Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов In Vitro

Краткое содержание

Мы представляем метод количественного метилирования ДНК на основе 5-methylcytosine (5-mC) дот-блоттинга. Мы определили уровни 5 мкС во время дедифференцировки хондроцитов. Этот простой метод может быть использован для быстрого определения фенотипа хондроцита при лечении ACI.

Аннотация

Дедифференцировка гиалиновых хондроцитов в фибробластные хондроциты часто сопровождает монослое экспансии хондроцитов in vitro . Глобальный уровень метилирования ДНК хондроцитов считается подходящим биомаркером для потери фенотипа хондроцита. Однако результаты, основанные на различных экспериментальных методах, могут быть непоследовательными. Поэтому важно установить точный, простой и быстрый метод количественного определения уровней глобального метилирования ДНК во время дедифференцировки хондроцитов.

Современные методы анализа метилирования по всему геному в значительной степени основаны на геномном секвенировании бисульфита. Из-за деградации ДНК во время конверсии бисульфита эти методы обычно требуют большого объема образца. Другие методы, используемые для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК, включают высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Однако ВЭЖХ требует полного переваривания геномной ДНК. Кроме того, непомерно высокая стоимость ВЭЖХ вИнструменты ограничивают широкое применение ВЭЖХ.

В этом исследовании геномную ДНК (гДНК) экстрагировали из человеческих хондроцитов, культивируемых с различным количеством пассажей. Уровень метилирования gDNA определяли с использованием специфического для метилирования теста дот-блоттинга. В этом методе дот-блоттинга смесь gDNA, содержащая метилированную ДНК, которая должна быть обнаружена, была обнаружена непосредственно на мембране N ⁺ в виде точки внутри ранее нарисованного кругового шаблона шаблона. По сравнению с другими методами блоттинга на основе гель-электрофореза и другими сложными методиками блоттинга метод дот-блоттинга экономит значительное время. Кроме того, дот-блоты могут обнаруживать общий уровень метилирования ДНК с использованием коммерчески доступного антитела с 5 мК. Мы обнаружили, что уровень метилирования ДНК различается между однослойными субкультурами и поэтому может играть ключевую роль в дедифференцировании хондроцитов. 5-МТ дот-блот является надежным, простым и быстрым методом для определения общего уровня метилирования ДНК для оценкиФенотип хондроцитов.

Введение

Аутологичная имплантация хондроцитов (ACI) - относительно новая, современная методика лечения дефектов суставного хряща ^{1 , 2} . Одним из важнейших этапов ACI является амплификация хондроцитов посредством монослойной культуры in vitro . Во время амплификации гиалиновые хондроциты легко теряют свой фенотип и становятся дедифференцированными, что нежелательно для лечения ACI ^{3 , 4} . Чтобы оптимизировать результаты лечения ACI, степень дедифференцировки хондроцитов должна быть определена перед реплантацией. Крайне важно установить экономичный и быстрый способ определения статуса хондроцитов. Недавно ассоциация между метилированием ДНК и дедифференцировкой хондроцитов привлекла большое внимание ^{4 , 5 , 6} . Метилирование ДНК - это процесс by whМетильные группы добавляют к ДНК, приводя к превращению остатков цитозина в 5-метилцитозин (5-mC).

Чтобы выяснить биологию метилирования ДНК в дедифференцировке хондроцитов, первым шагом является оценка уровня метилирования ДНК хондроцитов, который до сих пор оказался сложным. Бисульфитное геномное секвенирование является наиболее широко используемым методом анализа метилирования ДНК ^{7 , 8} . В этом анализе конверсия бисульфита вызывает деградацию ДНК, и поэтому для анализа необходимо предоставить значительное количество образца. Кроме того, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для количественной оценки уровней глобального метилирования ДНК ^{9 , 10} . Однако анализ ВЭЖХ требует переваривания геномной ДНК. Кроме того, необходимы передовые и дорогостоящие экспериментальные приборы. Поэтому, помимо высокой стоимости, эти экспериментальные процедуры являются временными минусамиели. Анти-5-mC-антитела стали коммерчески доступными, что создало возможность иммунного блоттинга геномной ДНК, содержащей 5 мкл, из сложных геномов.

