых клеток и коричневой мелкозернистой ооплазмы. Откажитесь от других.
    8. В конце ОПУ, вЧтобы предотвратить заражение, кобылу с бензил-пенициллином 15 000 МЕ / животное.
    9. Дом кобыла в тихом, чистом стабильном состоянии, по крайней мере 2 часа. Проверяйте признаки осознания, определяя положение ушей, реакцию на раздражители ( например, шум) и походку, прежде чем возвращать кобылу в компанию других животных.
  2. Созревание in vitro
    1. Теплый HEPES-буферный TCM199 (20 мМ Hepes), дополненный 1790 МЕ / л гепарином, 0,4% бычьим сывороточным альбумином (BSA), пенициллином и стрептомицином до 37 ° C. Подготовьте этот носитель заранее. Фильтр стерилизовать и держать его при 4 ° C до 6 месяцев.
    2. Подготовьте среду IVM добавлением NaHCO 3 -буферизованного TCM199 (25 мМ NaHCO 3 ) с 50 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF) и 20% сыворотки теленка 7 . Используйте NaHCO 3 -буфер TCM199 в течение 3 недель после открытия новой бутылки. Подготовка EGF заранее, как 100x запасов, заморозить его при -20 ° C, И использовать его в течение 6 месяцев. Внесите 500 мкл в лунки 4-луночного планшета и инкубируйте в увлажненном воздухе с 5% CO 2 при 38,5 ° C в течение не менее 2 часов.
    3. После извлечения КОК из фолликулов ≥5 и ≤25 мм, помещали их в чашку Петри (диаметр 3,5 см), заполненную 2 мл HEPES-TCM199. Переместите КОК в разные области блюда, чтобы смыть сотовые развалины.
    4. Перенесите КОК в среду IVM и инкубируйте в течение 28 ч в увлажненном воздухе с 5% СО 2 при 38,5 ° С.

