Method Article

Выявление Plasmodesmal локализации последовательностей белков в Planta

DOI:

10.3791/55301

⸱

August 15th, 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Завод межклеточных соединений, plasmodesmata (Pd), играют центральную роль в заводе физиологии и завод вирус взаимодействий. Важнейшее значение для Pd транспорта производится сортировка сигналы, которые направляют белки для Pd. Однако, наши знания об этих последовательностей все еще находится в зачаточном состоянии. Мы описываем стратегию для выявления локализации сигналы Pd Pd целевых белков.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmata (Pd) являются соединения к ячейке, которые функционируют как шлюзы, через которые перевозятся мелких и крупных молекул между растительных клеток. Pd транспорта малых молекул, ионов и воды, предположительно происходит пассивно, в то время как к ячейке транспорт биологических макромолекул, такие белки, наиболее вероятно происходит через активный механизм, который включает в себя конкретные определения сигналов на перевозимых молекулы. Нехватка выявленных plasmodesmata (Pd) локализация сигналов (PLSs) строго ограниченных понимание белка сортировка пути, участвующие в завод в ячейке макромолекулярных транспорта и связи. С обилием растений эндогенного и вирусные белки, известный трафик через Pd, только три PLSs поступили на сегодняшний день, все из них от эндогенных растительных белков. Таким образом, она имеет важное значение для разработки надежных и систематических экспериментальной стратегии для выявления функциональных PLS последовательности, что является необходимым и достаточным для Pd ориентации, непосредственно в живых растительных клеток. Здесь мы описываем одной такой стратегии, используя в качестве парадигмы к ячейке движение белка (МП) вирус мозаики табака (ПДЦ). Эти эксперименты, которые выявлены и охарактеризованы первый завод вирусный PLS, могут быть приспособлены для обнаружения последовательностей PLS в наиболее Pd целевых белков.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmodesmata (Pd) функционировать в качестве каналов для межклеточных транспорта ключевых регуляторов развития растений и морфогенеза, начиная от факторов транскрипции мРНК и малых молекул РНК. Кроме того этот макромолекулярных транспортного потенциала Pd используется большинство вирусов растений для их межклеточных распространения во время инфекции; для перемещения по Pd, вирусов растений развивались специализированные белки, называются движения белки (MPs), которые специально направлены Pd1,,2,3,4,5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. растительный материал

  1. Выбор растений
  2. Используйте видов растений, родной белка интерес, то есть, один, который кодирует этот белок для эндогенного белки или которое представляет естественный хост для патогенных вирусных белков. Кроме того выбранные растения должны поддаваться выбранного метода переходных генетической трансформации.
    Примечание: Исследования обычно используют Nicotiana benthamiana, который представляет собой хороший хозяин для ВТМ и эффективно трансформируется Agrobacterium опосредованной генетической трансформации техники, т.е., agroinfiltration (см. шаг 3). N. benthamiana растения также легк....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативных данных, которые добросовестно иллюстрируют результаты, ожидаемые от описанные протоколы и идентифицировать TMV MP PLS, взяты из Юань и др. 21. на рисунке 1A сначала кратко основные конструкции, выражая полнометражного TMV MP (1-268), ВТМ MP PLS (включая первые 50 аминокислотных остатков белка, 1-50), и его сканирование V4A производные аланина сливается с CFP (генерируется как описанные шаги 2.2, 5.2 и 6) тогда как .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол имеет четыре основных составляющих: концепция определения последовательности, которая является необходимым и достаточным для ориентации Pd, систематическое разделение протеина интереса на фрагменты, которые постепенно сокращается в длину, фьюзинг испытанные фрагменты autofluorescent белок, который служит как тег и высокомолекулярных груза и функционального анализа для Pd ориентации в жизни растений тканей после переходных выражение протестированных синтеза белков. Обратите внимание, что Agrobacterium опосре.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За неимением места мы упоминали главным образом обзор статей, и мы приносим извинения нашим коллегам, чьи оригинальные работы не упоминалась. Работа в лаборатории V.C. поддерживается грантов из низ, NSF, USDA/НИФА, Бард и ФСБ V.C., и S.G.L. Лаборатория поддерживается низ и средств от департаментов растений патологии и биологии растений-микробных S.G.L.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM)ZeissLSM5Любой CLSM с аналогичными возможностями является подходящим
программным обеспечением Zen для визуализации конфокального микроскопаZeissверсии 2009 годаПрограммное обеспечение должно быть совместимо с используемым
CLSM набором для сайт-направленного мутагенеза Quickchange II Agilent200523
АцетосирингонSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
Шприцы без иглBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomycin Сигма-ОлдричS4014
РифампицинСигма-ОлдричR3501
Ампициллин Сигма-ОлдричА0166

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasmodesmata LocalizationProtein Targeting SignalsAgrobacterium InfiltrationConfocal MicroscopyFluorescent Protein TaggingTobacco Mosaic VirusPlant Cell CommunicationMolecular TransportPlasmodesmata TargetingCell to Cell Transport

Related Articles