В этом сообщении мы извлекли геномную ДНК из хондроцитов, выращенных в серии монослойных культур. Мы использовали дот-блот-анализ для оценки содержания 5 мК в человеческих хондроцитах с различным количеством проходов. Мы обнаружили, что содержание 5-мС увеличилось в сильнодедифференцированных хондроцитах по сравнению с хондроцитами с низкодифференцированной дедифференцировкой. Кроме того, мы установили связь между статусом дедифференцировки и уровнем 5 мкС. Наконец, мы сообщили, что изменения в содержании 5 мкС были связаны с фенотипом хондроцитов. Таким образом, 5-МЦ дот-блот-анализ является надежным, простым и быстрым методом для определения уровня метилирования ДНК в хондроцитах.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике человека Шэньчжэньской народной больницы.

1. Сбор ткани суставного хряща человека и культура хондроцитов

1. Подготовка материалов
   1. Подготовьте среду модифицированного орлиного носителя Дульбекко (DMEM), дополненную 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином. Готовят 1 мг / мл коллагеназы II, 0,25% трипсина-ЭДТА, фосфатно-солевой буфер (PBS) и клеточный фильтр (нейлон 40 мкм).
2. Сбор суставной хрящевой ткани человека
   1. Изолируйте суставной хрящ от коленных суставов донорских пациентов после травмы. Получите информированное согласие от всех участников.
   2. Наденьте хрящ на 1-2 мм ³ части с помощью стерильного скальпеля и переваривайте хондроциты из фарша хряща с 1 мг / мл коллагеназы II в DMEM при 37 ° C в течение 12-16 часов.
   3. Отфильтруйте полученный объектЛ суспензии через сито-ячейку (40 мкм) и дважды промывают PBS.
   4. Считайте клетки с гемоцитометром и семенами с плотностью 20 000-30 000 клеток / см ² в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином.
   5. Культура в инкубаторе при 37 ° C.
3. Однослойное расширение хондроцитов
   1. Урожай субконфлюэнтных клеток с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА и повторно пластины с плотностью 6 600 клеток / см ² . Меняйте среду два раза в неделю.
   2. Культура хондроцитов в монослоях на срок до шести пассажей и оценить на проходы 1, 2, 3, 4 и 5.

2. Извлечение геномной ДНК (gDNA)

1. Собирают клетки и ресуспендируют в 500 мкл буфера для лизиса (15 мМ Tris pH 8,0, 10 мМ EDTA с pH 8,0, 0,5% SDS, 200 мкг / мл РНКазы А) на 10 миллионов клеток. Ресуспендируют клетки пипетированием и быстрой инверсией, а затем инкубируют в течение 1 часа при 37 ° C.
2. Dd-протеиназой K в концентрации 160 мкг / мл клеточного лизата и энергично переворачивают смесь. Инкубируйте 6 часов при 55 ° C.
3. Добавьте к образцу один объем трис-насыщенного фенола Tris с pH 7,9: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). Встряхните или встряхните образец вручную в течение приблизительно 20 с.
4. Центрифуга образца при комнатной температуре в течение 5 мин при 13000 g. Удалите верхнюю водную фазу и перенесите слой на новую пробирку.
5. Экстрагируют равным объемом хлороформа для удаления фенола и переносят верхнюю водную фазу в свежую пробирку.
6. Осаждают ДНК добавлением 0,1 объема образца 3 М ацетата натрия pH 8,0 и 2 объемов 100% этанола.
7. Храните пробирку при -20 ° С на ночь для осаждения гДНК.
8. Центрифуга образца при 4 ° С в течение 10 мин при 16000 мкг на гранулу кДНК.
9. Промывают образец три раза с 70% этанола и центрифугируют при 4 ° С в течение 2 мин при 13000 х g.
10. Удалить супернатанT тщательно, а затем на воздухе. Ресуспендируют ДНК в 10 мМ Tris pH 8,0, 0,1 мМ EDTA.

