Методическая статья

Испарение снижающих культуры Состояние увеличивает Воспроизводимость многоклеточных сфероида образования в микротитрационных планшетах

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неравномерное потери среды от микротитровальных пластин влияет на воспроизводимость однородного многоклеточного образования опухоли сфероида. Улучшение условий культивирования, чтобы уменьшить значительную потерю среды улучшит воспроизводимости сфероида формирования и результаты анализов на основе сфероида с использованием жидкости наложения техники.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модели опухолей , которые близко имитируют в естественных условиях становятся все более популярными в новых лекарств и развития для скрининга потенциальных противоопухолевых препаратов. Многоклеточные опухолевые сфероиды (MCTSes) эффективно имитировать физиологические условия солидных опухолей, что делает их отличным в моделях пробирке для свинца оптимизации и целевой проверки. Из различных методов, доступных для MCTS культуры, жидкость-оверлей методом на агарозном является одним из самых недорогих способов генерации MCTS. Тем не менее, надежная передача МСТ культур с использованием жидкого-наложению для высокопроизводительного скрининга может быть поставлена ​​под угрозу ряд ограничений, в том числе покрытия микротитровальных пластин (ОББ) агарозой и невоспроизводимости равномерного формирования MCTS поперек скважин. Депутаты значительно склонны к краевыми эффектами, которые являются результатом чрезмерного испарения среды из наружной поверхности пластины, предотвращая использование всей пластины для лекарственного средстватесты. Эта рукопись содержит подробные технические усовершенствования жидкости наложения техники для повышения масштабируемости и воспроизводимости равномерного формирования MCTS. Кроме того, подробные сведения о простом, полуавтоматической и универсально применимой программный инструмент для оценки MCTS особенности после того, как лекарственная терапия представлена.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Раковые клетки в опухоли физиологически расположены в комплексе, 3-мерные (3D) структуры, окруженной внеклеточного матрикса и взаимодействующих клеток. Поскольку почти все клетки в тканях располагаются в 3D - среде, потребность в более физиологически актуальной в пробирке моделях опухолей , которые имитируют опухолевые черты привело к разработке нескольких 3D методов культивирования 1, 2, 3. Эти модели в настоящее время становятся фундаментальные инструменты исследования для изучения роли микроокружения опухоли на метастазирование и клеточной реакции на терапии в 3D 2. Кроме того, по сравнению с 2-мерных (2D) клеточных культур 4, 3D - модели позволяют лучше понять опухоли стромы взаимодействий, которые влияют на клеточные сигнальные пути.

Многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTSes) линий раковых клеток часто используются в 3D Cell CМодели ulture из - за их относительной близости к опухолям в естественных условиях. Из нескольких методов в использовании, жидкость-оверлей техника (LOT) генерации MCTS на агарозном пластинок , покрытых приобрел значительный интерес для оптимизации свинца и целевой проверки 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Это видно из последних исследований , которые были успешно в состоянии запустить пилотные экраны библиотек соединений в MCTS культур с использованием LOT 6, 7. Тем не менее, хорошо к скважине изменчивости в MCTS морфологии и роста за счет испарения, вызванной неравномерным потери среды являются обычными препятствиями, которые сопровождают LOT с использованием микротитрационных планшетов (ОББ). Следовательно, формирование неравномерной MCTSes ставит под угрозу значимость и актуальностьданных , полученных из фармакологической анализов 8, 12, 13. В дополнение к проблемам воспроизводимости, другая практическая проблема, которая затрагивает LOT, основанные на высокой пропускной способности анализов является покрытие из депутатов с агарозы при использовании автоматической жидкости раздаточного устройства. Несмотря на то, дозирующий узел может быть нагретый , чтобы предотвратить гелеобразование агарозы, засорение раздаточного кассеты и трубки является потенциальной проблемой для роботизированных систем 6.

Для преодоления некоторых из этих проблем, в последнее время мы разработали несколько модификаций в LOT для MCTS культуры 8. Эти изменения в основном базируются на возможных путях предотвращения неравномерного потери среды от депутатов с помощью инструментов, которые обычно встречаются в высокой пропускной способности скрининговых лабораторий. Детальная процедура модифицированного LOT для генерации одинакового размера и воспроизводимых MCTSes через 384-луночные планшеты (WPS) здесь представлена. Рукопись также представляет собой полуавтоматическую процедуру для оценки размера MCTS, особенно в частично разрушенными, обработанными наркотиками MCTSes, которые не имеют четко определенную границу для измерения площади поперечного сечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка пластин, покрытых агарозой

