Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрый Автоматизированный протокол для мышечного волокна Анализ населения в Rat Muscle разделов Креста с использованием тяжелой цепи миозина иммуногистохимии

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55441

⸱

28 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CD Laboratory for the Restoration of Extremity Function, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Medical University of Vienna, 2Core Facility Imaging, Core Facilities, Medical University Vienna, 3Department of Hand, Plastic and Reconstructive Surgery, Burn Center, BG Trauma Center Ludwigshafen, Plastic and Hand Surgery, University of Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол для быстрого мышечного волокна анализов, что позволяет улучшить качество окрашивания, и, таким образом, автоматическое получение и количественное определение популяций волокна с использованием свободно доступного программного обеспечения ImageJ.

Аннотация

Количественное популяций мышечных волокон обеспечивает более глубокое понимание последствий болезни, травмы, а также различных других воздействий на скелетные мышцы состава. Различные методы трудоемких традиционно использовались для изучения популяций волокна во многих областях исследований. Тем не менее, в последнее время разработаны иммуногистохимические методы, основанные на экспрессии белка тяжелой цепи миозина обеспечивает быструю альтернативу для идентификации различных типов волокна в одном разделе. Здесь мы представляем быстрый, надежный и воспроизводимый протокол для улучшения качества окрашивания, обеспечивая автоматическое приобретение целых сечений и автоматических количественное волокно популяций с ImageJ. Для этой цели, внедренные скелетные мышцы разрезают на поперечных срезах, окрашенных с помощью миозина тяжелых цепей антител с вторичными флуоресцентными антителами и DAPI для окрашивания ядер клеток. Целые сечения затем автоматически сканируются с помощью сканера слайдов для получения высокого разрешения композитафотографии всего образца. Анализ Fiber населения впоследствии выполняется для количественного определения медленных, промежуточных и быстрых волокон с использованием автоматизированной макрос для ImageJ. Ранее мы показали, что этот метод может идентифицировать популяции волокна надежно до степени ± 4%. Кроме того, этот метод уменьшает изменчивость и время на анализ значительно с помощью платформы с открытым кодом ImageJ между пользователем.

Введение

Скелетная состав мышц претерпевает глубокие изменения во время физиологических процессов , таких как старение 1, 2, 3 упражнения, 4, 5, 6, 7 или патофизиологических процессах , таких как болезнь 8, 9, 10 или 11 травмы. Таким образом, несколько полей исследований концентрата на структурные последствия этих процессов для понимания функциональных изменений. Одним из ключевых аспектов, определяющих функцию мышц является составом мышечных волокон. Мышечные волокна выражают различный тяжелую цепь миозина (МНС) белки и , таким образом , подразделяются на медленные, промежуточные или быстрые волокна 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Физиологически, мышцы имеют различные композиции мышечных волокон в зависимости от их функции в организме. Использование мышечных волокон ввода популяция волокна может быть количественно , чтобы определить адаптацию к физиологическим или патофизиологическим процессам 7, 17. Исторически сложилось, что целый ряд трудоемких методов были применены для различения между типами мышечных волокон. Для этого, мышечные волокна были классифицированы либо по реакционной способности миозина АТФазы при различных уровнях рН или активности мышц фермента. Поскольку различные качества волокон не могут быть оценены в одной секции, множественные поперечные сечения были необходимы для выявления всех мышечных волокон и позволяют ручной Количественное 14, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. В отличии от этого, последние публикации использовали иммуногистохимии (IHC) против тяжелой цепи миозина белка быстро окрасить несколько типов волокна в отдельных поперечных сечениях. Исходя из преимуществ этой процедуры, в настоящее время считается золотым стандартом в анализе мышечных волокон населения 19, 23, 24. Использование улучшенных протоколов окрашивания IHC, мы недавно были в состоянии показать, что полностью автоматическое получение цельных поперечных мышц секций и последующей автоматической количественной оценки мышечного волокна является возможным с использованием платформы с открытым исходным кодом ImageJ. По сравнению с ручным квантификации, наша процедура при условии , значительное снижение времени (примерно 10% от руководства анализа) , необходимого на слайд в то же время с точностью до ± 4% 25 .

Общая цель этого метода состоит в описании быстрый, надежный, независимый от пользователя руководство по автоматической квантификации мышечных волокон в мышцах крыс целых с помощью платформы с открытым кодом. Кроме того, мы опишем возможные модификации, которые позволили бы использовать его для других образцов, таких как мыши или человек мышцы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры , в том числе субъектов животных были проведены в соответствии с принципами лабораторного ухода за животными в соответствии с рекомендациями FELASA 26. Утверждение было получено до начала исследования по этическим комитетом Медицинского университета Вены и австрийского министерства по исследованиям и науке (BMWF: Bundesministerium FUER Wissenschaft унд Forschung, номер ссылки: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3б / 2014).

1. Мышцы Harvest

Примечание: В предыдущей публикации по Мэн и др. 27 доступна , описывающая правильное замораживание мышечных образцов в деталях.

  1. Получить целые мышцы или достаточную ткань , чтобы получить целые сечения сразу же после эвтаназии животных.
    1. Удалить все мышцы от наркоза или эвтаназии крыс. Удалить все соединительные ткани и сухожилия, окружающие мышцы с пинцетом и ножницами. Дляnesthesia или эвтаназии, следовать международным рекомендациям FELASA 28.
  2. Взвешивание мышцы с помощью калиброванного точного масштаба. Этот быстрый шаг позволяет проводить сравнительный анализ между образцами мышц, особенно после инвазивных процедур.
  3. Поместите мышцы в сосуд, наполненный полностью с соединением ОСТА, в зависимости от размера мышцы с запасом прочности примерно 1 мм до всех сторон (например, из алюминиевой фольги).
  4. Замораживание его в примерно 2 мин предварительно охлажденный изопентан с использованием жидкого азота. Изопентан должен начать показывать белые кристаллы на дне контейнера.
    Примечание: Этот шаг необходим для сохранения правильной архитектуры мышцы и тем самым позволяет правильно окрашивания и волокна анализа 27.
  5. Образцы Хранить сохраняется в ОСТ в течение по крайней мере 24 часов при -80 ° С. Образцы могут быть, однако, хранят при -80 ° С в течение нескольких месяцев или даже лет, если Corre ctly охлаждением.
  6. Вырезать 10 мкм поперечных срезов от средней части мышцы при -20 ° С, используя замораживающий микротом. Если сокращение на 10 мкм не представляется возможным, увеличение толщины с шагом 2 мкм до максимум 20 мкм. Достаточно острые режущие лезвия имеют важное значение для этого шага.
  7. Нанести секции к клеевым горкам, приближая слайды к сечениям. Сечения автоматически придерживаться клейких слайдов. Хранить слайды при -20 ° С в течение ночи перед окрашиванием.

2. Окрашивание

Примечание: Большое количество антител против тяжелой цепи миозина белок доступны; Однако, высокие антитела качества необходимы для автоматизированного сбора и анализа. Для разведения и ссылок на антитела приведены в Таблице 1. Для файла электронной таблицы для расчета правильных разведений и увидеть количество необходимых количеств раствора, смsource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental Файл 1.

  1. Оттепель и воздушно-сухой замороженные секции мышц в течение 10 мин до процедуры окрашивания.
  2. Промыть тщательно слайды с фосфатным буферным раствором (PBS) + 0,05% Triton X в течение 10 мин, а затем в течение 5 мин. Тритон было показано, значительно улучшить качество окрашивания. Смотрите обсуждение дальнейших подробностей.
  3. Пусть секции воздушно-сухой в течение 2 мин и контур отдельных поперечных сечений на каждом слайде, используя гидрофобную ручку (чтобы минимизировать необходимое количество антител) и позволяют дополнительной сушки в течение 15 мин.
  4. Блокировать все слайды с PBS + 0,05% Тритон Х (PBST), содержащей 10% сыворотки козьего в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Развести все первичные антитела (таблица 1) в коктейль из PBS + 0,05% Triton X (PBST) , содержащей 10% козьей сыворотки. Смешайте достаточно перед нанесением. Triton X имеет важное значение для равного окрашивания целых сечений. подсчитыватьприблизительно 30 мкл первичного антитела коктейля в поперечном сечении.
  6. Процедуру 2.7-2.13 обеспечить достаточную защиту от света. Затемнение огни комнаты и крытые лотки окрашивания обеспечивают адекватную защиту. Кроме того, окрашивающий заполнить лоток с жидкостью в нижней части, чтобы обеспечить влажную окружающую среду во время окрашивания и предотвращения высыхания.
  7. Применение первичных антител (Таблица 1) коктейлей к слайдам в течение 1 ч во влажном окрашивании лотка на комнатной температуре.
  8. Промыть слайды с PBS + 0,05% Triton X в течение 10 мин, а затем с новым PBST в течение 5 мин.
  9. Развести вторичными антителами в коктейле PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% козьей сыворотки. Вычислить 30 мкл первичного антитела коктейля в поперечном сечении.
  10. Применение вторичного коктейль антител к слайдам в течение 1 часа.
  11. Промыть слайды с PBS + 0,05% Тритон Х (PBST) в течение 10 мин и с новым PBST в течение еще 5 мин.
  12. Применение ядерного окрашивания DAPI комплект (предпочтительно для чтения в использовании решений) FoR 15 мин или в соответствии с инструкциями изготовителя для окрашивания ядер клеток.
  13. Промывочный кратко с PBS + 0,05% скользит Тритон Х (PBST) в течение 1 мин. После этого, пусть слайды воздушно-сухой кратко.
  14. Применение флуоресцентной монтажной среды и покровные. Хранить при 4 ° С в защищенном от света и выполнять визуализацию оптимально в течение 24-48 ч.

3. Микроскопия

  1. Загрузите слайды в сканер слайдов. Максимум 12 слайдов осуществим в зависимости от сканера слайдов.
  2. Начните новый проект. Для предварительного просмотра установите канал DAPI и объектив 2.5x. Для детального анализа используют DAPI, GFP, FITC и Cy5 каналы и цели 20X. Автофокус приобретается на протяжении всего проекта в канале DAPI.
  3. Используйте следующие цвета для каждого канала: DAPI -Голубого, FITC: зеленый, Texas Red: красный, Cy5: желтая.
  4. Создание превью каждого слайда с использованием канала DAPI. Для этой цели применяют ручную фокусировку на первом образце, и использовать его в течение предварительного просмотраанализ для получения предварительного просмотра изображения каждого образца.
  5. Схема каждого поперечного сечения, которые должны быть включены для детального процесса приобретения. Не рисуйте контуры близко к краям образца, чтобы обеспечить заголовок всей интересующей области.
  6. Установить время экспозиции для каждого канала. В большинстве случаев параметры экспозиции различных каналов одинаковы для всех поперечных сечений.
  7. Запуск автоматического захвата изображения. Проверьте правильность приобретения для первого поля зрения, чтобы предотвратить неправильное приобретение в начале автоматизированного процесса.
  8. При необходимости, установить дистанционное управление с помощью настольного зеркального отображения программного обеспечения. Это позволяет осуществлять удаленный мониторинг процесса получения изображений с помощью зеркального отображения на экране компьютера сканера слайдов к другому компьютеру через любую сеть или интернет-соединение. Хотя, никакие изменения не могут быть внесены в физической установки в отношении используемых слайдов, виртуальная среда программного обеспечения получения изображений позволяет осуществлять мониторинг Правильные фокус или экспозиция времен изображений. Кроме того, расчетное время завершения может регулярно проверять.
  9. После завершения получения изображения, контролировать правильную автофокусировку всех изображений с помощью ручного управления, если архитектура волокна, отдельные волокна и различные типов волокон различимы.
  10. Заново приобретают неправильно сосредоточены области изображения для отдельных полей зрения или целых областей, представляющих интерес. Для повторного захвата отдельных областей, отметьте области или изображения на протяжении всего проекта и выкупать участки с ручной фокусировкой. В большинстве случаев, дополнительные детали изображения на другом уровне фокусировки приводят к неправильно сфокусированным изображениям
  11. Для каждого поперечного сечения, которые должны быть включены в окончательном анализе, экспортировать каждый канал (за исключением DAPI) отдельно как Jpeg файлы. Имя и сортировка файлов по выставленным каналам в папках, имена Texas Red, FITC и Cy5.

4. Автоматический анализ волокна

палатка "> Примечание: Макрос может быть получен из следующей веб-странице: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. Предварительный просмотр каждого изображение с помощью обычного программного обеспечения для редактирования изображений до анализа и проверить наличие достаточного контраста между окрашенными волокнами и фоном. При необходимости, отрегулировать яркость и контрастность, чтобы увеличить разницу, используя команду яркости и контрастности.
  2. Открыть ImageJ или Фиджи. Откройте макрос с помощью команды «Плагины - Макросы - Edit.» Это показывает макросы исходного кода и позволяет быстро адаптации параметров. При необходимости измените каталог папки для каждого канала в исходном коде макроса.
    Примечание: Значения для анализа мышечных волокон основаны на двуглавый крыс и червеобразной мышц, других видах или мышцах могут потребовать различных значений.
  3. Используйте команду «Выполнить», чтобы запустить макрос. Все изображения папки теперь загружаются в макрос и количественно в последовательном порядке. Результаты шошп в новом окне. Этот шаг может занять от нескольких секунд до нескольких часов, в зависимости от количества анализируемых данных.
  4. Экспорт окна результатов в виде файла электронной таблицы. Определение значения положительно подсчитывались Cy5 (медленно), FITC (промежуточный) и Texas Red (быстрые) волокон и подытожить общее количество волокон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вся сечение крысы мышцы быстро окрашивала с использованием иммуногистохимии для выявления MHC I, IIA и IIB мышечных волокон. С помощью флуоресцентного микроскопа сканера слайдов, целые поперечные срезы затем автоматически приобретены для автоматизированного анализа мышечных волокон с ImageJ. Концепция процедуры основана на обеспечении простой, надежный и эффективный по времени рабочего процесса для количественного определения мышечных волокон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем общедоступное методологии для изучения и автоматически количественной оценки мышечных волокон популяции поперечных сечений крыс с помощью иммуногистохимии времени эффективно. Для воспроизводимости, мы приводим подробное пошаговое описание и возможных модификаций для применения в других видах, не описанных в данном исследовании. Кроме того, мы обсудим преимущество процедуры, предпосылки для оптимального функционирования и его ограничений.

В настоящее время ряд мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Фондом Христиан Доплер Research. Мы хотели бы поблагодарить Сабин Раушер из изображений Facility ядра в Медицинском университете Вены, Австрии за поддержку на протяжении всего проекта. Первичные антитела были разработаны Schiaffino, S., полученные от развивающего исследований гибридом Банк, созданный NICHD НИЗ и поддерживается в Университете штата Айова, биологический факультет, Айова-Сити, штат Айова.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
O.C.T соединениеTissue-Tek, Сакура, НидерландыДля встраивания мышечной ткани
Изопентандля адекватного замораживания мышечной ткани
Superfrost Ultra Plus слайдыThermo Scientific, Германия1014356190адгезивные слайды
фосфатно-солевой буфер 
Triton X-100Thermo Scientific, Германия85112Моющее средство для солюации
козьей сывороткиThermo Scientific, Германия50197ZКозья сыворотка
DAKO Флуоресцентная монтажная средаDako DenmarkS3023
Dako penDako DenmarkS200230-2
TissueFAXSi plusTissueGnostics, Вена, Австрия
Primary Антитела
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, США)Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, США)Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)Исследования развития Hybridoma Bank (DSHB, Айова, США)Supernatant
Secondary Антитела
Alexa  Фтор  633  Козий антимышиный IgG2b Thermo Scientific, ГерманияA-21146
Alexa Fluor 488 Козий антимышиный IgG1 ( &гамма; 1)Thermo Scientific, ГерманияA-21121
Alexa Fluor 555 Козий антимышиный IgM (и микроцепь)Thermo Scientific, ГерманияA-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes ReagentThermo Scientific, ГерманияR37606

Ссылки

  1. Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
  2. Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
  3. Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
  4. Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
  5. Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455(2014).
  6. Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
  7. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  8. Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908(2011).
  9. Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
  10. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
  11. Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
  12. Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
  13. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
  14. Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
  15. Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
  16. Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
  17. Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
  18. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  19. Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
  20. Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
  21. Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
  22. Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
  23. Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
  24. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273(2012).
  25. Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
  26. Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  27. Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586(2014).
  28. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  29. Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ImageJDAPI
Быстрый Автоматизированный протокол для мышечного волокна Анализ населения в Rat Muscle разделов Креста с использованием тяжелой цепи миозина иммуногистохимии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.