2. Иммунофлюоресценция и анализ изображений

  1. Количество хромосом
    1. После сбора из доминантного фолликула или в конце IVM инкубируйте КОК со 100 мкМ monastrol в течение 1 ч в увлажненном воздухе с 5% CO 2 при 38,5 ° C. Предварительно подготовьте monastrol как 100x запасы и храните его при -20 ° C до 1 года.
    2. Удаление кучевых ячеекПутем обработки их 0,5% гиалуронидазой или осторожным пипетированием; Удалите zona pellucida, обработав его в 0,2% проназе. Предварительно подготовьте гиалуронидазу и проназу в виде 10х запасов и храните их при -20 ° C до 1 года.
    3. Закрепите ооциты в 4% параформальдегиде в DPBS в течение 15 мин при 38,5 ° С, затем еще 45 мин при 4 ° С.
      ВНИМАНИЕ! При обращении с параформальдегидом пользоваться средствами индивидуальной защиты и утилизировать загрязненные материалы в соответствии с указаниями по удалению опасных отходов.
    4. Промывают ооциты путем последовательной передачи в 3 лунки, заполненные 500 мкл DPBS, дополненного 0,1% поливинилового спирта (PVA). Permeabilize в 0,3% Triton X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
    5. Блокировать неспецифическое связывание путем инкубации в DPBS, дополненном 1% бычьим сывороточным альбумином (DPBS-1% BSA) и 10% нормальной сывороткой осла в течение по меньшей мере 30 мин при комнатной температуре. Образцы можно хранить в блокирующем растворе при 4 ° С в течение 3-4 дней.
    6. Для первичного окрашивания инкубируйте ооциты в кроличьем анти-Aurora B phospho-Thr232 в DPBS, дополненном 1% BSA (разведение 1:50) при 4 ° C в течение ночи.
    7. Промыть ооциты, как описано в шаге 2.1.4. Инкубируйте ооциты в растворе конъюгированного с тетрациклом метилоходами изотиоцианатом (TRITC) осла против кроличьего IgG (1: 100 в DPBS-1% BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
    8. Промывают ооциты, как описано в шаге 2.1.4, и затем помещают 3-4 ооцита в каплю не упрочняющей, анти-увядающей среды для установки, дополненной 20 мкМ YOPRO1 на предметном стекле. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будут смонтированы все ооциты (3-4 ооцита на слайд).
    9. Дайте ооцитам оседать в течение примерно 10 минут в монтажной среде, а затем накройте их покровным стеклом. Чтобы избежать дробления ооцитов, нанесите две полоски двухсторонней ленты перед укладкой покровного стекла на предметное стекло.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эта мера предосторожности также гарантирует, что все образцы одинаково сжаты между стеклянным sliДе и покровное стекло. Стеклянные горки могут быть заморожены при -20 ° C и отображены в течение следующих 2-3 дней.
    10. Изобразите образцы на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с объективом 60X с использованием красных (центромеры) и зеленых (хромосом) каналов 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . Отсканируйте образцы, охватывающие всю метафазическую пластину по оси Z, с шагом каждые 0,35 мкм. Сохраните цифровые изображения каждого плана.
    11. Посчитайте центромеры в последовательных конфокальных срезах, используя функцию подсчета клеток программного обеспечения NIH ImageJ (доступно по адресу: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте повторного подсчета центромер, которые появляются на смежных секциях, путем определения центромеров, которые появляются, остаются и исчезают в последовательных разделах с помощью числового кода.
    12. Повторите хромосомный соНа шаге 2.1.11, с независимым оператором.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Классифицируйте ооциты как эуплоидные (32 хромосомы), гиперплоидные (> 32) или гипоплоидные (<32).
  2. Морфология веретена и ацетилирование гистонов
    1. После сбора из доминантного фолликула или в конце IVM удалите кумулюсные клетки обработкой в ​​0,5% гиалуронидазе или осторожным пипетированием, как описано на этапе 2.1.2.
    2. Промывают ооциты в DPBS-PVA, как на этапе 2.1.4, и фиксируют их в 2,5% параформальдегиде в течение 20 мин при 38 ° C. Аккуратно промыть, как описано в шаге 2.1.4, и пропитать в 0,1% Triton X-100 в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ. При обращении с параформальдегидом используйте средства индивидуальной защиты и утилизируйте загрязненные материалы в соответствии с указаниями по удалению опасных отходов.
    3. Блокировать неспецифическое связывание путем инкубации в DPBS, дополненном 2% бычьим сывороточным альбумином (DPBS - 2% BSA), 0,05% сапонином и 10% нормальной сывороткой ослаR 2 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в блокирующем растворе при 4 ° С в течение 3 - 4 дней.
    4. Для первичного окрашивания инкубируйте ооциты в мышином анти-альфа-тубулине (1: 150) и кроличьем анти-acH4K16 (1: 250) в DPBS-2% BSA с 0,05% сапонином при 4 ° C в течение ночи.
    5. Промывают ооциты, как на этапе 2.1.4. Инкубируйте ооциты в растворе зеленого флуоресцентного конъюгированного с ослом антитела против мышиного IgG (1: 500) и TRITC-конъюгированного осла против кролика IgG (1: 100) в DPBS-2% BSA с 0,05% сапонина в течение 1 часа при RT в темноте.
    6. Промывают ооциты, как на шаге 2.1.4, а затем кладут 3-4 ооцита в каплю не затвердевающей, анти-увядающей среды для установки, дополненной 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) На стеклянном слайде.
    7. Смонтируйте ооциты на предметных стеклах, как описано в шаге 2.1.8.
    8. Изобразите образцы на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с 60-кратным объективом, используя красный (acH4K16), зеленый (альфа-тубулин) и синий (ДНК) каналы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте параметры лазера для красного и синего каналов постоянными во время сбора всех образцов. Отсканируйте образцы, охватывающие весь мейотический шпиндель и метафазную пластину по оси Z, с шагом каждые 0,35 мкм. Сохраните цифровые изображения (одиночные планы и проецируемое трехмерное изображение).
    9. Измерьте длину шпинделя между полюсами и диаметр шпинделя на максимальной ширине на проецируемом изображении с помощью функции измерения программного обеспечения NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). Повторить каждые 3 раза и вычислить среднее значение.
    10. Количественное определение относительной флуоресценции acH4K16 с использованием интегрированной функции плотности программного обеспечения NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Нормализовать его для интегрированной плотности окрашивания DAPI.