  1. Взвешивают 0,75 г легкоплавкой агарозе и добавить его к 100 мл среды 5А Маккоя (с или без фенола красного) без сыворотки. Раствор нагревают в микроволновой печи и вихрем через каждые 1-2 мин до полного растворения агарозы. Автоклава решение стерилизовать его.
  2. Охлаждают автоклавированы агарозы до приблизительно 70 ° С и фильтруют ее через 500 мл, 0,22 мкм сверху с помощью вакуумной фильтрации в коробке с ламинарным потоком воздуха. Алиготе 0,75% отфильтрованного раствора агарозы (ФАС) в меньших объемах, если не использовать весь раствор сразу. Храните готовый к использованию агарозном асептически раствор в холодном помещении или на 4 ° C холодильнике до 4 недель.
  3. Приложить маленькую трубку с пластически или металлическим наконечником раздаточного кассеты в дозатор реагента Combi и прайм кассеты с 70% -ным этанолом (EtOH), а затем стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS), в коробке потока.
  4. Перед использованием нагреть хранящуюся аликвоты ФАС я п микроволновое и расплавить. Премьер-раздаточный кассету с раствором агарозы и пальто 384-хорошо, тканевой культуры (ТС) -обработанной "специальный" микропланшет с 15 мкл ФАС. Дайте агарозы в пластине, чтобы охладиться в течение 15-20 мин перед посевом клеток. Храните пластины агарозном покрытием асептически, завернутым в полиэтиленовый пакет в холодном помещении или при температуре 4 ° С, вдали от прямых солнечных лучей.
    Примечание: Избегать повторного нагрева 0,75% FAS, чтобы предотвратить изменение концентрации агарозы в маточном растворе. Агарозы покрытием пластины можно хранить в течение до 2-х недель при хранении при указанных выше условиях. ФАС не требует нагревания во время нанесения покрытия пластин.
  5. Очистите дозирующий кассету наполнением это 70-80 ° C стерильной водой для удаления остатков агарозы в кассете наконечников и трубок.

2. Культура клеток и MCTS Формирование

  1. Культура клеток НСТ116 колоректальной карциномы человека, как это было описано ранеедеваха = "Xref"> 8.
  2. Удалить необходимое количество агарозы покрытием, 384-луночный, ТЦ обработанных микропланшетов из холодного хранения и уравновешивают их до комнатной температуры (КТ) в течение 15 мин.
  3. Подготовить дозатор реагента Combi для посева клеток с помощью грунтовки стандартной трубки раздаточного кассету с 70% этанола и стерильного PBS. Отрегулируйте громкость высева до требуемого мкл и скорость размена среды с помощью ручных кнопок настройки на раздаточном устройстве.
    Примечание: Весь процесс посева клеток проводят в стерильных условиях и в коробке с ламинарным потоком воздуха.
  4. Диссоциируют прилипшие клетки из колбы для культивирования тканей с использованием рекомбинантной клетки-диссоциации фермента. Делают суспензии клеток запас в стерильном стакане с семенных клеток при плотности 2,5 × 10 4 клеток / мл на лунку в объеме 50 мкл полной среды для роста. При посеве более одного 384-WP, размешать клетки с помощью магнитной мешалки, чтобы предотвратить их оседание на дно стакана.
  5. РазрешитьПланшеты на отдых в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировать в течение 15 мин при 4 х г.
  6. В то же время, возьмите экологическую крышку неиспаряемого восстанавливающих и залейте его 8 мл стерильного H 2 O или 5% диметилсульфоксид (ДМСО) в коротких сторон (слева и справа) с помощью 5 мл пипетки (Рис . 1А) Во-первых, обойтись 4 мл наполняющей жидкости в левой части желоба при развертке кончиком пипетки медленно вверх и вниз. Повторите этот шаг с правой стороны желоба.
    Примечание: Убедитесь в том, что жидкость добавили к боковым впадинами не сливается в центре крышки, и оставить зазор для газообмена (рисунок 1А). Добавление избыточного количества H 2 O результаты в просачивание H 2 O на внешней стороне крышки , а затем во внешние лунки 384-луночного ТС пластин.
  7. Заполните резервуар для жидкости в 384-луночного TC пластины с стерильной H 2 O и заменить обычные крышки пластины с жидким диэлектриком окружающей среды крышками (рис 2А).
  8. Место пластин в ротационном инкубаторе 37 ° С и относительной влажности 95%, 5% CO 2 и 20% O 2, и позволяют клеткам слипаются в MCTSes в течение 4 -х дней. Избегайте открывания двери инкубатора слишком долго в последующие дни, чтобы предотвратить уровень влажности от падения резко.

