Структурно-функциональные исследования в мышиных эмбриональных стволовых клеток Использование Рекомбиназа-опосредованного кассетный Обмен

Summary

Белки часто содержат несколько доменов, которые могут вызывать различные клеточные функции. Генные выбивки (KO) не считают это функциональное разнообразие. Здесь мы сообщаем о рекомбинации опосредованного обмена кассетного (RMCE) основа структурно-функциональный подходе в нокауте эмбриональных стволовых клеток, что позволяет для молекулярного рассечения различных функциональных доменов или вариантов белка.

Abstract

Генная инженерия в мышиных эмбрионов или эмбриональных стволовых клеток (mESCs) позволяет для изучения функции данного белка. Белки являются лошадками клетки и часто состоят из нескольких функциональных доменов, которые могут быть под влиянием посттрансляционных модификаций. Истощение всего белка в условном или конститутивном цепных из (KO) мышей не принимать во внимание это функциональное разнообразия и регулирование. Линии MESC и производная модель мыши, в котором стыковочный участок для FLPe рекомбинации опосредованного обмена кассеты (RMCE) был вставлен в ROSA26 (R26) локуса, ранее сообщались. Здесь мы сообщаем о структурно-функциональном подходе, который позволяет молекулярное рассечение различных функциональных многодоменного белка. С этой целью, RMCE-совместимыми мыши должны быть скрещены с мышами KO, а затем RMCE-совместимый mESCs KO должен быть изолирован. Далее, группа предполагаемых спасательных конструкций может быть введена в локус R26 через RMCE targetiнг. Спасательный кДНК-кандидатов может быть легко вставлен между RMCE участками ориентации вектора с использованием рекомбинации клонированию. Далее, KO mESCs трансфицируют с адресным переносчиком в сочетании с выражением рекомбиназы плазмиды FLPe. RMCE задействуется ген неомицин-сопротивления промотор-менее в док-сайтов ROSA26 и позволяет для выбора правильного события таргетинга. Таким образом, эффективность высокой таргетинга, близкие к 100%, получают, что позволяет для вставки множества предполагаемых спасательных конструкций в полу-высокой пропускной способности способом. Наконец, множество R26-управляемых спасательных конструктов могут быть проверены на предмет их способности, чтобы спасти фенотип, который наблюдался в родительских mESCs КО. Мы представляем структурно-функциональные исследования корректуры из-принципа в p120 катениной (p120ctn) KO mESCs с использованием энтодермы дифференциации эмбрионального телец (ЭТ) в качестве фенотипического считывания. Такой подход позволяет выявить важные области, предполагаемые пути вниз по течению, и болезни релевантной точкимутации, которые лежат в основе KO фенотипов для данного белка.

Introduction

Предполагается, что геномы млекопитающих содержат около 20000 белок-кодирующих генов. Альтернативный сплайсинг и посттрансляционные модификации дальнейшего увеличения белка репертуара. Белки имеют модульную конструкцию ¹ и часто содержат несколько доменов взаимодействия, которые позволяют их набор в различные белковых комплексы и их участие в многочисленных клеточных процессах ^2. Одним из примеров является многофункциональный белок под названием p120ctn. p120ctn кодируется геном Ctnnd1 и состоит из большого центрального домена армадилл повтора в окружении N-концевой области и С-концевой. Домен армадилла из p120....

Protocol

Были проведены все эксперименты на мышах по институциональным, национальным и европейским нормам животных.

1. Выделение RMCE-совместимых mESCs KO

1. Порода гетерозиготных мышей KO с RMCE-совместимых мышей, таких как ROSALUC мышей ¹⁰ или ROSA26-иПСК мышей ^21. Оба RMCE-совместимых мышей поддерживали на смешанном 129 / C57BL6 / Swiss фоне.
   Примечание: Пересечение с гетерозиготным мышеем KO рекомендуются преодолеть эмбриональную летальность у гомозиготного мышея KO.
2. С помощью ПЦР , чтобы выбрать гетерозиготных мышей KO , содержащих RMCE кассету в R26 локуса ^12.

Results

Процедура , чтобы изолировать RMCE-совместимой КО MESC линий изображена на рисунке 2. Два последовательных вязки должны получить RMCE-совместимый KO бластоцисты. Во-первых, гетерозиготные мыши KO скрещены с RMCE-совместимых мышей, чтобы получить RMCE-совместимый, гетерозиготных мышей KO. Эти мыши затем используются для синхронизированных скрещиваний с другим гетерозиготным мышеем KO, чтобы получить 3,5-DPC, RMCE-совместимого, гомозиготные бластоцисты KO. Вероятность полу.......