3. Анализ экспрессии мРНК.

  1. После того, как КОК были извлечены из фолликулов размером от 5 до 25 мм, соберите гранулезную клеткуКоторый оставался в чашке Петри и дважды промывал его в холодном DPBS путем центрифугирования при 10600 мкг в течение 2 мин. Замораживают замораживание в жидком азоте. Хранить образцы при -80 ° C в течение 6 месяцев; Ячейки будут служить для стандартной кривой.
  2. Тщательно удалите все кумулятивные клетки, как описано на этапе 2.1.2, из незрелых (GV), созревших in vitro и in vivo ооцитов.
  3. Промывают ооциты, как описано в 2.1.4, в DPBS-PVA, собирают их по одному в 1 мкл объемах и откладывают 2 мкл RNALater сверху. Заморозить в жидком азоте. Храните образцы при температуре -80 ° C в течение 6 месяцев.
  4. Добавить 2 пг Luciferase РНК для каждого образца, как всплеск. Объединение ооцитов 2 х 2 и экстракция общей РНК с использованием фильтра на основе кремниевой мембранной фильтрации, подходящего для извлечения РНК из небольших образцов.
  5. Обратную транскрибируют РНК в 10 мкл с 0,25 мкг случайных гексамеров и обратной мышиной обратной транскриптазы вируса лейкемии Moloney в течение 1 ч при 37 & 176; С. Храните образцы при температуре -20 ° C в течение 6 месяцев.
  6. Развести кДНК из гранулезных клеток в воде без РНКазы до 50 нг / мкл. Серийно разбавляйте этот раствор 1:10 до получения 5 нг / мкл, 0,5 нг / мкл, 0,05 нг / мкл и 0,005 нг / мкл раствора.
  7. Собирают реакции в трех повторностях в общем объеме 20 мкл на реакцию с использованием кДНК, эквивалентной 0.05 ооцитов в качестве субстрата, или 5 мкл серийных разведений кДНК гранулезных клеток, 10 мкл зеленого супермикса SYBR и 0,3 мкМ каждого конкретного праймера ( Таблица 1 ).
  8. Проведите реакцию в термоциклере с использованием трехстадийного протокола: 95 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 20 секунд, повторяя 40 раз. Наконец, приобретите кривую плавления, начиная с 60 ° C, и увеличивайте температуру на 0,5 ° C каждые 20 секунд до 95 ° C.
  9. Оценить начальное количество (SQ) конкретной мРНК в образцах ооцитов с использованием стандартной кривойF "> 15, рассчитанной на основе выборки клеток гранулезы. Выразите данные как отношение между SQ интересующего гена и SQ генов хозяйствования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исходные данные этих экспериментов были подробно описаны ранее 7 и приведены здесь в качестве примера результатов, которые могут быть получены с использованием описанных протоколов.