3. Средний Обмен с помощью системы Robotic

  1. На 4-й день с последующим образованием MCTS, добавьте 30 мкл подогретого среды на лунку с помощью автоматизированной микропланшетов дозатора. Дайте MCTSes расти еще в течение 3 дней. Замените среду регулярно каждые 3 дня, пока они не достигают желаемого размера для экспериментов.
  2. Аспирация определенного объема среды из каждой лунки, эмпирически регулировать г -высота стирально многообразия. Отберите 30 мкл среды на лунку и заменить его 30 мкл свежей, подогретого среды.
    Примечание: Установите скорость дозирования и скорость, с которой шайба коллектора проходит внизв лунки на самой низкой скорости, чтобы минимизировать турбулентность в скважинах.

4. высокого содержания Визуализация MCTS и полуавтоматический анализ изображений

  1. Изображение MCTS в автоматизированной системе формирования изображения высокого содержания с использованием объектива 4X воздуха (NA 16).
  2. Установите время экспозиции 11 мс и биннинга до 4 х 4. Регулировка количества и интервалов между г -stacks и пикселем биннинга в качестве желаемого для эксперимента , чтобы захватить весь MCTS на лунку.
  3. Процесс ступенчато изображения, как описано в "ридми", используя подпрограмму в доме, написанный на языке программирования.
    Примечание: Код .m и .txt README файлы доступны в качестве дополнительных файлов кода (Рисунок 1В). Рутинные измеряет площадь MCTS, большой и малой осей, периметр, и основательность от 2D-изображений.

figure-protocol-1
Рисунок 1:Подготовка экологических крышек и блок-схема алгоритма полуавтоматического рутины. (A) Изображение испарительную снижения экологической крышки , заполненной правильной (слева) и избыток (справа) количеством наполняющей жидкости ( в данном случае , 5% ДМСО). Стрелка указывает на короткой стороны желоба для добавления жидкости. Звездочка показывает разрыв в середине крышки после добавления правильного объема ДМСО. (B) Последовательность действий , показывающая этапы в полуавтоматическом рутинного анализа изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неравномерное потеря среды, особенно из периферийных скважин, является часто встречающийся вопрос в депутаты с небольшими объемами культуры. Значительно улучшенные условия культивирования, такие как инкубаторы с хорошо контролируемой температуры / систем увлажнения и испарения снижающих депутатов и крышек пластин, снизить значительные потери среды через 8 скважин. Для измерения относительного испарения, равные объемы Оранжевой G (OG) добавляли в каждую лунку, и из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Покрытие 384-TC Пластины с фильтрованной агарозном

Стандартной практикой в LOT является использование 1-1.5% низкой температурой плавления агарозы для покрытия пластин, что требует агарозы и / или дозирующее устройство Удержаться нагревают , чтобы предотвратить гелеобразование агарозы 6. Желирующий агарозы является потенциальной озабоченности при подготовке нескольких пластин с использованием жидких дозирующих кассеты с небольшими отверстиями насосно-компрессорных труб в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от чешского Министерства образования, молодежи и спорта (LO1304) и Технологического Агентства Чешской Республики (TE01020028). Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lakshman Варанаси для съемки неподвижных изображений с окружающей средой крышками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозныйSigma-AldrichA9414Легкоплавкий
McCOY's 5A MediumSigma-AldrichM8403
" быстрый» Фильтр FiltermaxTPP995050.22 μ m, 500 мл
Multidrop™ Дозатор реагентов Combi Thermo Fisher Scientific5840300
Маленькая трубка для дозирования кассеты Thermo Fisher Scientific24073295Металлический наконечник 
384-луночный планшет TC PerkinElmer6057308Тип планшета - CellCarrier
Стандартная кассета для дозирования пробирокThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Экологическая крышкаLabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
Роторный инкубатор (SteriStore)HighRes Biosolutions23641Серийный номер: D00384
Дозатор шайб для микропластин BioTekНеуказаннаямодель: EL406 
Система визуализации с высоким содержанием (CellVoyager)Yokogawa Electric CorporationНеуказаннаямодель: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™ Реагент экспресс-рекомбинантной диссоциации клетокThermo Fisher Scientific12604021фенол красный свободный

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  2. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening. Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).
  4. Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).
  5. Lao, Z., et al. Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA. PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).
  6. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).
  7. Li, Q., et al. 3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen. J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).
  8. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation. J. Biomol. Screen. , (2016).
  9. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).
  10. Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics. J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).
  11. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  12. Walzl, A., et al. A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity. Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).
  13. Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays. Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).
  14. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci. Rep. 6, 19103(2016).
  15. Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes. Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).
  16. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures. Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).
  17. Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically. J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи