Неконтролируемое кровоизлияние, являющееся важной причиной смертности среди пациентов с травмой, можно смоделировать с использованием стандартного разрыва печени в мышиной модели. Эта модель приводит к постоянной кровопотере, выживаемости и позволяет тестировать гемостатические агенты. В этой статье представлен пошаговый процесс выполнения этой ценной модели.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Неконтролируемый геморрагический шок, моделируемый разрывом печени у мышей с контролем гемодинамики в реальном времени
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Неконтролируемое кровотечение является важной причиной предотвратимых смертей среди пациентов с травмой. Мы разработали мышиную модель неконтролируемого кровоизлияния через разрыв печени, что приводит к постоянной потере крови, гемодинамическим изменениям и выживанию.
Мышам подвергается стандартизированная резекция лево-средней доли печени. Им разрешено кровоточить без механического вмешательства. Гемостатические агенты можно вводить в качестве предварительной терапии или спасательной терапии в зависимости от интереса исследователя. Во время кровотечения проводится гемодинамический мониторинг в режиме реального времени через левую бедренную артериальную линию. Затем мышей умерщвляли, измеряли кровопотерю, собирали кровь для дальнейшего анализа, а органы собирали для анализа повреждений. Описана экспериментальная схема, позволяющая проводить одновременные испытания нескольких животных.
Геморрагия печени как модель неконтролируемого кровоизлияния существуетВ литературе, главным образом, в моделях крыс и свиней. Некоторые из этих моделей используют гемодинамический мониторинг или количественную оценку потери крови, но не имеют последовательности. Настоящая модель включает количественную оценку кровопотери, гемодинамический мониторинг в режиме реального времени в мышиной модели, которая дает преимущество использования трансгенных линий и механизма высокой пропускной способности для дальнейшего исследования патофизиологических механизмов при неконтролируемом кровотечении.
Введение
Травма является основной причиной смерти и инвалидности среди молодежи во всем мире. 1 Неконтролируемое кровоизлияние остается основной причиной смертности среди тяжело травмированных пациентов с травмой. 2 Управление пациентом с кровоточащей травмой двойное: контроль хирургического кровотечения, реанимация и замена потерянной крови.
Животные модели геморрагического шока были краеугольным камнем в исследовании травмы и могут быть использованы при оценке патофизиологии и лечения травматического / геморрагического шока. 3 , 4 Удар на животных моделях может быть достигнут в широком смысле двумя методами: контролируемое кровоизлияние и неконтролируемое кровоизлияние. 5 , 6 Контролируемое кровоизлияние выполняется путем удаления фиксированного объема крови или путем удаления крови для достижения определенного кровяного давления (фиксированного давления). В то времяСе модели полезны при оценке механизмов и иммунных изменений при геморрагическом шоке, они не применимы к тестированию гемостатических агентов и не имитируют клинический сценарий кровотечения после травмы. В этой степени мы стремились разработать модель неконтролируемого кровоизлияния, которая позволила бы нам проверять гемостатические изменения и прокоагулянты в мышиной модели. Печень является привлекательным вариантом для неконтролируемого кровоизлияния частично из-за двойного кровоснабжения печени и является одним из наиболее часто повреждаемых внутрибрюшных органов при тупой и проникающей травме. Учитывая высокую клиническую значимость, печень используется как модель неконтролируемого кровоизлияния, чаще всего в моделях крыс и свиней, но в последнее время и у приматов. 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 Мышиные модели также включают повреждение печени, такое как модель дробления или тупая травма; Однако эти модели не приводят к геморрагическому шоку, вторичному к повреждению печени. 13 , 14
Крысиные и свиные модели неконтролируемого кровоизлияния в печени, хотя они и ценны при изучении методов реанимации и гемодинамического мониторинга, менее выгодны, чем модели для мыши по различным причинам, таким как стоимость, количество используемых животных и, что важно, отсутствие трансгенных линий, доступных для анализа Специфической клеточной и молекулярной сигнализации. Нынешняя модель мыши имеет важное сходство с существующими моделями кровотечений в печени, включая стандартизованное разрывание печени, количественную оценку кровопотери, гемодинамический мониторинг и способность выполнять анализ выживаемости. Многие существующие модели включают только некоторые из этих аспектов, тогда как наша модель была разработана для измерения многих физиологических вариацийОдновременно и у нескольких мышей. Кроме того, разработка мышиной модели открывает двери для исследований за пределами реанимации и в механизмы большей патофизиологии при неконтролируемом кровотечении с потенциалом рентабельной и высокопроизводительной модели с использованием передовых молекулярных методов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мышей содержали в соответствии с Питтсбургским университетом (Питтсбург, Пенсильвания, США) и Национальными институтами здравоохранения (NIH, Bethesda, MD, USA) руководствами по уходу за животными в конкретных условиях без патогенов с 12-часовыми циклами светлого-темного цвета и свободным доступом к Стандартного корма и воды. Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Университете Питтсбурга.
1. Хирургическое поле и настройка прибора
- Перед процедурой стерилизуют все хирургические инструменты, шовный материал, марлю, аппликаторы на хлопчатобумажных кончиках, шланги и трубки.
- Стерилизовать хирургические инструменты, шовные, марлевые и аппликаторы с хлопковым наконечником в автоклаве. Стерилизовать соединительные трубки и трубки с этиленоксидом.
- Хирургическое поле
- Включите водяную циркуляционную грелку и установите температуру 37 ° C. Место хирургического вмешательстваСинюю подушку на ней сверху, а затем стерильную драпировку поверх хирургической синей подушки.
- Откройте все стерилизованные инструменты на стерильной драпировке. Используйте стерильные перчатки, чтобы избежать нарушения стерильности во время этого шага.
- Заполните чашу из нержавеющей стали 70% -ным этанолом и отложите в сторону. Это будет использоваться для очистки инструментов между животными.
- Включите микробарабанный стерилизатор и дайте ему нагреться до 150 ° C. Это также будет использоваться для очистки инструментов между животными. При проведении операции на более чем 5 мышах обязательно смените инструменты на новый стерильный набор.
- Настройка датчика
- Подключите стерильный преобразователь, трубку PE-50, две иглы 23G и мужскую рубашку luer и трехходовой запорный кран. 6
- Откалибруйте и обнулите преобразователь согласно инструкциям производителя.
2. Хирургическая процедура разрывания печени
- Индукция и позиционирование анестезии
- Вводите пентобарбитал натрия внутрибрюшинно в дозе 70 мг / кг. Анестезия должна вступить в силу между 5-10 мин; Оценить глубину анестезии пальцами ног. Если у мыши есть реакция на повышение пальцев стопы, требуется дополнительное время или анестезия. Если во время процедуры необходима дополнительная анестезия, добавьте пентобарбитал натрия. Не давать добавки в больших количествах, чем 0,05 мл для предотвращения передозировки.
- После того, как мышь полностью находится под анестезией, поместите мышь на спину на хирургический щит. Закрепите все четыре конечности мыши доски лентой.
- Брить бритвой бритвой и двухсторонними пахами.
- Замочите стерильную марлю бетадином и нанесите на живот и двусторонние пахи для хирургии. Для экспериментов по выживанию препарируйте брюшную полость и пахи бетадином, затем этанол, в общей сложности три подготовительных цикла.
- Вставьте ректальный датчик температуры, чтобы контролировать температуру ядра во время процедуры. Держите cТемпература руды между 35-37 ° C.
- Бедренная артерия и венозная канюляция
- Для установки венозного катетера: заполните трубку PE-10, иглу 30 G и трехсторонний кран с раствором Lactated Ringer из пакета IV.
- Для установки артериального катетера: заполните трубку PE-10 и иглу 30G гепаринизированным физиологическим раствором (разведение 1:10 гепарина 1000 U). Гепарин-солевой раствор необходим для предотвращения свертывания крови.
- Поместите мышь под рассекающий микроскоп.
- Сделайте 4-5 мм продольный разрез над паховой мышцей с помощью хирургических ножниц Iris. Используя пинцеты Дюмонта, захватите жировую ткань, связанную с мышцей приводящего мышцы, и потяните латерально для чистой экспозиции бедренной связки. Не рассекайте через жировую ткань, так как это приведет к сосудистому повреждению.
- Тщательно рассекайте нерв от артерии и вены с помощью щипцов Дюмонта. Есть жировая прокладка, прилегающая к нерву. Возьмите это с одним усилием Дюмона иD тянуть сбоку; Это оттягивает нерв от артерии, создавая плоскость для вскрытия. С помощью других силмона Дюмон прямо рассекает соединительную ткань между нервом и артерией.
- Не хватайте нерв во время этой части диссекции.
- Протяните три шовных шва 6-0 вокруг артерии и вены, проксимальной к бедрам профунды.
- Место шва 1 наиболее проксимально и оставить свободно.
- Место шва 2 наиболее дистально и связать сразу.
- Поместите шов 3 между шовными нитями 1 и 2 и оставьте свободным.
- Сделайте артериотом на вентральной поверхности сосуда. Рекомендуется использовать микрососудистые ножницы, чтобы артериотомия предотвращала перелом сосуда.
- Вставьте трехсторонний катетер в артерию. Сразу же завяжите шовные нити 1 и 2, чтобы зафиксировать катетер на месте.
- Подключите трехсторонний катетер к датчику и собрать исходные данные артериального давления.
- Повторите шаги 2.2.4 - 2.2.6 на противоположном пахе. Канюляция бедренной вены аналогична артерии. Выполните венотомию на вентральной поверхности сосуда с последующей установкой катетера. Этот катетер можно использовать для введения жидкости или лекарства.
- Разрыв печени
- Предварительно взвесьте пробирку, содержащую 0,5 мл PBS, три абсорбирующих треугольника и один весовой лоток на мышь.
- Сделайте разрез лапаротомии средней линии в брюшной полости, начиная с мечевидного отростка и продолжая каудально, чтобы полностью вывести печень.
- Вставьте один абсорбционный треугольник в живот против правой брюшной стенки. Повторите с левой стороны.
- Убедитесь, что абсорбционный треугольник удален от печени, чтобы избежать гемостатического эффекта упаковки после разрыва печени.
- Тщательно захватите левую среднюю долю печени и размойте 75% доли с помощью хирургических ножниц Iris. Место разрываD в трубке, содержащей PBS.
- Закройте брюшную стенку скобами с помощью аппликатора сшивателя. Возьмитесь за кожу и мышцы вместе и сжигайте скрепки. Делайте это как можно быстрее после ранения печени, чтобы избежать кровопотери за пределами живота. В экспериментах по выживанию живот закрывают в два слоя. Ходовой абсорбируемый шов для мышцы, за которым следует бегущий слой неабсорбируемого шовного материала для кожи, обеспечивает адекватное закрытие.
- Для мышей, которые в течение периодов времени выживания более 30 мин, бедренные катетеры должны быть удалены, артерия и вена связаны шовным материалом 3 с этапа 2.2.6. Затем двухсторонние пахи закрывают в два слоя, как описано на предыдущем этапе.
- После определенного времени, представляющего интерес для кровоизлияния (от 30 минут до 72 часов), удалите скрепки. Снимите абсорбционные треугольники и поместите их в соответствующие взвешенные до взвешивания лодки. Используйте дополнительные абсорбционные треугольники, чтобы впитать любую невпитываемую кровь.
- Взвешивающие фильтры для расчета общей потери крови.
- Послеоперационный уход
- Оставьте мышей, которые должны быть принесены в жертву в течение 30 минут на хирургическом пульте и под постоянным контролем и под полной анестезией до момента жертвоприношения. Мышей подвергают эвтаназии сочетанием сердечной пункции и передозировки вдыхаемого изофлурана.
- Место мышей, которые для более длительного времени выживания точек в клетке восстановления на вершине воды циркулирующих грелку. Постоянно следить за мышами во время выздоровления и не оставлять без присмотра, пока они не придут в сознание, чтобы сохранить туловище. Верните мышь в клетку с другими мышами только после восстановления после анестезии.
- Администрирование послеоперационной аналгезии с 0,1 мг / кг бупренэкса путем подкожной инъекции после пробуждения от анестезии и каждые 12 ч после до момента жертвования.
- Разрешить мышам свободный доступ к пище и воде после того, как они будут возвращены наПосле операции.
- Во время жертвоприношения для выживания мышей анестезия осуществляется с помощью ингаляционного изофлурана. После анестезии кровь собирается через сердечную пункцию правого сердца, кровоток регистрируется, как описано выше, и, наконец, эвтаназия застрахована передозировкой изофлюрана.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Модель разрыва печени приводит к воспроизводимой и последовательной потере крови у мышей. Рисунок 1А демонстрирует постоянный вес рваной печени, которая может быть получена со стандартным отклонением всего 0,02 г. Эта последовательность в раздираемом весе печени позволяет воспроизводить модель между мышами и в различных экспериментальных установках, таких как различные реанимационные протоколы. Кроме того, воспроизводимый вес рваной печени со стандартной ошибкой всего 0,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модель разрыва мышиной печени, описанная здесь, обеспечивает надежную, согласованную модель неконтролируемого кровоизлияния. Эта модель проста в исполнении, но есть важные шаги, которые требуют тщательного рассмотрения. Наиболее технически сложной частью модели является канюляция бедренных сосудов для гемодинамического мониторинга и введения жидкости / лекарств. Необходимо проявлять осторожность при вскрытии нерва и артериотомии / венотомии. Важно не касаться нерва во время вскрытия сосудов, чтобы избежать повреждения н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет финансовых конкурирующих интересов.
Благодарности
Работа этой рукописи была поддержана финансированием доктору Нилу экспериментальной проектной программы Института сосудистой медицины в области гемостаза и сосудистой биологии (P3HVB) и стипендий для научных исследований AST. Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения США грантов 1 R35 GM119526-01 и UM1HL120877-01.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| SS/45 dumonts | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| хирургические ножницы | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| гемостаты | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| микроножницы | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0,8 мм изогнутые щипцы | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| катушка для швов 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| шовный материал 4-0 шелк с иглой | Owens Minor | K188H | |
| марля 4 x 4 | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| ватный наконечник аппликатор | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| игла 30 G | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| игла | 23 Gможно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| шприц 10 куб. см | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| коническая трубка 50 куб. см | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| шприц 1 куб. см с иглой 25G Fisher | Scientific | 14-826-88 | |
| полиэтиленовая трубка 10 футов 100 футов (PE-10) | Fisher Scientific | 14-170-12P | |
| Полиэтиленовая трубка 50 100'(PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| 3-ходовой запорный кран | Fisher Scientific | NC9779127 | |
| хирургическая синяя прокладка | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Стерильные полевые повязки | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| рулоны ленты 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| прямые боковые банки с широким горлышком | VWR | 159000-058 | |
| лоток из нержавеющей стали 8" x 11" | VWR | 62687-049 | |
| мужской-мужской замок leur замок 3-сторонний | VWR | 20068-909 | |
| стерилизационный пакет 3" x 8" | VWR | 24008 | |
| стерилизационный пакет 5" x 10" | VWR | 24010 | |
| абсорбционные треугольники | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| 7 мм аппликатор для раневых зажимов | Fisher Scientific | E0522687 | |
| 1,000 7 мм 7 мм | Fisher Scientific | E0522687 | |
| бетадин (4 унции) | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| стерильные перчатки | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| eppendorfs | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| 1/2 куб. см инсулиновый шприц Lo-Dose | Fisher Scientific | 12-826-79 | |
| маленькая весовая лодка | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| лактатные звонари | можно приобрести у любого глобального поставщика | ||
| гепранизированный физиологический раствор (.1 & мкл л; геп + 9,9 & мкл ; NaCl) | можно приобрести у любого мирового поставщика | ||
| фосфатного буферного раствора | можно приобрести через любого мирового вендора | ||
| Пентобарбитал; | можно приобрести у любого мирового производителя | ||
| микроскоп Wild M650 со штанговой стойкой | Leica | ||
| Digi-Med BPA-400 анализатор и системный интегратор | Micro-Med | SYS-400 | |
| TXD-310 (Digi-Med Transducer) | Micro-Med | TXD-300 | |
| Компьютер | Dell | ||
| микрошариковый инструмент стерилизатор | VWR | 11156-002 | |
| Oster A5 ножницы с размером 40 лезвий | VWR | 10749-020 | |
| циркуляционная грелка 18 x 26 | Harvard | py872-5272 | |
| ректальный термометр | Kent Scientific | RET-3 |
Ссылки
- Chang, R., Cardenas, J. C., Wade, C. E., Holcomb, J. B. Advances in the understanding of trauma-induced coagulopathy. Blood. 128 (8), 1043-1049 (2016).
- Kutcher, M. E., et al. A paradigm shift in trauma resuscitation: evaluation of evolving massive transfusion practices. JAMA surgery. 148 (9), 834-840 (2013).
- Tsukamoto, T., Pape, H. C. Animal Models for Trauma Research. Shock. 31 (1), 3-10 (2009).
- Darwiche, S. S., et al. Pseudofracture: an acute peripheral tissue trauma model. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. -S., Ayala, A. Shock and Hemorrhage: an Overview of Animal Models. Shock. 24, Suppl 1. 33-39 (2005).
- Kohut, L. K., Darwiche, S. S., Brumfield, J. M., Frank, A. M., Billiar, T. R. Fixed volume or fixed pressure: a murine model of hemorrhagic shock. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuoka, T., Hildreth, J., Wisner, D. H. Liver injury as a model of uncontrolled hemorrhagic shock: resuscitation with different hypertonic regimens. J Trauma. 39 (4), 674-680 (1995).
- Komachi, T., et al. Adhesive and Robust Multilayered Poly(lactic acid) Nanosheets for Hemostatic Dressing in Liver Injury Model. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. , (2016).
- Orfanos, N. F., et al. The effects of antioxidants on a porcine model of liver hemorrhage. J Trauma Acute Care Surg. 80 (6), 964-971 (2016).
- Morgan, C. E., Prakash, V. S., Vercammen, J. M., Pritts, T., Kibbe, M. R. Development and validation of 4 different rat models of uncontrolled hemorrhage. JAMA Surgery. 150 (4), 316-324 (2015).
- Rosselli, D. D., Brainard, B. M., Schmiedt, C. W. Efficacy of a topical bovine-derived thrombin solution as a hemostatic agent in a rodent model of hepatic injury. Can J Vet Res. 14 (14), 303-308 (2015).
- Sheppard, F. R., et al. Development of a Nonhuman Primate (Rhesus Macaque) Model of Uncontrolled Traumatic Liver Hemorrhage. Shock. 44, 114-122 (2015).
- Nemzek-Hamlin, J. A., Hwang, H., Hampel, J. A., Yu, B., Raghavendran, K. Development of a murine model of blunt hepatic trauma. Comp Med. 63 (5), 398-408 (2013).
- Vogel, S., et al. Platelet-derived HMGB1 is a critical mediator of thrombosis. J Clin Invest. 125 (12), (2015).
- Modery-Pawlowski, C. L., Tian, L. L., Ravikumar, M., Wong, T. L., Sen Gupta, A. In vitro and in vivo hemostatic capabilities of a functionally integrated platelet-mimetic liposomal nanoconstruct. Biomaterials. 34 (12), 3031-3041 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