3. Профилирование метилирования ДНК

1. Используйте набор для метилирования ДНК для проведения реакции конверсии бисульфита с использованием в общей сложности 500 нг геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Элюируйте в 10 мкл буфера для элюции (50 нг / мкл).
2. Профилирование метилирования ДНК с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя.

4. Точечный блот-анализ

1. Выделяют изолированную ДНК (1 мг на образец) в 0,1 М NaOH в течение 10 мин при 95 ° С. Нейтрализовать ДНК с 1 М NH ₄ OAc на льду, а затем развести в два раза. Пятно 2 мкл серийной разбавленной геномной ДНК на мембране N ⁺ .
2. Промокните мембрану при 80 ° С в течение 30 мин.
3. Блокировать сайты неспецифического связывания антител путем впитывания мембраны N ⁺ в 5% BSA в TBS-T в течение 1 часа. Используйте 10 см чашку Петри в качестве реакцииИонной камере при комнатной температуре.
4. После трехминутной промывки в TBST три раза инкубируйте мембрану с моноклональным антителом против 5-метилцитозина (5-mC) мыши (1: 1000) в TBS-T при 4 ° C в течение ночи.
5. Промывают мембрану в течение 5 мин три раза в TBS-T и затем инкубируют с вторичным антителом, HRP-конъюгированным овечьим иммуноглобулином-G (IgG) овец мыши (1: 5000) в TBS-T в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Промывают мембрану в течение 5 мин три раза в TBS-T.
7. Добавляют ферментный субстрат к мембране и инкубируют в течение 5-10 мин. Визуализируйте вторичный сигнал антитела, используя набор хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

Хондроциты культивировали в монослое до прохода 6 (Р6). Хондроциты показали прогрессивные фенотипические изменения с последовательными переходами монослойной культуры. Морфология хондроцитов P0 была круглой, тогда как клетки сильно сжались и сплющивались с последовательными переходами до Р6 ( рис. 1 ). Это морфологическое изменение характерно для процесса дедифференцировки хондроцитов. Между тем, результаты тепловой карты показали, что общий уровень метилирования CpG-сай...

Обсуждение

Дедифференцировка хондроцитов in vitro сильно компрометирует результаты ACI при лечении дефектов хрящевых дефектов ^{11 , 12} . Для оптимизации результатов ACI крайне важно избегать использования дедифференцированных хондроцитов ¹³ . Исследования показали, что общий уровень метилирования ДНК связан с степенью дедифференцировки хондроцитов ^{4 , 6} . Таким образом, крайне важно ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Reagents
DMEM	Gibco Inc.	11965– 092	Тепло в 37 градусов; C водяная баня перед применением
фосфатно-солевого буфера (PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, без Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0,25% трипсин/ЭДТА	Gibco Inc.	25200-056
1% пенициллин-стрептомицин	Gibco Inc.	15140-122
Хлороформ	Маллинкродт	4440
Изоамиловый спирт	Сигма	I-3643
Фенол	Gibco BRL	15513-039
Протеиназа K	Gibco BRL	24568-2
TAE буфер	Bio Whittaker	16-011V
Дистиллированная вода	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotoped Inc.
BSA	Proliant Inc.	68700
Коллагеназа, тип II	Sigma-Aldrich	C6885
[header]
Equipment
Гемоцитометр	ISOLAB Inc.	075.03.001
	Чашка Falcon 100 мм Центрифуга	Corning
Пробирки	TPP AG	91050	Гамма-стерилизованная
высокоскоростная центрифуга	Eppendorf	5804R
Термомиксер	MIULAB	MTH-100
Инкубатор для клеток углекислого газа	Thermo scientific	3111
Система химико-образного анализа	UVITEC Cambridge	ALLIANCE