Скорость созревания

Из 32 КОК, извлеченных OPU из доминантных фолликулов, 28 (88%) находились на стадии MII. Четырнадцать из 58 КОК, собранных из фолликулов размером...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что IVM был проведен на лошадях более 20 лет 16 , мы еще не знаем, может ли ооцит быть источником эмбриональной анеуплоидии, как это было предложено для людей 17 . Причина, вероятно, в том, что приготовление спредов ооцитов для подсчета хромосом приводит к значительной потере образца. Имея это в виду, был проведен обзор методов, используемых для исследования ошибок в сегрегации хромосом, для поиска наиболее подходящей методики, применяемой к ооцитам лошадей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Фабриса Винсента за поддержку лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) , а также Филиппа Барьера и Тьерри Бларда за ежедневное ультразвуковое сканирование яичников и инъекцию ХГЧ. Эта работа была частично поддержана проектом "Regione Sardegna and Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Грант № 26096200 по борьбе с отмыванием денег); «Стипендия L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012» (контракт от 2012 года до FF), FP7-PEOPLE-2011-CIG, Исполнительное агентство по исследованиям (REA) «Pro-Ovum» (грант № 303640 по VL); И Постдокторской школой земледелия и ветеринарной медицины, финансируемой совместно с Европейским социальным фондом, Секторальная оперативная программа развития людских ресурсов на 2007-2013 годы (контракт № POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 для IM). Сбор яйцеклеток in vivo финансировался Институтом французского языка им. Шеваля и Эквивалента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ультразвуковой зондAlokaUST-5820-7,5
хорионический гонадотропин человекаcentravetCHO0041,500 ед/животное в/в
детомидинаcentravetMED0109 - 15 &; г/кг в/в
бутилскополамин бромурcentravetEST0010,2 мг/кг в/в
стереомикроскопNIKONSMZ-2B
буторфанолcentravetDOL00310&микро; г/кг в/в
бензил-пенициллинцентраветDEP203 IM15,000 UI/животное
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1Lпорошок для хепс-буферизованного TCM199
Хепес натриевая сольSigma-AldrichH3784-100G
бычья сыворотка альбуминSigma-AldrichA8806
гепарин Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-buffered TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLжидкость для IVM средний
эпидермальный фактор ростаSigma-AldrichE4127
сыворотка для новорожденных телятSigma-AldrichN4762-500ML
4-луночные чашкиNUNCLON144444
инкубаторHeraeusBB6060
монастролSigma-AldrichM8515
гиалуронидазаSigma-AldrichH3506
проназаSigma-AldrichP5147
параформальдегидSigma-AldrichP6148
поливиниловый спиртSigma-Aldrich341584
тритон-X 100Sigma-AldrichT8787
нормальная сыворотка для осликовSigma-AldrichD9663
для кроликов анти-Aurora B phospho-Thr232BioLegend636102
TRITC-конъюгированный ослик против кролика IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher НаучныйY3603
конфокальный лазерный сканирующий микроскопLSM 780Zeiss
конфокальный лазерный сканирующий микроскопLSM 700Zeiss
ImageJ программное обеспечениеrsb.info. nih.gov/ij/download.htmlбесплатный ресурс
мышь антиальфа-тубулинSigma-AldrichT8203
кролик анти-acH4K16Upstate Биотехнология07-329
AlexaFluor 488-конугурированный ослик антимышиный IgGLife TechnologiesA21202
4',6-диамидино-2-фенилиндолSigma-AldrichD8417DAPI
центрифугаEppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Люцифераза РНКPromegaL4561
Набор для выделения РНК PicoPureApplied Biosystems12204-01
случайные гексамерыThermofisher ScientificN8080127
мыши Moloney лейкоз вирус лейкемии обратная транскриптазаThermofisher Scientific28025013
SYBR зеленый супермиксBioRad1708880
специфические праймерыSigma-Aldrichспециальные праймеры были разработаны с использованием программного обеспечения Primer3Plus (бесплатный ресурс)
термический амплификаторBioRadMyiQ
мышь моноклональная анти-CENPAAbcamab13939
мышь моноклональная анти-Aurora BAbcamab3609

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
  3. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  4. Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
  5. Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
  6. Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
  7. Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
  8. Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
  9. Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
  10. Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
  11. Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
  12. Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
  13. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  14. Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
  15. Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
  16. Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
  17. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  18. Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
  19. Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
  20. Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
  21. Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
  22. Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
  23. Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217(2012).
  24. Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377(2013).
  25. Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
  26. Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).
  27. Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
  28. Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
  29. Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
  30. Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
  31. Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи