Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Краткое содержание

Этот протокол описывает воссоздание нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. В то же время, асимметрично посттрансляционно модифицированные нуклеосом могут быть получены после того, как с помощью premodified гистонов копии. Эти препараты могут быть легко использованы для изучения механизмов изменения перекрестных помех, одновременно на обеих сестринских гистонов, с помощью высокого разрешения ЯМР-спектроскопии.

Аннотация

Асимметрично модифицированные нуклеосомы содержат две копии гистонов (сестра гистонов), украшенные различными наборами посттрансляционных модификаций (PTMs). Они вновь выявленных видов с неизвестными средствами создания и функциональных последствий. Современные аналитические методы являются недостаточными для обнаружения копий конкретных появление PTMs на нуклеосомной сестра гистонов. Этот протокол представляет собой биохимический метод для восстановления в пробирке нуклеосом , содержащих дифференциально меченого изотопом сестра гистоны. Сформированный комплекс может быть также асимметрично изменен, после включения premodified гистонов бассейн во рефолдинга гистонов подкомплексах. Эти асимметричные нуклеосом препараты могут быть легко реагирует с гистонов модифицирующих ферментов для изучения механизмов Наводки модификации, налагаемых асимметрично предварительно включенного PTM с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В частности, реакции модификации вв режиме реального времени могут быть отображены независимо друг от друга на двух сестринских гистонов, выполняя различные типы корреляции ЯМР-экспериментов, адаптированной для соответствующего типа изотопов. Эта методика обеспечивает средства для изучения переходных помех механизмы, которые способствуют образованию и распространению асимметричных моделей PTM на нуклеосомных комплексов.

Введение

Эукариотической ДНК плотно упакована в ядрах клеток в хроматин. Фундаментальным строительным блоком хроматина является нуклеосомная ядро ​​частицы, которая содержит ~ 147 п.н. ДНК, обернутой вокруг октамерной комплекса, состоящего из двух экземплярах, каждый из четырех основных гистонов (Н3, Н4, H2A, H2B). Гистонов белки питают множество посттрансляционных модификаций (PTMs). Эти ковалентные замены вызывают изменения в структуре хроматина, как непосредственно влияет на физическую химию системы , так и косвенно за счет привлечения хроматина ремоделирования деятельности ^{1, 2, 3.}

Протокол

1. Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом (и асимметрично Modified) Сестра Гистоны

ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол описывает воссоздание нуклеосом с дифференцированно меченого изотопом гистона H3. С этой целью были использованы два бассейна гистона H3; один был ¹⁵ Н-меченых и содержал 6xHis-тег на N-конце , а второй был ¹³ С-меченого и содержал пептид Strep (WSHPQFEK) , слитый на N-концевом участке . Обе метки были отделены от нативной последовательности Н3 с сайтом распознавания протеазы табачный Etch Вирус (ТРВ). Для того, чтобы подготовить дополнительные асимметрично модифицированных нуклеосом,....

Результаты

Правильно подвергнутые рефолдингу октамерных виды изолированы после пробега восстанавливающей смеси через колонку для гель - фильтрации (рисунок 2). Реконструированный октамерных пул, содержащий три различных типа октамеры подвергают схеме аффинной очистки тандем. Пробы отбираются из всех этапов и анализировали с помощью SDS-PAGE и затем WB. Проверка правильного выполнения протокола , что приводит к выделению асимметричных видов достигается следующими наличие двух аффинн.......

Обсуждение

Для нуклеосомнои восстановления, текущий протокол использует шаблон ДНК длиной 165 пар оснований, содержащий 601-Видомом последовательность ²⁰ нуклеосома позиционирования, но аналогичные показатели , как ожидается , с использованием различных длин ДНК - матриц. Протокол был разработан и использован с использованием асимметричных типов гистона H3. При том же принципе, способ может быть применен также для других основных гистонов и дополнительно могут быть использованы для восстановления комплексов.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аппличем	Guanidinium HCl	A14199	Используйте высококачественный Gu-HCl
Tris	Roth	4855.2
DTT	Applichem	A1101
NaCl	VWR химикаты	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2H2PO4	Applichem	A1046
2PO4	Applichem	A3902
Имидазол	Апличем	A1073
d-дестиобиотин	Сигма	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen	1034557
Strep-tactin Superflow	IBA	2-1207-001
His-probe	антитело Santa Cruz	sc-8036
Strep-tactin конъюгированный HRP	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28-9893-35
6 - 8 кДа диализная мембрана	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
50 кДа диализная мембрана	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10 кДа центригугальный фильтр	Merck Millipore	UFC901024
30 кДа центригугальный фильтр единица	Merck Millipore	UFC903024
ЯМР-спектрометр в растворном состоянии			рабочей частоты не менее 500 МГц, оснащен тройным резонансным криозондом<
>Название буфера<	>Компонент
Разворачивающийся буфер	7 М гуанидиний HCl
	20 мМ Трис, pH 7,5
	10 мМ DTT
Рефолдный буфер	10 мМ Tris, pH 7,5
	2 M NaCl
	1 mM EDTA
	2 mM DTT
Буфер для анализа	25 mM Na2H2PO4, pH 6,8
	25 mM NaCl
	2 mM DTT

сильнымсильно