Discussion

Наш метод изоляции мЭСК является удобным и не требует особых навыков или оборудования, таких как микрохирургии бластоцисты. Таким образом, эта технология доступна для значительной части научного сообщества. Любой человек, имеющий базовый опыт культивирования клеток могут распространяться ICM наросты и установить mESCs линии. Тем не менее, промывочные и обработка бластоцисты требуют некоторой практики. Рот пипетка используется для передачи бластоцист и состоит из микропипетки, держатель микропипетки, насосно - компрессор.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Мыши	изготовленные в домашних условиях		замороженная сперма доступна по запросу
R26-iPSC мыши	изготовленные в домашних		замороженная сперма доступна по запросу
Сосудистый зонд	Fine Science Tools	10160-13	для проверки на копуляционные пробки
M2 средний	Sigma-Aldrich	M7167	делают аликвоты и хранят при -20 °°; C
Тонкие щипцы (Dumont #5 Standard tip Студенческие щипцы)	Fine Science Tools	11251-10	спрей с 70% EtOH перед использованием (не автоклавировать)
23 G иглы	Fineject	8697
шприцы 1-мл	Soft-ject	6680
60-мм бактериальные пластины (для промывки)	Gosselin	BB60-01
Ротовая пипетка	собственного производства		см. обсуждение
Эмбриональные фибробласты мышей (MEFs, TgN (DR4)1 штамм Jae)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae мыши	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) без кальция или магния	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J	JAX	3208	мыши, которые содержат четыре лекарственно-селективных гена и DR4 MEFS придает устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину и 6-тиогуанину
0,1% желатина	Sigma-Aldrich	G1393	Растворите 0,5 г в 500 мл дистиллированной воды, в автоклаве и храните при температуре 4°C.
Трипсин (0,25%)	Gibco	25200-056
2 μ M pluripotin	Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	общедоступный из коллекции BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
коллекция pRMCE-DV1	BCCM/LMBP	LMBP 08195	общедоступный из коллекции BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
термошок компетентный DH5&альфа; бактерии	изготовлен в собственном производстве
Gateway pDONR221 вектор	Thermo Fisher	12536-017	содержит ген устойчивости к канамицину
BP clonase II mix Thermo	Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Бульон Лурия (LB)
Ампициллин
Applied Biosystems 3730XL Анализатор ДНК	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Реагент для трансфекции Lipofectamine 2000 Реагент для трансфекции	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX Реагент для трансфекции	Thermo Fisher	15338100
Реагент	для трансфекции EffecteneQiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A вектор	Thermo Fisher	A10462	совместимая с рекомбинацией векторная
мышь моноклональное антитело против p120ctn антитела	BD Transduction Laboratories	610134
мыши моноклональное антитело против экадгерина	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment
Стерильные инструменты			тонких ножниц и щипцов для рассечения матки
Стерильные пипетки: 5 мл, 10 мл и 25 мл
15 мл и 50 мл конические центрифужные пробирки
культуральные планшеты V-образное дно и плоское дно)
Чашки для культур: 24 лунки, 12 лунок и 6 лунок
Многоканальные пипетки (до пипеток 30, 50, 100 и 200 мкм; L)
Стерильные многоканальные резервуары Доступ
к ламинарному потоку
Доступ к инкубатору при 37°С; C с 5% CO2
Доступ к инвертированному микроскопу
Доступ к настольной центрифуге
Доступ к стереомикроскопу с пропускаемым светом
Culture media
MEF Medium			хранящийся при 4 ° C; согреть 30 мин при 37 °°; C перед применением
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)	Gibco	41965-062
10% фетальная бычья сыворотка (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-глутамин (2 мМ)	Gibco	25030-024
Пируват натрия  (0,4 мМ)	Gibco	11360-039
пенициллин (100 ЕД/мл)	Gibco	15140-122
стрептомицин (100 &; g/mL)	Gibco	15140-122
Среда mESC на основе SR medium			storage at 4 ° C; согреть 30 мин при 37 °°; C перед применением
DMEM/F12	Gibco	31330-038	смешанный в соотношении 1
:1 15% нокаутирующая сыворотка для замещения (SR)	Gibco	10828– 028
L-глутамин (2 мМ)	Gibco	25030-024
0,1 мМ заменимых аминокислот	Gibco	11140-050
пенициллин (100 ЕД/мл)	Gibco	15140-122
стрептомицин (100 &; g/mL)	Gibco	15140-122
&бета;-меркаптоэтанол (0,1 мМ)	Сигма-Олдрич	М 3148
2 000 Ед/мл рекомбинантной мыши LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
среда mESC на основе FBS (аналогичная среде mESC на основе SR)			хранящаяся при 4° C; Тепло 30 мин при 37°С; C перед применением
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			хранящийся при 4 &� C; согреть 30 мин при 37 °°; C перед использованием
модифицированного Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium (1x) жидкость	Gibco	11279-023
2 мМ L-глутамин	Gibco	25030-024
0,4 мМ 1-тиоглицерин	Sigma-Aldrich	M-6145
50; г/мл аскорбиновой кислоты	Sigma-Aldrich	A-4544
пенициллин (100 ЕД/мл)	Gibco	15140-122
стрептомицин (100 &; g/mL)	Gibco	15140-122
2i
1 μ Ингибитор M Erk PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μ Ингибитор M Gsk3 CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386